劉文佐 左建軍 代發(fā)文 葉 慧 曹慶云 周響艷 鄒仕庚黃志毅 職愛民 馮定遠

（華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，廣州 510642）

不同品種豬在不同生理階段骨骼肌葡萄糖轉運載體和胰島素受體表達的發(fā)育性變化

劉文佐 左建軍 代發(fā)文 葉 慧 曹慶云 周響艷 鄒仕庚黃志毅 職愛民 馮定遠?

（華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，廣州 510642）

本試驗旨在研究不同品種豬在不同生理階段骨骼肌葡萄糖轉運載體（GLUT）1、GLUT4和胰島素受體（IR）mRNA表達的發(fā)育規(guī)律。試驗以1、7、30、60、90和150日齡藍塘和長白兩品種豬背最長肌、半膜肌和半腱肌組織樣品cDNA為模板，采用實時熒光半定量PCR的方法，檢測豬GLUT1和GLUT4 mRNA在不同骨骼肌中的表達模式。結果顯示：1）1～150日齡藍塘和長白豬背最長肌、半膜肌和半腱肌GLUT1 mRNA表達存在相似的發(fā)育變化規(guī)律，在1日齡時相對表達豐度最高。2）1～150日齡藍塘和長白豬半膜肌和半腱肌GLUT4 mRNA相對表達豐度隨日齡呈波形式變化，變化速度和程度存在品種差異。1日齡和150日齡時藍塘豬背最長肌GLUT4 mRNA相對表達豐度低于同日齡長白豬（P＞0.05），而在其余日齡時高于同日齡長白豬（P＞0.05）。3）藍塘和長白豬背最長肌、半膜肌和半腱肌IRmRNA相對表達豐度在1和30日齡時表現(xiàn)出較高水平，而在7、60、90和150日齡時無顯著差異（P＞0.05）；同日齡藍塘和長白豬之間IRmRNA相對表達豐度無顯著性差異（P＞0.05）。結果表明：豬骨骼肌GLUT1 mRNA的表達在不同生理階段存在差異，豬骨骼肌GLUT4 mRNA的表達在不同品種和生理階段存在顯著差異，且其與IRmRNA的表達相關性較弱，無明顯規(guī)律。

豬；生理階段；葡萄糖轉運載體1；葡萄糖轉運載體4；胰島素受體；發(fā)育規(guī)律

葡萄糖轉運載體（glucose transporter，GLUT）是介導葡萄糖分子進入細胞的通道，其表達水平和蛋白質(zhì)活性對維持機體葡萄糖穩(wěn)態(tài)和提供營養(yǎng)底物具有重要的意義。目前，哺乳動物GLUT可以分為 3類［1］，其中第 1類包括 4種，分別為GLUT1、GLUT2、GLUT3和GLUT4，分布組織廣泛，對調(diào)節(jié)機體葡萄糖穩(wěn)態(tài)具有重要的作用。GLUT1和 GLUT4是骨骼肌最為重要的兩類GLUT，其中GLUT1負責轉運供應機體基礎代謝所需的葡萄糖，而GLUT4受胰島素敏感性調(diào)節(jié)。

Hall等［2］在大西洋黑線鱈中研究發(fā)現(xiàn)，GLUT4 mRNA的表達在其受精卵中就可檢測到，而且從孵化期到幼年時期一直有較高豐度的表達。有研究報道，發(fā)現(xiàn)斷奶后和成年大鼠空腸GLUT1蛋白豐度顯著高于哺乳期［3］。Barfull等［4］在研究中還比較了2日齡和5周齡的雞腸道中鈉-葡萄糖共轉運載體（SGLT）1的mRNA的表達，結果顯示mRNA的表達存在顯著差異。王修啟等［5］研究愛拔益加（AA）肉雞和黃羽肉雞十二指腸中GLUT2 mRNA的表達，發(fā)現(xiàn)其發(fā)育模式并不相同，在2～30日齡2種肉雞中都呈現(xiàn)不斷升高的趨勢，30日齡以后兩者的發(fā)育模式完全不同。上述研究說明了不同年齡、不同品種的動物，其GLUT的表達有所差異。此外，目前有關GLUT的研究主要體現(xiàn)人［6-7］、鼠［3-10］和家禽［11-13］上，且對腸道中GLUT的表達研究較多，而其在不同品種豬及生理階段骨骼肌中的分布表達情況還未見報道。因此，本試驗選用地方傳統(tǒng)豬種藍塘豬和外來品種長白豬為試驗對象，研究不同品種豬在不同生理階段骨骼肌GLUT1和GLUT4以及胰島素受體（insulin receptor，IR）mRNA表達的發(fā)育性變化，旨在探討豬骨骼肌內(nèi)葡萄糖代謝的分子機制，為進一步研究骨骼肌生長發(fā)育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣品采集

