祁紅英，王其傳，吳亞勝，趙政

（淮安柴米河農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，江蘇，223001）

叢枝菌根真菌 （Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）對(duì)植物具有廣泛的侵染性[1]，土壤中的AMF與植物根系緊密結(jié)合，并依賴(lài)寄主植物的光合產(chǎn)物維持自身的生長(zhǎng)和繁殖，同時(shí)以不同途徑影響植物的代謝過(guò)程[2]。AMF在與宿主植物形成菌根會(huì)影響植物根際土壤的微生態(tài)環(huán)境，使土壤礦物質(zhì)養(yǎng)分的存在形態(tài)及其化學(xué)有效性發(fā)生變化，進(jìn)而影響到植株根系對(duì)養(yǎng)分含量的吸收和植株的生長(zhǎng)。近年來(lái)，菌根效應(yīng)研究己從AMF對(duì)植物營(yíng)養(yǎng)的作用、對(duì)根系形態(tài)和代謝活性的影響、對(duì)植物生長(zhǎng)的促進(jìn)作用等方面向菌根對(duì)植物根際環(huán)境的作用和影響等方向拓展，并日益受到研究者的關(guān)注[3，4]。

本研究以番茄 （Lycopersicon esculentumMill.）品種蘇粉11號(hào)為材料，通過(guò)在有機(jī)基質(zhì)中添加叢枝菌根真菌，研究AMF對(duì)番茄幼苗生長(zhǎng)的影響，探討利用AMF增強(qiáng)有機(jī)基質(zhì)的使用效果，為提高有機(jī)基質(zhì)的應(yīng)用效果提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2017年3～7月在淮安柴米河農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司玻璃溫室內(nèi)進(jìn)行。供試番茄品種為蘇粉11號(hào)，由種子市場(chǎng)購(gòu)得；菌根產(chǎn)品由捷克Symbiom公司研究院提供；育苗基質(zhì)為蔬菜專(zhuān)用基質(zhì)，由淮安柴米河農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

苗期試驗(yàn)設(shè)2個(gè)處理，分別為基質(zhì)中不添加AMF的處理（CK）；基質(zhì)中添加AMF的處理（AMF）。

將叢枝菌根真菌菌劑（顆粒）與蔬菜育苗基質(zhì)混配裝到50孔穴盤(pán)，每盤(pán)50 g，每個(gè)處理裝3盤(pán)，完全隨機(jī)排列?；|(zhì)裝盤(pán)之前，穴盤(pán)用75%酒精擦洗消毒。

番茄種子用10%次氯酸鈉溶液表面消毒5～10 min，在55℃溫水中處理 15 min，然后在30℃的溫水中浸種8 h，之后置于28℃的恒溫箱中催芽，濕度80%，保持黑暗，直至發(fā)芽。待種子萌發(fā)，選取飽滿、發(fā)芽整齊一致的種子播種于裝有混配AMF基質(zhì)的50孔穴盤(pán)中。育苗期間各處理于晴天9：00，用噴壺裝清水均勻噴灑在育苗穴盤(pán)，以水剛從穴盤(pán)底部流出為宜。白天溫度控制在22～28℃，夜間16～18℃，光合有效輻射（PPFD）為 400～800 μmol·m-2·s-1，相對(duì)濕度維持在60%～70%。待幼苗生長(zhǎng)至30 d，測(cè)定生長(zhǎng)指標(biāo)、侵染率、根際酶活和微生物數(shù)量等指標(biāo)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

①形態(tài)指標(biāo)和干物質(zhì) 株高：用直尺測(cè)定子葉節(jié)到生長(zhǎng)點(diǎn)的高度（單位：cm）；莖粗：用游標(biāo)卡尺測(cè)量與子葉展開(kāi)方向平行的子葉節(jié)或子葉節(jié)下0.5 cm處的粗度（單位：mm）；植株用自來(lái)水洗凈后用吸水紙擦干，分為地上部分和地下部分，測(cè)量鮮質(zhì)量（單位：g）；植株地上部分和地下部分置于烘箱中，105℃，殺青15 min，待溫度降至75℃以下，烘干至恒重，測(cè)量干質(zhì)量（單位：g）。

