向晶　陳海君　施軍平

[摘要] 目的 探討Toll樣受體4（TLR4）、髓樣分化因子88（MyD88）在高脂高糖飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）大鼠肝組織中的表達(dá)及其意義。 方法 選取SD大鼠20只，隨機(jī)分為兩組，模型組SD大鼠給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)，正常組給予普通飼料喂養(yǎng)，10周末分別進(jìn)行如下檢測(cè)：①計(jì)算肝指數(shù)；②HE染色，光鏡下觀察各組大鼠肝組織的病理改變；③應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)大鼠肝組織TLR4、MyD88 mRNA的表達(dá)。 結(jié)果 模型組的肝指數(shù)較正常組明顯增加（P<0.01）；模型組的NAFLD活動(dòng)度計(jì)分與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；模型組大鼠肝組織TLR4和MyD88的mRNA表達(dá)水平與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。 結(jié)論 持續(xù)10周的高脂高糖飲食喂養(yǎng)可以誘導(dǎo)NAFLD大鼠模型，模型組大鼠肝組織TLR4 mRNA和MyD88 mRNA表達(dá)升高，在肝細(xì)胞炎癥改變中起重要作用。

[關(guān)鍵詞] 非酒精性脂肪肝；大鼠；Toll樣受體4；髓樣分化因子88

[中圖分類號(hào)] R575.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2016）30-0024-05

近年來非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的發(fā)病率逐漸升高，且呈年輕化趨勢(shì)。胡衛(wèi)等[1]對(duì)武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院教職工體檢的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD總患病率達(dá)到20.7%，其具體發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，但大量研究表明胰島素抵抗、炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)代謝異常在該病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[2]。目前研究表明，Toll樣受體（Toll like receptor，TLR）與感染信號(hào)的識(shí)別及轉(zhuǎn)導(dǎo)和機(jī)體的損傷密切相關(guān)，將感染和炎癥、組織損傷聯(lián)系起來[3]。Toll樣受體4（Toll like receptor 4，TLR4）是內(nèi)毒素識(shí)別受體，目前已知TLR4介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)包括髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依賴性和非依賴性途徑。MyD88依賴性途徑主要介導(dǎo)核因子-κB（nuclear fator-κB，NF-κB）活化、細(xì)胞因子的產(chǎn)生[4]。本文通過研究TLR4、MyD88在高脂高糖飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）大鼠肝組織中的表達(dá)，旨在探討TLR4、MyD88在NASH炎癥反應(yīng)中的作用。

1 材料與方法

1.1 非酒精性脂肪性肝炎動(dòng)物模型的建立

健康雄性Spraque-Dawley大鼠20只，體重180～225 g，清潔級(jí)，購(gòu)買于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[許可證號(hào)：SCXK（滬） 2008-0016]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。20只SD大鼠隨機(jī)分為正常組（予普通飼料喂養(yǎng)）10只及模型組10只（予以高脂高糖飼料喂養(yǎng)）；于第10周處死正常組10只大鼠及模型組10只大鼠，HE染色，光鏡下觀察正常組和模型組大鼠肝組織的病理改變，以證實(shí)大鼠非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）模型成功建立。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每籠5只，分籠飼養(yǎng)，均自由飲水和進(jìn)食，（20±2）℃明暗各12 h，均連續(xù)10周。

1.2 標(biāo)本采集

第10周末當(dāng)晚兩組大鼠禁食不禁水，次日晨空腹腹腔注射麻醉，心臟采血用于測(cè)定生化指標(biāo)和細(xì)胞因子；分離整個(gè)肝臟稱重，在肝右葉切取數(shù)塊肝組織，裝入凍存管，投入液氮中保存，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后移入-80℃冰箱中保存，用于提取總RNA，以檢測(cè)肝組織中TLR4、MyD88的mRNA表達(dá)。