選取1日齡藍塘仔豬50頭和長白仔豬70頭，隨機分到5個重復，藍塘每個重復共10頭，長白每個重復共14頭。飼養(yǎng)至150日齡，飼養(yǎng)試驗在廣東省東莞市板嶺原種豬場進行，按照試驗豬場的飼養(yǎng)管理規(guī)程及免疫程序進行飼養(yǎng)。于1、7、30、 60、90和150日齡時分別從藍塘和長白豬組每個重復中選取接近平均體重的閹公豬進行放血屠宰試驗，宰前不禁食。按解剖學位置分別從背最長肌、半膜肌和半腱肌采取組織樣放入1.5 mL離心管中，液氮速凍后，轉入-80℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實時熒光定量檢測組織中GLUT1和GLUT4的表達

將分離的不同部位的骨骼肌參照Trizol（北京賽百盛基因技術有限公司）的說明書步驟，分別從3塊不同的肌肉部位提取總RNA后進行反轉錄，而后使用TaKaRa公司提供的PCR試劑盒進行實時熒光半定量PCR檢測，參照NCBI公布的豬GLUT1（GenBank登錄號：X17058）、GLUT4（Gen-Bank登錄號：EU590115）以及IR（GenBank登錄號：AF102858）的基因序列，用Prime 5.0軟件設計引物（表1），內(nèi)參基因為 β-肌動蛋白（β-actin），四者的反應條件均為：95℃ 5 min，95℃ 20 s、58℃ 20 s、72℃ 20 s共40個循環(huán)，72℃ 4 min。

表1 試驗引物Table 1 Primers for the experiment

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準誤表示。采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，運用單因子方差分析（one-way ANOVA）模型進行方差分析，運用LSD法進行不同日齡之間差異顯著性檢驗，運用獨立樣本T檢驗法進行同日齡藍塘和長白豬之間差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 背最長肌GLUT1、GLUT4和IRmRNA表達的發(fā)育性變化

1～150日齡藍塘和長白豬背最長肌GLUT1、GLUT4和IRmRNA相對表達豐度發(fā)育變化比較見圖1所示。由圖1-A可知，藍塘和長白豬背最長肌GLUT1 mRNA相對表達豐度具有相似的發(fā)育變化規(guī)律。2種豬初生時（1日齡）背最長肌GLUT1 mRNA相對表達豐度均顯著高于其他日齡（P＜0.05），在7、30、60、90和150日齡時均無顯著性變化（P＞0.05）。相同日齡時2品種豬之間背最長肌GLUT1 mRNA相對表達豐度也無顯著差異（P＞0.05）。

由圖 1-B可知，長白豬背最長肌GLUT4 mRNA相對表達豐度出生時水平較高，隨后逐漸降低；7日齡GLUT4 mRNA相對表達豐度顯著低于1日齡（P＜0.05），而7、30、60和90日齡與1日齡相比無顯著差異（P＞0.05），150日齡達到最高，顯著高于其他日齡（P＜0.05）。藍塘豬背最長肌GLUT4 mRNA相對表達豐度隨日齡變化無明顯變化趨勢，各日齡之間差異不顯著（P＞0.05）。1日齡時長白豬背最長肌GLUT4 mRNA相對表達豐度高于同日齡藍塘豬（P＞0.05），而后除150日齡外，藍塘豬背最長肌GLUT4 mRNA相對表達豐度高于長白豬（P＞0.05），其中60日齡時藍塘豬比長白豬高66.76%。