②菌根侵染率 每個(gè)處理需選取20條根段（減小因根樣差異而造成的誤差）；將根樣經(jīng)20%KOH透明、酸化（5%醋酸）后，用5%醋酸墨水染色液（派克純黑書(shū)寫(xiě)墨水Quink）染色，清水浸泡脫色后即可鏡檢。叢枝結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)，并能分辨AMF與其他未知真菌[5]。

根據(jù)根段侵染數(shù)量或程度分為0，10%，20%，30%，100%幾種侵染等級(jí)，依下列公式計(jì)算該樣品菌根侵染率。

侵染率（%）=∑（0%×根段數(shù)+10%×根段數(shù)+20%×根段數(shù)+30%×根段數(shù)+100%×根段數(shù)）/觀察總根段數(shù)[6]。

③微生物數(shù)量 微生物數(shù)量采用稀釋涂布平板法測(cè)定[7]。用千分之一的分析天平稱(chēng)取10 g基質(zhì)加入盛有90 mL無(wú)菌水的三角瓶中，振蕩10 min，使基質(zhì)均勻分布在溶液中，成為基質(zhì)懸浮液；吸取1 mL基質(zhì)懸浮液于9 mL無(wú)菌水中振蕩使稀釋均勻，稀釋成10-7～10-2濃度梯度的菌懸液。根據(jù)各類(lèi)微生物在基質(zhì)中數(shù)量多少選擇適當(dāng)濃度進(jìn)行分離接種。本試驗(yàn)真菌采用10-3濃度，放線菌采用10-5濃度，細(xì)菌采用10-5濃度，各設(shè)3次重復(fù)。細(xì)菌菌落數(shù)用牛肉蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)法測(cè)定；真菌菌落數(shù)用馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)法測(cè)定；放線菌菌落數(shù)用高氏1號(hào)瓊脂培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)法測(cè)定[8]。

真菌、細(xì)菌和放線菌計(jì)數(shù)：每1 g基質(zhì)中菌落數(shù)量=同一稀釋度3次重復(fù)的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)÷每10 g基質(zhì)的干質(zhì)量。

④根際酶活 過(guò)氧化氫酶活性采用高錳酸鉀滴定法：取5 g根系基質(zhì)，40 mL蒸餾水，5 mL 0.3 mol/L H2O2，37℃，20 min，5 mL 1.5 mol/L 硫酸溶液終止反應(yīng)，過(guò)濾，取15 mL濾液，用0.1 mol/L高錳酸鉀溶液滴定。

脲酶活性用苯酚鈉比色法：5 g根系基質(zhì)，加1 mL甲苯，加10 mL 10%尿素，20 mL pH值6.7檸檬酸鹽緩沖液，過(guò)濾，取3 mL濾液，加4 mL苯酚鈉溶液，3 mL 0.3%次氯酸鈉溶液，定容到40 mL，顯色20 min后于578 nm比色。

磷酸酶活性用磷酸苯二鈉比色法測(cè)定：稱(chēng)取5 g根系基質(zhì)，加入1 mL甲苯，15 min后加入20 mL的磷酸苯二鈉（中性的檸檬酸緩沖液），37℃，24 h，蒸餾水定容到40 mL，過(guò)濾，取0.5 mL濾液，加入5 mL pH值9.0硼酸緩沖液，再加入3 mL 2.5%的鐵氰化鉀和3 mL 0.5 mol·L-1的4-氨基安替吡啉溶液，搖勻，蒸餾水定容到40 mL，穩(wěn)定15 min，于570 nm比色。

蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定：稱(chēng)取5 g基質(zhì)，置于 50 mL三角瓶中，注入15 mL 8%蔗糖溶液，5 mL pH值5.5磷酸緩沖液和5滴甲苯。搖勻混合物后，放入恒溫箱，在37℃下培養(yǎng)24 h。到時(shí)取出，迅速過(guò)濾。從中吸取濾液1 mL，注入小試管中，加3 mL DNS試劑，在沸騰的水浴鍋中加熱5 min，隨即將試管移至自來(lái)水流下冷卻3 min。溶液因生成3-氨基-5-硝基水楊酸而呈橙黃色，最后將試管內(nèi)液體轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，并用蒸餾水定容稀釋至50 mL。用分光光度計(jì)于508 nm處進(jìn)行比色[9]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Office 2010統(tǒng)計(jì)，采用SPSS 20.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行 Duncan's多重比較（P＜0.05），采用Originpro進(jìn)行作圖。

