浦雯綺++++++蔡奚梅++++++陸麗丹

[摘要] 目的 探討妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥（ICP）患者人類白細胞抗原G（HLA-G）與Th1/Th2細胞因子的相關(guān)性。 方法 選取2014年1月～2015年12月在江蘇省常熟市中醫(yī)院確診的90例ICP剖宮產(chǎn)引產(chǎn)孕婦娩出的胎盤組織作為觀察組，另選取同期90例因臍帶繞頸或胎兒臀位行剖宮產(chǎn)的正常孕婦娩出的胎盤組織作為對照組，采用免疫組化法對胎盤組織中HLA-G表達情況進行檢測，檢測孕婦血清總膽汁酸（TBA）、白細胞介素-4（IL-4）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平，比較兩組TBA、IL-4和TNF-α水平及胎盤組織中HLA-G表達，并分析HLA-G與Th1/Th2細胞因子相關(guān)性。 結(jié)果 觀察組TBA、TNF-α及TNF-α/IL-4水平均高于對照組，IL-4水平低于對照組（P < 0.01）。觀察組胎盤組織中HLA-G陽性表達程度明顯低于對照組（P < 0.01）。ICP患者胎盤組織中HLA-G與TNF-α和TNF-α/IL-4呈負相關(guān)（r=-0.751，P=0.024；r=-0.235，P=0.000），與IL-4無明顯相關(guān)性（P=0.305）。TBA與HLA-G呈負相關(guān)（r=-0.766，P=0.013），與TNF-α和TNF-α/IL-4呈正相關(guān)（r=0.821，P=0.033；r=0.731，P=0.024），與IL-4無明顯相關(guān)性（P=0.479）。 結(jié)論 HLA-G下降可能導(dǎo)致ICP患者TNF-α水平升高，使Th1表達處于優(yōu)勢狀態(tài)，導(dǎo)致Th1/Th2失衡，促使母體對胎兒產(chǎn)生排斥。

[關(guān)鍵詞] 妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥；人類白細胞抗原G；總膽汁酸；白細胞介素-4；腫瘤壞死因子-α

[中圖分類號] R714.25 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）11（b）-0090-04

[Abstract] Objective To explore the relationship between human leukocyte antigen G （HLA-G） and Th1/Th2 cytokines in patients with intrahepatic cholestasis of pregnancy （ICP）. Methods 90 cases of placental tissues of ICP diagnosed and treated with cesarean delivery of the placenta induction of labor in Hospital of Traditional Chinese Medicine in Changshu City， Jiangshu Province from January 2014 to December 2015 were selected as observation group， and another 90 cases of placental tissues of normal pregnant women undergoing of fetal breech cesarean delivery due to umbilical cord around the neck or breech presentation in the same period were selected as control group. The immunohistochemistry method was used to detect the expressions of HLA-G in placental tissues. The levels of serum total bile acid （TBA）， tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-4 （IL-4） were detected in the pregnant women between two groups. The levels of TBA， IL-4 and TNF-α and the expressions of HLA-G were compared between two groups， then the relationship between HLA-G and Th1/Th2 cytokines was analyzed. Results The levels of TBA， TNF-α and TNF-α/IL-4 in observation group were higher than those in control group， and the IL-4 of observation group was lower than that of control group （P < 0.01）. In the placental tissues of observation group， the degree of positive expression in HLA-G was obviously lower than that in control group （P < 0.01）. The expression of HLA-G was negatively correlated with TNF-α and TNF-α/IL-4 in the placental tissues of patients with ICP （r=-0.751， P=0.024； r=-0.235，P=0.000） and there was no significant correlation between HLA-G and IL-4 （P=0.305）. TBA was negatively correlated with HLA-G （r=-0.766， P=0.013）， positively correlated with TNF-α and TNF-α/IL-4 （r=0.821， P=0.033； r=0.731， P=0.024）， without significant correlation with IL-4 （P=0.479）. Conclusion HLA-G decline may lead to rising of TNF-α level in patients with ICP， and Th1 expression in the dominant state leads to imbalance of Th1/Th2.