由圖1-C可知，藍塘和長白豬背最長肌IRmRNA相對表達豐度具有相似的發(fā)育變化規(guī)律。在1和 30日齡時藍塘和長白豬背最長肌IRmRNA相對表達豐度均處于較高水平。長白豬1日齡背最長肌IRmRNA相對表達豐度顯著高于除150日齡以外的其余日齡（P＜0.05），而7、30、60、90和150日齡間無顯著差異（P＞0.05）。1和30日齡藍塘豬背最長肌IRmRNA相對表達豐度顯著高于60日齡（P＜0.05），其余日齡間無顯著差異（P＞0.05）。

圖1 不同日齡藍塘和長白豬背最長肌GLUT1、GLUT4和IRmRNA相對表達豐度Fig.1 The mRNA relative expression abundance ofGLUT1，GLUT4 andIRin longissimus dorsi muscle ofLantangand Landrace pigs at different days of age

2.2 半膜肌GLUT1、GLUT4和IRmRNA表達的發(fā)育性變化

1～150日齡藍塘和長白豬半膜肌GLUT1、GLUT4和IRmRNA相對表達豐度發(fā)育變化比較見圖2所示。由圖2-A可知，1～150日齡藍塘和長白豬半膜肌GLUT1 mRNA相對表達豐度存在相似的發(fā)育變化規(guī)律。1日齡GLUT1 mRNA相對表達豐度顯著高于其他日齡（P＜0.05），而在7、30、60、90和 150日齡時無顯著差異（P＞0.05）。同日齡藍塘和長白豬半膜肌GLUT1 mRNA相對表達豐度無顯著差異（P＞0.05）。

由圖2-B可知，1～150日齡藍塘和長白豬半膜肌GLUT4 mRNA相對表達豐度隨日齡呈波形式變化，長白豬出生后先降低再升高，而藍塘豬先升高后降低。30日齡時藍塘和長白豬半膜肌GLUT4 mRNA相對表達豐度均處于最高水平。30日齡長白豬半膜肌GLUT4 mRNA相對表達豐度顯著高于7日齡（P＜0.05），而藍塘豬在30和60日齡時半膜肌GLUT4 mRNA相對表達豐度顯著高于其他日齡（P＜0.05）。在7和60日齡時，藍塘豬半膜肌GLUT4 mRNA相對表達豐度分別比同日齡長白豬高76.98%和74.70%，均達到顯著水平（P＜0.05）。

由圖2-C可知，藍塘豬和長白豬半膜肌IRmRNA相對表達豐度均在1和30日齡時表現(xiàn)出較高水平，而在7、60、90和150日齡時無顯著差異（P＞0.05）。同日齡藍塘豬和長白豬半膜肌IRmRNA相對表達豐度均無顯著差異（P＞0.05）。

圖2 不同日齡藍塘和長白豬半膜肌GLUT1、GLUT4和IRmRNA相對表達豐度Fig.2 The mRNA relative expression abundance ofGLUT1，GLUT4 andIRin semimembranosus ofLantangand Landrace pigs at different days of age

2.3 半腱肌GLUT1、GLUT4和IRmRNA表達的發(fā)育性變化

1～150日齡藍塘和長白豬半腱肌GLUT1、GLUT4和IRmRNA相對表達豐度發(fā)育變化比較見圖3所示。由圖3-A可知，1～150日齡藍塘和長白豬半腱肌GLUT1 mRNA相對表達豐度均在1日齡時顯著高于其他日齡（P＜0.05），而在7、30、60、90和150日齡時均無顯著性變化（P＞0.05）。150日齡時藍塘豬半腱肌GLUT1 mRNA相對表達豐度比同日齡長白豬高58.21%（P＞0.05）。