1.3 病理組織學(xué)檢查

常規(guī)HE染色，光鏡下觀察大鼠肝細(xì)胞脂肪變性程度、氣球樣變性、小葉內(nèi)炎癥程度以評(píng)定NAFLD活動(dòng)度計(jì)分（NAFLD activity score，NAS），脂肪肝病理組織學(xué)診斷參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝臟病學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組“非酒精性脂肪肝診斷標(biāo)準(zhǔn)”[5]。根據(jù)肝小葉內(nèi)脂肪變的肝細(xì)胞數(shù)將脂變程度量化：0分（肝小葉內(nèi)<5%肝細(xì)胞脂肪變）、1分（肝小葉內(nèi)5%～33%肝細(xì)胞脂肪變）、2分（肝小葉內(nèi)34%～66%肝細(xì)胞脂肪變）、3分（肝小葉內(nèi)>66%肝細(xì)胞脂肪變）。肝小葉內(nèi)炎癥（20倍鏡計(jì)數(shù)壞死灶）計(jì)分：0分（無壞死灶）、1分（<2個(gè)壞死灶）、2分（2～4個(gè)壞死灶）、3分（>4個(gè)壞死灶）。肝細(xì)胞氣球樣變程度計(jì)分：0分（無氣球樣變）、1分（少見氣球樣變）、2分（多見氣球樣變）。NAFLD活動(dòng)度計(jì)分（NAFLD activity score，NAS）為肝細(xì)胞脂肪變+小葉內(nèi)炎癥+肝細(xì)胞氣球樣變，NAS小于3分則不考慮NASH，NAS大于4分則可診斷NASH，介于兩者之間為NASH可能。

1.4 RT-PCR檢測(cè)TLR4、MyD88 mRNA在NASH大鼠肝組織中的表達(dá)

1.4.1 總RNA提取 從超低溫冰箱中取出冰凍的組織，約為100 mg，迅速轉(zhuǎn)移至用液氮預(yù)冷的研缽中，用研杵研磨組織，直至研磨成粉末狀，向研缽中加入2 mL RNAiso Plus，完全覆蓋研磨成粉末狀的樣品，靜置室溫中，待樣品完全融化，再用研杵研磨至裂解液呈透明狀，將勻漿液轉(zhuǎn)移至2個(gè)1.5 mL無RNA酶和無DNA酶的離心管中。離心之后，吸取上清液，移入新的1.5 mL無RNA酶和無DNA酶的離心管中，向新的勻漿裂解液中加入0.2 mL氯仿，用手劇烈震蕩15 s，12 000 r 4℃離心15 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中，加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在室溫下靜置10 min，再次12 000 r 4℃離心10 min，棄去上清，加入75%的乙醇1 mL洗滌并干燥。最后用40～50 μL的DEPC處理水溶解RNA。提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取物的濃度，OD260/280比值在1.8～2.0之間。

1.4.2 合成相關(guān)引物 從有關(guān)資料獲得所需引物，并在基因庫(kù)（Genebank）中進(jìn)行核對(duì)。引物序列見表1，由上海Invitrogen 公司合成。

1.4.3 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 用上述細(xì)胞中提取的2 μL總RNA加入0.2 mL離心管中，于70℃溫育10 min，短暫離心后置于冰上。依據(jù)如下順序加入以下試劑以建立一個(gè)20 μL的反應(yīng)體系：MgCl2（25 mM）4 μL ，反轉(zhuǎn)錄10×緩沖液2 μL，dNTP混合物（10 mM）2 μL，重組的RNasin核糖核酸酶抑制劑0.5 μL，AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.6 μL，隨機(jī)引物1 μL，無核酸酶的水7.9 μL，總RNA 2 μL。將反應(yīng)體系于室溫溫育10 min，于42℃溫育60 min，于95℃加熱5 min，再于4℃放置5 min。即為cDNA，放入-30℃存放。

1.4.4 PCR反應(yīng) 取上述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系于18 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系組成如下：2×Taq PCR Master Mix 9 μL，TLR4、MyD88上游引物 2 μL，TLR4、MyD88下游引物 2 μL，β-actin上游引物 2 μL，β-actin下游引物 2 μL，去離子水1 μL。變性94℃ 30 sec，退火58℃ 30 sec，延伸72℃ 30 sec，4℃冷卻5 min結(jié)束反應(yīng)。按上述條件循環(huán)25次，最后2%瓊脂糖凝膠電泳20 min。應(yīng)用BIO-RAD圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行吸光度掃描，計(jì)算TLR4/β-actin及MyD88/β-actin的比值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01表示差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠體重及肝指數(shù)比較

實(shí)驗(yàn)期間正常組大鼠靈活，精力充沛，皮膚有光澤，體重逐漸增加；模型組大鼠造模時(shí)體重較正常組逐漸增加，糞便粘臭，毛發(fā)失去光澤，漸油膩，實(shí)驗(yàn)初期活動(dòng)與正常組無異，第5周后大鼠活動(dòng)明顯減少，體態(tài)笨重。由表2可見模型組的肝指數(shù)較正常組明顯增加（P<0.01）。