[Key words] Intrahepatic cholestasis of pregnancy； Human leukocyte antigen G； Total bile acid； Interleukin-4； Tumor necrosis factor-α

妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥（intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP）多發(fā)于妊娠中晚期，屬于妊娠期間特有的肝臟疾病，主要癥狀為皮膚瘙癢，生化特征為肝酶和膽酸等異常，通常會引起宮內(nèi)窘迫、早產(chǎn)及新生兒窒息或死亡等不良妊娠結(jié)局[1-3]。人類白細胞抗原G（human leukocyte antigen G，HLA-G）能夠通過與T細胞和NK細胞表面的抑制性受體相結(jié)合，抑制這兩種細胞的殺傷活性，對于正常妊娠的維持和母胎免疫耐受有重要作用，如果表達異常，會造成病理性妊娠的發(fā)生。在正常妊娠狀態(tài)下，為避免胎兒受母體排斥，母體中Th2免疫占有絕對優(yōu)勢，避免Th1參與的細胞免疫。但是有研究表明，ICP患者母體中Th1/Th2型細胞因子已經(jīng)失去平衡性，轉(zhuǎn)向以Th1為主的細胞免疫[4]。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）屬于Th1型細胞因子，白細胞介素-4（interleukin-4，IL-4）屬于Th2型細胞因子。所以本研究進行Th1/Th2型細胞因子TNF-α/IL-4水平和總膽汁酸（total bile acids，TBA）水平檢測，同時研究HLA-G的表達，探討ICP患者HLA-G與Th1/Th2細胞因子的相關(guān)性，以期為ICP的發(fā)病機制提供可靠依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月～2015年12月在江蘇省常熟市中醫(yī)院（以下簡稱“我院”）確診的90例ICP剖宮產(chǎn)引產(chǎn)孕婦娩出的胎盤組織作為觀察組，ICP孕婦年齡21～35歲，平均（28.46±4.38）歲；孕齡31～40周，平均（35.27±3.66）周。另選取同期90例因臍帶或胎兒臀位行剖宮產(chǎn)的正常孕婦娩出的胎盤組織作為對照組，正常孕婦年齡22～37歲，平均（29.51±5.35）歲；孕齡30～39周，平均（36.01±2.79）周。兩組孕婦年齡、孕齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準同意。

1.2 納入與排除標準

納入標準：①所有研究對象均為單胎妊娠，初產(chǎn)婦；②年齡22～37歲；③孕齡30～40周；④均行剖宮產(chǎn)結(jié)束妊娠；⑤簽署研究知情書表示愿意參加本次研究。排除標準：①合并有肝腎功能損傷、妊娠高血壓、冠心病或其他心腦血管疾病、多囊卵巢綜合征者；②胎兒發(fā)育異常、胎膜早破或產(chǎn)前感染、產(chǎn)前出血；③有死胎或死產(chǎn)史者；④有精神或神經(jīng)性疾??；⑤有ICP無法解釋的生化、血尿等檢測異?，F(xiàn)象；⑥臨床資料不全者。

1.3 方法

1.3.1 IL-4、TNF-α和TBA水平測定 產(chǎn)前晨起空腹抽取肘靜脈血4 mL，分別置于普通試劑管和無菌促凝管中，2 mL/管。對普通試劑管中血液進行TBA濃度測定。無菌促凝管中血液靜置2 h后，水平離心機分離血清，3000 r/min，共10 min，留取血清，-20℃冰箱保存，然后采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測IL-4和TNF-α水平。相應(yīng)試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.3.2 HLA-G蛋白表達 ①胎盤：分娩后直接進行新鮮胎盤組織采集，母面臍帶附著處取2 cm×2 cm大小的全層組織，0.9%氯化鈉溶液反復(fù)洗凈，10%甲醛溶液中固定，-80℃冰箱保存，常規(guī)石蠟包埋。②免疫組化法：采用免疫組化法將蠟塊進行厚度為4 μm連續(xù)切片，取其中1片進行免疫組化染色；一抗（購自美國BD Pharmingen生物技術(shù)公司）工作濃度根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果調(diào)整，1∶100；實驗步驟參照《現(xiàn)代分子生物學(xué)試驗手冊》[5]，分別對切片進行梯度水化、抗原修復(fù)、室溫孵育、磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗等；兩組切片均在相同的試驗條件與步驟下進行，免疫組化染色程序嚴格按照試劑盒說明方法染色，已確定為陽性切片，陰性對照滴入PBS代替一抗，若整片未見棕色顆粒，則說明本次試驗染色結(jié)果可靠；顯微鏡下（深圳市深視光谷光學(xué)儀器有限公司，型號：SGO-200UVPX）觀察每張切片選取至少5個視野，根據(jù)染色強度和陽性細胞所占比例進行判斷。③HLA-G病理分析：HLA-G的陽性標記為淡棕色、棕色或深棕色顆粒。陽性細胞占比評分：≤5%為0分；>5%～25%為1分；>25%～50%為2分；>50%～75%為3分；>75%為4分。染色強度評分：不著色，0分；淡棕色，1分；棕色，2分，深棕色，3分；兩項評分相加0～1分陰性；2～3分弱陽性（+）；4～5分中度陽性（++）；6～7分強陽性（+++）。陽性表達率為陽性標本數(shù)在總標本數(shù)中所占比例。