由圖3-B可知，1～150日齡藍塘和長白豬半腱肌GLUT4 mRNA相對表達豐度隨日齡呈波形式變化，長白豬出生后先降低再升高，而藍塘豬先升高后降低。30日齡時藍塘和長白豬半腱肌GLUT4 mRNA相對表達豐度均處于最高水平。30日齡長白豬半腱肌GLUT4 mRNA相對表達豐度顯著高于7日齡（P＜0.05），而藍塘豬在30日齡時顯著高于1日齡（P＜0.05），與其他日齡相比無顯著差異（P＞0.05）。1日齡時長白豬半腱肌GLUT4 mRNA相對表達豐度顯著高于同日齡藍塘豬（P＜ 0.05），而在其他日齡時藍塘豬僅有高于同日齡長白豬的趨勢（P＞0.05）。

由圖3-C可知，藍塘豬和長白豬半腱肌IRmRNA相對表達豐度均在1和30日齡時表現(xiàn)出較高水平，而在7、60、90和150日齡時無顯著差異（P＞0.05）。同日齡藍塘豬和長白豬半膜肌IRmRNA相對表達豐度均無顯著差異（P＞0.05）。

3 討 論

3.1 日齡對骨骼肌GLUT表達的影響

骨骼肌GLUT表達隨機體發(fā)育而產(chǎn)生變化以滿足機體生長代謝的生理需要。Humphrey等［14］在禽類的研究上發(fā)現(xiàn)生長雞GLUT1在孵化后第1天除心臟外在其他組織均無表達，而心臟組織也是在孵化后第3天表達水平急劇下降直到第7天才恢復到第1天水平。本研究發(fā)現(xiàn)豬在出生第1天骨骼肌GLUT1具有較高的mRNA表達豐度，隨后呈下降趨勢，并維持低水平至150日齡。這可能是由于2種動物營養(yǎng)生理差異的原因，禽類孵化后第1天仍由卵黃囊提供機體能量直到其脂肪耗盡［15］，而豬出生時通過采食母乳滿足營養(yǎng)需要。Dos Santos等［16］研究了不同發(fā)育階段鼠的骨骼肌GLUT4 mRNA的表達情況，結果表明，鼠比目魚肌中GLUT4 mRNA的表達與日齡呈負相關，這與發(fā)育過程中機體葡萄糖的攝取及代謝有關。本研究發(fā)現(xiàn)藍塘豬和長白豬半膜肌和半腱肌GLUT4 mRNA相對表達豐度隨日齡呈波形變化，30日齡時顯著高于7日齡，這可能是由于從哺乳期高能量、高脂肪液體乳過渡到斷奶期全價飼料原料飼糧，從而影響機體骨骼肌糖代謝所致。也有研究顯示飼糧因素會影響GLUT在肌肉中的表達，如Banda等［17］研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)2周高果糖飼糧使骨骼肌中GLUT4 mRNA表達水平下降27%。

圖3 不同日齡藍塘和長白豬半腱肌GLUT1、GLUT4和IRmRNA相對表達豐度Fig.3 The mRNA relative expression abundance ofGLUT1，GLUT4 andIRin semitendinosus ofLantangand Landrace pigs at different days of age

此外，本試驗結果發(fā)現(xiàn)藍塘豬和長白豬背最長肌、半膜肌和半腱肌中GLUT1和GLUT4 mRNA表達發(fā)育模式存在極大的差異，GLUT4表達豐度明顯高于GLUT1，且在出生后整個試驗期內(nèi)都表現(xiàn)出較高的表達水平。這表明GLUT4是骨骼肌發(fā)育過程中主要的GLUT亞型。與此相似，在人肌纖維發(fā)育過程中GLUT1和GLUT4表達發(fā)育模式存在明顯差異，在出生后GLUT1顯著下降，并在出生后第1年降至檢不出水平，而GLUT4在全期都有較高的表達水平［18］。 然而，Sweazea等［19］在禽類的研究表明GLUT1表達比GLUT4重要。這可能與兩類轉運載體調(diào)節(jié)機制和動物機體對胰島素敏感性差異有關。