2.2 兩組大鼠病理組織學(xué)變化及NAFLD活動(dòng)度計(jì)分比較

通過光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：正常組大鼠肝臟組織肝小葉結(jié)構(gòu)完整；肝細(xì)胞呈多邊形圍繞中央靜脈呈放射狀分布，大小較一致，核結(jié)構(gòu)清晰可見，肝竇清晰可見。模型組大鼠肝細(xì)胞脂肪變性明顯，主要以小泡性為主，偶爾可見重度脂肪變性，小葉內(nèi)可見淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)形成的點(diǎn)灶狀壞死，見圖1。模型組的NAFLD活動(dòng)度計(jì)分（NAFLD activity scores，NAS）與正常組比較有顯著差異（P<0.01），證實(shí)NASH模型成功建立，見表3。

2.3 兩組大鼠肝組織TLR4和MyD88 mRNA的表達(dá)比較

用RT-PCR法分別檢測(cè)NASH大鼠肝組織TLR4和MyD88 mRNA的表達(dá)，TLR4和β-actin的RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增片段為266 bp和149 bp，與預(yù)期設(shè)計(jì)的目的片段大小相同；MyD88和β-actin的RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增片段為191 bp和309 bp，與預(yù)期設(shè)計(jì)的目的片段大小相同，見圖2。模型組大鼠肝組織TLR4和MyD88 mRNA的表達(dá)水平與正常組比較有顯著差異（P<0.01），見表4。

3討論

NAFLD是指除大量飲酒、遺傳疾病、成脂藥物影響等導(dǎo)致的肝脂肪病，影像或者病理證實(shí)存在肝臟脂肪變的一種代謝性疾病[6，7]，包括非酒精性單純性脂肪肝（non-alcoholic simple fatty liver，NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、脂肪肝相關(guān)肝硬化。隨著肥胖及其相關(guān)代謝綜合征全球化的流行趨勢(shì)，NAFLD現(xiàn)已成為歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家和我國(guó)富裕地區(qū)慢性肝病的重要病因。研究發(fā)現(xiàn)，在NAFLD漫長(zhǎng)的病程中，NAFLD患者肝臟一般呈靜止?fàn)顟B(tài)，隨訪10～20年肝硬化發(fā)生率僅0.6%～3%，而NASH患者10年內(nèi)肝硬化發(fā)生率為15%～25%[8]，NASH為NAFLD發(fā)生肝硬化的限速步驟，因此，NAFLD引起了臨床醫(yī)師極大關(guān)注，其防治研究成為醫(yī)學(xué)研究的熱門課題之一。

目前其發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，以1998年Day CP[9]提出的“二次打擊學(xué)說”最為著名，即各種原因如肥胖、2型糖尿病、脂代謝紊亂等導(dǎo)致的胰島素抵抗（insulin resistance，IR），游離脂肪酸增加，肝臟脂肪代謝障礙，從而使肝細(xì)胞內(nèi)合成三酰甘油增加而輸出減少，導(dǎo)致過量的肝臟脂質(zhì)聚積，并使肝臟易受第二次打擊是“二次打擊學(xué)說”的第一步；線粒體脂肪酸氧化引起的氧化應(yīng)激，核因子-κB（nuclear fator-κB，NF-κB）依賴的炎癥細(xì)胞因子表達(dá)和脂肪細(xì)胞因子是所有的被認(rèn)為是導(dǎo)致第二次打擊產(chǎn)生肝細(xì)胞損傷、炎癥和纖維化的潛在因素[10，11]。