1.4 觀察指標

①比較兩組TBA、IL-4、TNF-α及TNF-α/IL-4水平和HLA-G表達情況；②分析ICP患者HLA-G與Th1/Th2細胞因子的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析和處理，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，等級資料采用秩和檢驗，相關(guān)性采用Pearson線性相關(guān)分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組孕婦外周血血清細胞因子水平比較

觀察組外周血TBA、TNF-α及TNF-α/IL-4水平均高于對照組，IL-4水平低于對照組，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。見表1。

2.2 兩組HLA-G表達情況比較

觀察組胎盤組織中HLA-G陽性表達程度明顯低于對照組，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。見表2。

2.3 HLA-G與Th1/Th2細胞因子及TBA相關(guān)性

經(jīng)分析，ICP患者胎盤組織中HLA-G與TNF-α和TNF-α/IL-4呈負相關(guān)（r=-0.751，P=0.024；r=-0.235，P=0.000），與IL-4無明顯相關(guān)性（P=0.305）。TBA與HLA-G呈負相關(guān)（r=-0.766，P=0.013），與TNF-α和TNF-α/IL-4呈正相關(guān)（r=0.821，P=0.033；r=0.731，P=0.024），與IL-4無明顯相關(guān)性（P=0.479）。

3 討論

正常妊娠的維持需要母體作為同種半異體移植物的胚胎組織產(chǎn)生免疫耐受，這是母體在妊娠期自身免疫調(diào)節(jié)的結(jié)果。有關(guān)研究表明，母體與胚胎之間的免疫應(yīng)答主要發(fā)生于胎盤局部，而妊娠是否成功的關(guān)鍵在于胎盤滋養(yǎng)細胞與脫膜層免疫微環(huán)境的相互作用[6-7]。哺乳動物的胚胎發(fā)育最初階段是存在抗原特性的，且該特性隨著胚胎的不斷發(fā)育而逐漸增強，但由于母體與胚胎基因的不一致性，導(dǎo)致在隨后的妊娠中胚胎和其滋養(yǎng)細胞表達甲胎蛋白抗原、胚胎血型抗原等同種異體抗原[8-9]。胚胎的滋養(yǎng)層細胞可直接與母體蛻膜組織的免疫細胞接觸，而滋養(yǎng)細胞的抗原特性將直接對母體和胚胎的免疫反應(yīng)造成影響。經(jīng)典的HLA-A、B抗原在母胎界面的絨毛外滋養(yǎng)細胞不表達，但非經(jīng)典的HLA-G于滋養(yǎng)細胞表達。有研究證實，HLA-G是一種免疫抑制因子，在妊娠過程中對有父源性人類白細胞抗原的胎兒具有保護作用，從而保證妊娠順利進行[10-11]。

蛻膜層免疫微環(huán)境與胎盤滋養(yǎng)細胞的相互作用是妊娠成功與否的決定因素，母體滋養(yǎng)層細胞能夠與蛻膜組織的免疫細胞進行接觸，其抗原性可以對胚胎的免疫反應(yīng)產(chǎn)生直接影響。有學(xué)者研究表明，HLA-G正是免疫抑制因子中的一員，可以減少母體免疫細胞對滋養(yǎng)細胞的攻擊，同時對滋養(yǎng)細胞的分化和侵入行為進行調(diào)節(jié)，保證妊娠的順利進行[12]。有國外學(xué)者對試管嬰兒胚胎進行研究，發(fā)現(xiàn)胚胎想要植入成功，胚胎培養(yǎng)液中必須有HLA-G表達，提示HLA-G是妊娠正常進行的前提[13]。所以當HLA-G的表達水平降低時，很容易導(dǎo)致病理妊娠的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，ICP患者胎盤組織中HLA-G的陽性表達程度顯著低于對照組，通常孕激素對于HLA-G的表達有上調(diào)作用，此時考慮ICP患者發(fā)生孕激素異常代謝。另外，在妊娠中期，血紅素加氧酶對絨毛外滋養(yǎng)細胞的生長有調(diào)節(jié)作用，HLA-G正是從絨毛外滋養(yǎng)細胞中提取出來的，所以HLA-G表達降低與血紅素加氧酶降低也有密不可分的關(guān)系。