3.2 品種對骨骼肌GLUT表達的影響

藍塘豬是中國地方品種豬，具有典型的傳統(tǒng)豬種特征，與外來豬相比生長速度較慢、胴體瘦肉率較低、肌內(nèi)脂肪含量較高。葡萄糖是哺乳動物機體主要的能量來源，對豬而言主要通過腸道GLUT吸收轉運。Duehlmeier等［20］研究比較了GLUT1和GLUT4在單胃雜食動物（鼠、豬）和復胃草食動物（牛、山羊）骨骼肌中的分布方式，試驗結果發(fā)現(xiàn)，兩類動物GLUT1在氧化型和酵解型肌肉中的表達方式存在差異。這揭示品種間遺傳差異是影響GLUT1在肌肉中表達方式的主要原因之一。本試驗發(fā)現(xiàn)同日齡藍塘和長白豬骨骼肌GLUT1 mRNA表達豐度發(fā)育變化存在相似的趨勢，這進一步佐證了GLUT1在肌肉中的表達受品種間遺傳差異的影響。本試驗結果還發(fā)現(xiàn)，與長白豬相比，藍塘豬背最長肌GLUT4的表達不受發(fā)育變化的影響，這也是由于品種的遺傳差異所致。

此外，本試驗發(fā)現(xiàn)同日齡藍塘豬和長白豬骨骼肌GLUT1和GLUT4 mRNA在不同生理階段存在不同程度的差異。本試驗中150日齡時藍塘豬半肌腱GLUT1和GLUT4相對表達豐度高于同日齡長白豬，且有文獻報道肌內(nèi)脂肪沉積主要在生長發(fā)育后期［21］，而藍塘豬相比外來豬，其肌內(nèi)脂肪含量較高，因此，我們推斷葡萄糖可能是肌內(nèi)脂肪沉積的主要能量來源和底物。

3.3IR與GLUT的發(fā)育性表達

動物細胞葡萄糖跨膜吸收在調(diào)節(jié)機體葡萄糖穩(wěn)態(tài)方面起著十分重要的作用，而胰島素調(diào)節(jié)GLUT活性對機體葡萄糖的代謝利用起著重要的生理作用。在基礎代謝狀態(tài)下，位于細胞膜上的GLUT4只有5%左右。然而，在胰島素的快速刺激下（2～3 min），GLUT4外分泌增加，大約50% GLUT4重新移至細胞膜表面［22］。因此GLUT4易位是骨骼肌糖代謝的關鍵步驟。

基礎狀態(tài)下，骨骼肌的GLUT4主要于細胞內(nèi)以囊泡形式存在，只有少數(shù)存在于細胞膜上。當組織受到胰島素或運動的刺激時，胰島素與其特定的IR結合，通過一系列的信號傳導通路，觸發(fā)富含GLUT4的小泡以胞吐的形式向細胞表面轉位，促進葡萄糖的攝取，從而增加葡萄糖的轉運，維持機體內(nèi)葡萄糖的穩(wěn)態(tài)［23-26］。本試驗發(fā)現(xiàn)IRmRNA相對表達豐度主要在出生1和30日齡時出現(xiàn)高峰期，這可能與其生理需求有關，出生和斷奶應激仔豬表現(xiàn)出高水平的胰島素敏感性，進而使IR高度表達，這樣有助于加快骨骼肌GLUT4跨膜轉運，從而促進葡萄糖轉運進入肌細胞，滿足骨骼肌的能量代謝需要，進而維持血糖平衡。

正常的GLUT4表達依賴于正常的胰島素水平和胰島素敏感性。體外試驗表明，胰島素孵育骨骼肌，GLUT4 mRNA表達增加25%［27］。胰島素敏感性缺乏的動物出現(xiàn)GLUT4轉錄水平的抑制，其原因可能在于調(diào)控區(qū)域的活性下降。Seraphim等［28］研究發(fā)現(xiàn)12月齡肥胖鼠發(fā)生胰島素耐受現(xiàn)象，其脂肪組織GLUT4 mRNA和蛋白均顯著低于2月齡正常小鼠，而肌肉中GLUT4 mRNA顯著增加，GLUT4蛋白水平?jīng)]有發(fā)生改變，這可能與GLUT4 mRNA poly（A）尾巴減少約80個A堿基有關。本試驗中藍塘和長白豬3個部位骨骼肌GLUT4 mRNA相對表達豐度高峰期均未表現(xiàn)出與IR一致，這揭示了GLUT4相對表達豐度的高低并不能完全反映出胰島素敏感性。