表1 叢枝菌根真菌對(duì)番茄幼苗生長(zhǎng)和菌根侵染率的影響

2 結(jié)果與分析

2.1 叢枝菌根真菌對(duì)番茄幼苗生長(zhǎng)和菌根侵染率的影響

由表1可知，基質(zhì)中添加AMF，番茄幼苗的葉片數(shù)、地上部干質(zhì)量和地下部干質(zhì)量沒(méi)有受到明顯影響，但其株高、莖粗、地上部鮮質(zhì)量和地下部鮮質(zhì)量均得到顯著提高，提高幅度分別為 37.97% 、13.26% 、43.35% 和100.9%；而且，基質(zhì)中添加AMF能夠顯著提高番茄幼苗的菌根侵染率?？梢?jiàn)，基質(zhì)中添加AMF可明顯促進(jìn)番茄幼苗的生長(zhǎng)，顯著提高幼苗的菌根侵染率。

2.2 叢枝菌根真菌對(duì)番茄幼苗根際微生物數(shù)量的影響

由圖1可知，在混配基質(zhì)中添加AMF，與對(duì)照相比較，番茄幼苗根際細(xì)菌數(shù)量、放線菌數(shù)量和細(xì)菌/真菌比值均顯著提高，真菌數(shù)量顯著下降。結(jié)果表明，基質(zhì)中添加AMF能夠有效地提高番茄根際細(xì)菌數(shù)量和放線菌數(shù)量，降低真菌的數(shù)量，從而增加細(xì)菌/真菌比值。

圖1 叢枝菌根真菌對(duì)番茄幼苗根際微生物數(shù)量的影響

2.3 叢枝菌根真菌對(duì)番茄幼苗根際酶活性的影響

如圖2所示，在混配基質(zhì)中添加AMF，與對(duì)照相比較，番茄幼苗根際過(guò)氧化氫酶活性沒(méi)有明顯影響，但蔗糖酶活性、中性磷酸酶活性和脲酶活性都有顯著的提高。結(jié)果表明，混配基質(zhì)中添加AMF可顯著改善番茄幼苗根際酶活性有利于有機(jī)質(zhì)的轉(zhuǎn)化，促進(jìn)番茄幼苗的生長(zhǎng)。

圖2 叢枝菌根真菌對(duì)番茄幼苗根際酶活性的影響

3 討論與結(jié)論

接種AMF對(duì)植物的生長(zhǎng)均有同程度的促進(jìn)作用，在植物的株高、干物質(zhì)質(zhì)重、葉面積等方面均有一定的體現(xiàn)[10]。本研究表明，通過(guò)在基質(zhì)中添加AMF，能夠顯著促進(jìn)番茄幼苗的生長(zhǎng)，提高番茄幼苗的菌根侵染率，說(shuō)明基質(zhì)中添加AMF能夠顯著提高基質(zhì)的使用效果。

大多數(shù)的土壤微生物是有利于作物的生長(zhǎng)發(fā)育，參與土壤中氧化、氨化、固氮和硝化等生化過(guò)程。細(xì)菌在根際生態(tài)系統(tǒng)中占據(jù)著重要地位，因?yàn)榫母呱砘钚?，所以菌根和非菌根根際的細(xì)菌種群和數(shù)量將會(huì)不同。潘超美等[11]研究結(jié)果表明，接種菌根真菌使得玉米的根際土壤的細(xì)菌和放線菌數(shù)量明顯增多，真菌數(shù)量則減少。本研究結(jié)果顯示，在混配基質(zhì)中添加AMF，促使基質(zhì)中微生物區(qū)系從低肥力的“真菌型”向高肥力的“細(xì)菌型”轉(zhuǎn)化，提高基質(zhì)中微生物的活力水平，有助于促進(jìn)番茄幼苗對(duì)有效養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化和吸收。