臨床認為，偏向Th2細胞因子參與的體液免疫才能保證妊娠的正常維持，且只有Th1細胞因子水平降低并向Th2方向轉(zhuǎn)化，才能使胎兒不被母體排斥[14-15]。因為妊娠期間，Th1細胞因子具有細胞毒效應(yīng)。有動物實驗結(jié)果顯示，將TNF-α、IFN-γ、IL-2注入懷孕小鼠體內(nèi)，會導(dǎo)致小鼠流產(chǎn)，妊娠終止，而且其胎盤組織中的TNF-α、IFN-γ和IL-2細胞因子明顯增加[16]。Th2細胞中IL-4因子可對Th1誘導(dǎo)下NK細胞的活化產(chǎn)生抑制作用，調(diào)節(jié)胎盤生長，最終達到防止早產(chǎn)和流產(chǎn)的目的。如果外周免疫、母胎界面的激素網(wǎng)絡(luò)、滋養(yǎng)層主要組織兼容性復(fù)合物及胎盤分泌的保護抗體和抑制因子等其中一項有異常反應(yīng)，都會導(dǎo)致母體免疫功能紊亂，Th1/Th2平衡性喪失，導(dǎo)致妊娠并發(fā)癥及妊娠失敗的發(fā)生。有學(xué)者研究指出，在肝臟損傷的過程中，TNF-α?xí)兴鶇⑴c[17]。TNF-α可以促進中性粒細胞活化，提高其在肝臟中的聚積，釋放氧自由基和蛋白酶等導(dǎo)致干細胞損傷；TNF-α促使氧自由基產(chǎn)生，造成脂質(zhì)過氧化物堆積，引起肝臟細胞氧化損傷；TNF-α能夠促進單核細胞和中性粒細胞與內(nèi)皮細胞之間的黏附，通過提高免疫反應(yīng)或直接殺傷力引起內(nèi)皮細胞損傷[18-20]。這些損傷均會不同程度地損傷母體，造成不良妊娠結(jié)局。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝臟損傷指標TBA水平測量顯示，觀察組患者明顯高于對照組，并且TBA與TNF-α之間呈正相關(guān)，表明隨著TNF-α升高，孕婦肝臟損傷后程度越重，肝內(nèi)膽汁淤積癥越嚴重。而TBA與IL-4無明顯相關(guān)性，說明ICP患者存在Th1/Th2失衡，且向Th1方向偏移。

在HLA-G被不同細胞受體識別時，能夠調(diào)節(jié)母體單核巨噬細胞、外周血單個核細胞、蛻膜細胞、胎盤滋養(yǎng)層、Th細胞及NK細胞等分泌出不同的Th因子，從而促進和保護胚胎和滋養(yǎng)細胞的發(fā)育生長[21]。有學(xué)者研究HLA-G在母體中的影響發(fā)現(xiàn)，HLA-G對PBMCs細胞中IL-4產(chǎn)生有促進作用，并抑制蛻膜細胞因子IFN-γ和TNF-α的分泌，得出HLA-G能通過對PBMCs細胞因子和蛻膜細胞因子的調(diào)節(jié)，保持Th1/Th2平衡[22]。另有國外學(xué)者指出，不同濃度HLA-G對細胞因子的影響程度不同，低濃度狀態(tài)下，可使Th1型細胞如TNF-α等增加，高濃度狀態(tài)下又對Th2細胞因子的產(chǎn)生有誘導(dǎo)作用[23]。本研究中，觀察組HLA-G與TNF-α、TBA和TNF-α/IL-4呈負相關(guān)，提示IPC患者HLA-G下降，則Th1型細胞因子水平上升，肝內(nèi)膽汁淤積癥發(fā)生率升高。

綜上所述，ICP胎盤組織中HLA-G表達下降會導(dǎo)致Th1/Th2失衡，臨床可以選用對HLA-G表達有上調(diào)作用的藥物如地米塞松等進行ICP治療。

[參考文獻]

[1] 何麗，羅丹，劉毅，等.500例妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥圍生結(jié)局分析[J].實用婦產(chǎn)科雜志，2012，28（4）：282-284.

[2] 任麗平，徐軍，胡崢.多烯磷脂酰膽堿聯(lián)合茵梔黃和谷胱甘肽治療妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥的研究[J].臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志，2016，15（10）：999-1001.