4 結 論

①不同品種豬骨骼肌GLUT1 mRNA的表達存在相似的發(fā)育變化規(guī)律，GLUT4 mRNA的表達存在顯著差異。

②不同生理階段豬骨骼肌GLUT1、GLUT4以及IRmRNA的表達均存在差異。剛出生時豬骨骼肌GLUT1 mRNA的相對表達豐度顯著高于其他生理階段，而IRmRNA的相對表達豐度在出生和斷奶時相比其他生理階段更高。

③豬骨骼肌GLUT4 mRNA與其IRmRNA的表達不具有完全的一致性，僅在仔豬斷奶時兩者的表達均處于較高水平，IR高度表達使GLUT4表達升高可能與胰島素信號傳導通路有關。

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Ontogenetic Regulation of Glucose Transporter and Insulin Receptor mRNA Expression in Skeletal Muscle of Different Kinds of Pigs at Different Physiological Stages

LIU Wenzuo ZUO Jianjun DAI Fawen YE Hui CAO Qingyun ZHOU Xiangyan ZOU Shigeng HUANG Zhiyi ZHI Aimin FENG Dingyuan?
（College of Animal Science，South China Agricultural University，Guangzhou510642，China）

This experiment was conducted to determine the ontogenetic regulation of glucose transporter（GLUT）1，GLUT4 and insulin receptor（IR）mRNA expression in skeletal muscle of different kinds of pigs at different physiological stages.Lantang（LT）and Landrace（LD）pigs at the age of 1，7，30，60，90 and 150 days were selected to determine the expression patterns ofGLUT1 andGLUT4 at different skeletal muscle tissues including longissimus dorsi muscles（LM），semimembranosus muscles（SM）and semitendinosus muscles（SD）by the method of real-time semiquantitative PCR for cDNA templates.The results showed as follows：1）LT and LD pigs exhibited similar development of mRNA expressions ofGLUT1 in the LM，SM and SD from 1 to 150 days of age with the highest level at the age of 1 day.2）LT and LD pigs exhibited waveform variations of mRNA relative expression abundance ofGLUT4 from 1 to 150 days of age with breed differences in the speed and extend of variations.At the age of 1 and 150 days，the mRNA relative expression abundance ofGLUT4 in the LM of LT pig was lower than that of LD pig with the same age（P＞0.05），while was higher than that of LD pig with the same age of the rest days（P＞0.05）.3）LT and LD pigs exhibited higher level of the mRNA relative expression abundance ofIRin the LM，SM and SD at the age of 1 and 30 days，while there were not significant difference among 7，60，90 and 150 days of age（P＞0.05）.There was no significant difference in mRNA relative expression abundance ofIRbetween LT and LD pigs with the same ages（P＞0.05）.The results suggest thatGLUT1 mRNA expression in skeletal muscles of pigs can be regulated by physiological stages，whileGLUT4 mRNA expression is not only differentially regulated by breeds but also differentially distributed in physiological stages，and the expression level ofGLUT4 is weakly related to theIRmRNA expression and shows no apparent rules.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2017，29（2）：605-612］

pigs；physiological stages；glucose transporter 1；glucose transporter 4；insulin receptor；ontogenetic regulation

S828

A

1006-267X（2017）02-0605-08

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.02.029

（責任編輯 田艷明）

2016-07-28

國家重點基礎研究發(fā)展計劃項目（2012CB124701）；廣東省科技計劃項目（2016A020210104）；廣州市科技計劃項目（201510010258）

劉文佐（1991—），男，湖北仙桃人，碩士研究生，從事動物營養(yǎng)與飼料科學研究。E-mail：lwz698631＠sina.com

?通信作者：馮定遠，教授，博士生導師，E-mail：fengdy＠scau.edu.cn

?Corresponding author，professor，E-mail：fengdy＠scau.edu.cn