本研究組成員蔣艷明等[12]利用高脂高糖飲食喂養(yǎng)建立NAFLD模型，已證明其可靠性，本實(shí)驗(yàn)亦采用高脂高糖喂養(yǎng)誘導(dǎo)NAFLD大鼠模型，大鼠肝臟HE染色顯示肝臟脂肪變性程度加深、脂滴沉積，并可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，具有典型NAFLD病理表現(xiàn)，并檢測(cè)模型組大鼠肝組織中TLR4和MyD88的表達(dá)。Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是一類最重要的模式識(shí)別受體，可識(shí)別內(nèi)源性的損傷信號(hào)相關(guān)分子模式和微生物的病原學(xué)相關(guān)分子模式，是近年來發(fā)現(xiàn)的在免疫應(yīng)答中起重要作用的細(xì)胞表面受體分子，其不僅激活先天性免疫應(yīng)答，還引起細(xì)胞因子的釋放，是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁，對(duì)獲得性免疫具有重要的影響[13，14]。此類受體的基因最早在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，介導(dǎo)天然免疫，能感受入侵的病原體。TLR家族至少已包括13個(gè)成員，不同的TLR配體也有所不同。Medzhitov R等[15]首次在哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)與果蠅中Toll受體結(jié)構(gòu)同源的受體蛋白，后來命名為Toll樣受體，主要表達(dá)于單核巨噬細(xì)胞膜上，樹突狀細(xì)胞、B細(xì)胞以及表皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞也有表達(dá)。其屬于Ⅰ型跨膜蛋白（type Ⅰ transmembrance protein）受體，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)組成。胞外區(qū)為一段富含亮氨酸的重復(fù)序列（leucine-rich repeat，LRR），可與CD14 結(jié)合，參與各種病原體的識(shí)別；跨膜區(qū)是富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域；胞內(nèi)區(qū)是一段約有200個(gè)氨基酸的序列，該序列與白細(xì)胞介素1（interleukin-1，IL-1）受體胞內(nèi)區(qū)具有同源性，所以又稱為Toll/IL-1 受體同源區(qū)（Toll/IL-1 receptor homologous region，TIR），是TLRs向下游進(jìn)行信號(hào)傳遞的核心元件。當(dāng)TLR4與相應(yīng)配體結(jié)合后，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到TIR區(qū)域，然后進(jìn)一步激活核因子κB（nuclear factor-κB）、絲裂原蛋白激酶信號(hào)通路，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子和白介素等基因的表達(dá)[16]。

目前經(jīng)TLR4介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)包括髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依賴性和非依賴性途徑。MyD88依賴通路通過MyD88和IL-1受體相關(guān)激酶（interleukin-1 receptor-assciated kinase，IRAK）相互作用，募集TNF-受體相關(guān)因子6（tumor necrosis fator receptor-assciated fator 6，TRAF6），激活的TRAF6導(dǎo)致IκB激酶復(fù)合物活化，最終導(dǎo)致NF-κB、P38、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）激活，進(jìn)一步形成AP-1轉(zhuǎn)錄因子，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥因子。徐正婕等[17]通過建立大鼠NASH模型，觀察肝臟內(nèi)毒素受體表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)8周時(shí)肝臟CD14和TLR4表達(dá)較正常組增高，12周進(jìn)行性增高，并于16周達(dá)到高峰。Gao Y等[18]發(fā)現(xiàn)NASH患者體內(nèi)TLR4、LBP、TNF-α的水平明顯高于對(duì)照組，推測(cè)NASH的發(fā)病可能與TLR4及LPS的表達(dá)增高有關(guān)。Liu J等[19]對(duì)TLR4野生型和突變型小鼠給予高脂高糖飲食，發(fā)現(xiàn)分別在第4、8、16周出現(xiàn)野生型小鼠肝臟脂肪沉積、脂肪沉積合并炎癥以及纖維化，TLR4、MyD88表達(dá)在第4周增加，第8周達(dá)到高峰，突變型小鼠肝臟脂質(zhì)沉積則相對(duì)減輕，說明TLR4參與NAFLD的炎癥和纖維化進(jìn)程。劉濤等[20]采用高脂飼料喂養(yǎng)建立大鼠NAFLD模型，檢測(cè)NAFLD組和正常組TLR4、MyD88肝組織mRNA和蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NAFLD組大鼠肝組織中TLR4、MyD88表達(dá)均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，研究認(rèn)為TLR4信號(hào)在NAFLD大鼠模型中高表達(dá)，說明其參與NAFLD的炎癥和纖維化進(jìn)程。且Jagavelu K等[21]研究發(fā)現(xiàn)必須依賴MyD88的TLR4信號(hào)途徑，內(nèi)毒素才能促進(jìn)炎癥的產(chǎn)生。

本研究中，模型組的肝指數(shù)較正常組明顯增加，并且模型組的NAS與正常組比較有顯著差異，在分子水平模型組TLR4 mRNA表達(dá)水平明顯高于正常組，同時(shí)作為TLR4下游蛋白的MyD88的mRNA結(jié)果也明顯增高。綜上所述，TRL4 介導(dǎo)的炎性反應(yīng)可能是導(dǎo)致非酒精性脂肪性大鼠肝臟炎癥發(fā)生發(fā)展的原因之一。

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（收稿日期：2016-07-12）