[3] 吳紹洋，楊新明.血清甘膽酸檢測在妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥中的應(yīng)用價值[J].中國當代醫(yī)藥，2016，23（16）：41-43.

[4] 繆玉輝，孫瑞芳.茵陳蒿湯對妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥患者Th1/Th2平衡的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2014， 34（8）：1017-1018.

[5] 張維銘.現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗手冊[M].2版.北京：科學(xué)出版社，2007：78-82.

[6] 周蘭，漆洪波，羅欣.早發(fā)型妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥患者的臨床生化特點及圍產(chǎn)結(jié)局分析[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2013，48（1）：20-24.

[7] 杜巧玲，段濤.膽汁酸與妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥發(fā)病機制關(guān)系的研究進展[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2013，48（2）：141-143.

[8] 孔艷，孔祥.妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥免疫因素的研究進展[J].中華婦幼臨床醫(yī)學(xué)雜志：電子版，2015，11（6）：798-800.

[9] Geenes V，Chappell LC，Seed PT，et al. Association of severe intrahepatic cholestasis of pregnancy with adverse pregnancy outcomes：a prospective population-based case-control study[J]. Hepatology，2014，59（4）：1482-1491.

[10] 李明，吳晶，邢愛耘.人類白細胞抗原F在妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥患者胎盤中的表達及意義[J].實用婦產(chǎn)科雜志，2015，31（7）：26.

[11] Wikstrm Shemer E，Marschall HU，Ludvigsson JF，et al. Intrahepatic cholestasis of pregnancy and associated adverse pregnancy and fetal outcomes：a 12-year population-based cohort study[J]. BJOG，2013，120（6）：717-723.

[12] 陳國珍，賈支俊.妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥嚴重程度與胎兒生長發(fā)育狀況關(guān)系研究[J].山西醫(yī)藥雜志，2010，39（7）：658-659.

[13] Zambra FM，Biolchi V，de Cerqueira CC，et al. Immunogenetics of prostate cancer and benign hyperplasia-the potential use of an HLA-G variant as a tag SNP for prostate cancer risk[J]. HLA，2016，87（2）：79-88.

[14] 王增芳，王萍萍，王增艷，等.PTPRO對妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥患者Th1/Th2細胞偏倚的影響[J].江蘇醫(yī)藥，2015，41（18）：2157-2159，2110.

[15] 朱琴玲，李莉平，秦曉黎，等.通過TLR9途徑活化巨噬細胞導(dǎo)致小鼠流產(chǎn)的機制研究[J].現(xiàn)代免疫學(xué)，2011， 31（6）：473-477.

[16] 宋靜，王黎麗，侯昕，等.調(diào)節(jié)性T細胞在poly I：C/D-GalN誘發(fā)的肝臟損傷中的免疫調(diào)節(jié)作用[J].中國免疫學(xué)雜志，2014，30（1）：24-29.

[17] 吳永強，梁龍，石桂秀.CD38蛋白下調(diào)炎癥因子的表達減輕脂多糖聯(lián)合D-氨基半乳糖誘導(dǎo)的急性肝臟損傷[J].細胞與分子免疫學(xué)雜志，2014，30（10）：1009-1012.

[18] Carlsson AC，stgren CJ，Nystrom FH，et al. Association of soluble tumor necrosis factor receptors 1 and 2 with nephropathy，cardiovascular events，and total mortality in type 2 diabetes[J]. Cardiovasc Diabetol，2016，15（1）：40.

[19] 王崇，姜艷芳，金清龍，等.肝病患者血清Gc球蛋白和細胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10檢測及臨床意義[J].中國實驗診斷學(xué)，2010，14（6）：870-872.

[20] 張展，李瑩，張琳琳，等.父源性HLA-G基因14bp缺失多態(tài)性與早發(fā)型重度子癇前期的相關(guān)性研究[J].中國婦幼保健，2012，27（11）：1710-1713.

[21] 張娣，單士剛，陳俊，等.可溶性HLA-G二聚體在體外對M1型巨噬細胞極化抑制作用的研究[J].免疫學(xué)雜志，2013，29（9）：818-821.

[22] 曾憲成，張彤，李華，等.肝癌Hep3B細胞HLA-G過表達對NK細胞體外殺傷作用的影響[J].中國病理生理雜志，2012，28（4）：613-618.

[23] Svajger U，Obermajer N，Jeras M. IFN-γ-rich environment programs dendritic cells toward silencing of cytotoxic immune responses[J]. Leukoc Biol，2014，95（1）：33-46.