根際酶是具有催化活性的蛋白質(zhì)，反映了介質(zhì)中養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化能力以及介質(zhì)中生物活性的大小，參與介質(zhì)中各種代謝過(guò)程和能量轉(zhuǎn)化，被認(rèn)為是重要的土壤介質(zhì)性質(zhì)和生態(tài)穩(wěn)定的指示劑[12，13]。鄭舜怡等[14]向基質(zhì)中添加AMF，顯著提高了辣椒植株根際酶活性。研究結(jié)果顯示，單獨(dú)添加AMF，根際基質(zhì)中蔗糖酶活性、磷酸酶活性和脲酶活性顯著升高，說(shuō)明AMF能夠促進(jìn)基質(zhì)中有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化，提高含氮有機(jī)物以及磷化合物水解速率，這與前人在土壤接種AMF的研究結(jié)果一致[15]。

綜上所述，基質(zhì)中添加AMF能顯著提高番茄幼苗根際微生物數(shù)量，促使番茄幼苗根際微生物區(qū)系從“真菌型”向“細(xì)菌型”轉(zhuǎn)化，提高根際微生物多樣性；還能提高根際酶活性，有利于有機(jī)質(zhì)的轉(zhuǎn)化，維持植株根際生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性；而且添加AMF還可以提高幼苗的菌根侵染率，從而促進(jìn)番茄幼苗的生長(zhǎng)。

[1]Serrano P R,Gaxiola R.Microbial models and salt stress tolerance in plants[J].Critical Reviews in Plant Sciences,1994,13:121-138.

[2]Smith S E,Read D J.Mycorrhizal Symbiosis(Second Edition)[M].Manhattan:Academic Press,1997.

[3]廖繼佩，林先貴，曹志洪，等.叢枝菌根真菌與重金屬的相互作用對(duì)玉米根際微生物數(shù)量和磷酸酶活性的影響[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2002（8）：407-413.

[4]蔡曉布，馮固，錢(qián)成，等.叢枝菌根真菌對(duì)西藏高原草地植物和土壤環(huán)境的影響[J].土壤學(xué)報(bào)，2007，44：63-72.

[5]楊亞寧，巴雷，白曉楠，等.一種改進(jìn)的叢枝菌根染色方法[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2010（30）：774-779.

[6]Biermann B,Linderman R G.Quantifying verculararbuscular mycorrhizas: Aproposed method towards standardization[J].New Phytol,1981,87:63-67.

[7]胡開(kāi)輝.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京：中國(guó)林業(yè)出版社，2004.

[8]Wei L I,Cheng Z H,Meng H W,et al.Effect of rotating different vegetables on micro-biomass and enzyme in tomato continuous cropped substrate and afterculture tomato under plastic tunnel cultivation [J].Acta Horticulturae Sinica,2012(1):72-80.

[9]吳金水.土壤微生物生物量測(cè)定方法及其應(yīng)用[M].北京：氣象出版社，2006.

[10]王倡憲，郝志鵬.叢枝菌根真菌對(duì)黃瓜枯萎病的影響[J].菌物學(xué)報(bào)，2008，27：395-404.

[11]潘超美，郭慶榮，邱橋姐，等.VA菌根真菌對(duì)玉米生長(zhǎng)及根際土壤微生態(tài)環(huán)境的影響[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)，2000（9）：304-306.

[12]Stege P W,Messina G A,Bianchi G,et al.Determination of arylsulphatase and phosphatase enzyme activities in soil using screen-printed electrodes modified with multiwalled carbon nanotubes[J].Soil Biology and Biochemistry,2010,41:24 44-2 452.

[13]Tian L,Dell E,Shi W.Chemical composition of dissolved organic matter in agroecosystems:correlations with soil enzyme activity and carbon and nitrogen mineralization[J].Applied Soil Ecology,2010,46:426-435.

[14]鄭舜怡，郭世榮，張鈺，等.叢枝菌根真菌對(duì)辣椒光合特性及根際微生物多樣性和酶活性的影響[J].西北植物學(xué)報(bào)，2014，34：800-809.

[15]黃嘯.堆肥對(duì)黃瓜枯萎病抑制效果及其機(jī)理研究[M].杭州：浙江大學(xué)，2010.