鄭鵬斌　萬(wàn)晨光　馮學(xué)泉++馬景鑑　陳立　唐纓　牛寧寧　史源

【摘要】 目的：探討“漸進(jìn)式”顱內(nèi)加壓法誘導(dǎo)豬腦死亡對(duì)血清中ET-1、TNF-α、IL-1β及IL-6表達(dá)的影響。方法：雄性長(zhǎng)白豬12頭，隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組：顱內(nèi)置入顱內(nèi)壓探頭及水囊導(dǎo)管，但不進(jìn)行顱內(nèi)加壓；腦死亡組：顱內(nèi)置入顱內(nèi)壓探頭及水囊導(dǎo)管，根據(jù)顱內(nèi)壓和平均動(dòng)脈壓的關(guān)系，調(diào)整加壓強(qiáng)度建立腦死亡模型，并通過(guò)呼吸、循環(huán)維持腦死亡狀態(tài)12 h，并檢測(cè)血清ET-1、TNF-α、IL-1β及IL-6水平。結(jié)果：腦死亡組ET-1水平從腦死亡0 h即逐漸升高，TNF-α、IL-1β、IL-6從腦死亡后6 h開(kāi)始升高，上述因子水平與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：腦死亡時(shí)TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子升高相對(duì)遲緩，而ET-1水平發(fā)生變化較早，靈敏度高，這可能與其作為前炎癥介質(zhì)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 腦死亡； 炎癥因子； 內(nèi)皮素-1

Preliminary Study of Effect of Brain Death on Serum ET-1，TNF-α，IL-1β and IL-6 Expression in Pigs/ZHENG Peng-bin，WAN Chen-guang，F(xiàn)ENG Xue-quan，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（35）：006-010

【Abstract】 Objective：To investigate the influence of brain dead induced by “progressive” intracranial compression on the expression of ET-1，TNF-α，IL-1βand IL-6 in serum.Method：Twelve male Landraces were randomly assigned into two groups，the control group：intracranial pressure probe and a fogarty catheter were placed intracranially，but without compression.And the brain-dead group：intracranial pressure probe and a fogarty catheter were placed intracranially，according to the relationship between intracranial pressure and mean arterial pressure，adjust the intensity of intracranial compression to establish the brain death model，and through the respiration and circulation to maintain brain death status 12 h.The serum levels of ET-1，TNF-α，IL-1β，IL-6 were detected by radioimmunological analyzer.Result：The serum level of ET-1 in the brain death group was gradually increased from the beginning of brain death，TNF-α，IL-1β，IL-6 increased from 6 h after brain death，and the above factors were significantly different compared with those in the control group（P<0.05）.Conclusion：The results of this experiment show that in brain death TNF-α，IL-1β，IL-6 and other cytokines increased relatively slow，but ET-1 levels changes earlier with high sensitivity，which may be related to as proinflammatory mediators.

【Key words】 Brain death； Inflammatory factor； ET-1

First-authors address：The First Central Clinical College of Tianjin Medical University，Tianjin 300192，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.35.002

腦死亡是一個(gè)極其復(fù)雜的病理生理過(guò)程，且涉及多系統(tǒng)、器官。在分子水平探求該過(guò)程中某些因子的變化，有助于揭示腦死亡的分子病理機(jī)制，無(wú)論對(duì)重型顱腦損傷的救治還是腦死亡器官移植供體的保護(hù)，均具有重要的理論價(jià)值[1-2]。研究表明，腦死亡可激發(fā)機(jī)體發(fā)生急性非特異性炎癥反應(yīng)從而影響著各個(gè)器官的功能，即腦死亡狀態(tài)下，細(xì)胞介質(zhì)大量釋放及免疫功能的過(guò)度激活是腦死亡從局部病變迅速發(fā)展為全身急性炎癥反應(yīng)綜合征，進(jìn)而引起多系統(tǒng)器官衰竭的重要機(jī)制[3-4]。本研究旨在初步探討腦死亡對(duì)一些常見(jiàn)炎癥因子表達(dá)的影響，為模擬臨床常見(jiàn)腦損傷情況，本實(shí)驗(yàn)采取在實(shí)時(shí)顱內(nèi)壓監(jiān)測(cè)下“漸進(jìn)式”顱內(nèi)加壓法誘導(dǎo)豬腦死亡，并檢測(cè)血清中炎癥介質(zhì)（包括ET-1、TNF-α、IL-1β、IL-6）的表達(dá)水平及其變化規(guī)律，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康清潔雄性長(zhǎng)白豬12頭，體重（39.6±5.2）kg。隨機(jī)均分為兩組，即對(duì)照組（A組）：顱內(nèi)置入顱內(nèi)壓探頭及水囊導(dǎo)管，但不進(jìn)行顱內(nèi)加壓；腦死亡組（B組）：顱內(nèi)置入顱內(nèi)壓探頭及水囊導(dǎo)管，根據(jù)顱內(nèi)壓（ICP）和平均動(dòng)脈壓（MAP）的關(guān)系，調(diào)整顱內(nèi)加壓強(qiáng)度建立腦死亡模型，并通過(guò)呼吸、循環(huán)維持腦死亡狀態(tài)12 h。

1.2 主要試劑及儀器 ET-1、TNF-α、IL-1β、IL-6的ELISA試劑盒，MP150 16通道生理信號(hào)記錄分析儀，顱內(nèi)壓監(jiān)護(hù)儀，顱內(nèi)壓監(jiān)測(cè)探頭，多功能呼吸麻醉機(jī)，F(xiàn)oley 14F水囊導(dǎo)管。

1.3 麻醉方法 術(shù)前禁食12 h，禁水6 h。麻醉開(kāi)始前10 min臀大肌肌肉注射地西泮0.4 mg/kg、阿托品0.03 g/kg、鹽酸胺碘酮15 g/kg行基礎(chǔ)麻醉，豬仰臥位固定，行氣管插管并連接多功能麻醉機(jī)（通氣參數(shù)：潮氣量9～13 mL/kg，吸氧濃度50%～90%，吸呼比1∶2，呼吸頻率15～20次/min，以2%～3%濃度的七氟烷持續(xù)麻醉，并間斷靜注維庫(kù)溴銨維持肌肉松弛。尾脫毛連氧飽和探頭。

1.4 術(shù)中監(jiān)測(cè) 麻醉滿意后立即連接多功能監(jiān)護(hù)儀監(jiān)測(cè)心率（HR）和脈搏血氧飽和度。頸部手術(shù)暴露左側(cè)頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)靜脈和右側(cè)頸外靜脈之后，分別穿刺置管，并且建立有創(chuàng)動(dòng)脈壓（IABP）、中心靜脈壓（CVP）檢測(cè)及補(bǔ)液通路。膀胱造瘺置尿管接尿袋并固定。

1.5 模型建立 對(duì)Pratschke等[5]采用經(jīng)典腦死亡模型進(jìn)行改良，在實(shí)時(shí)顱內(nèi)壓監(jiān)測(cè)條件下，建立穩(wěn)定的豬腦死亡模型[6]。具體步驟如下：俯臥位固定豬，于雙眼連線與矢狀線交點(diǎn)后1 cm處行顱骨錐孔直徑約2 cm，分離硬腦膜，F(xiàn)oley 14F水囊導(dǎo)管置于硬腦膜外并連接壓力注射泵以備注水加壓。于置水囊導(dǎo)管孔后2 cm左側(cè)旁開(kāi)1.5 cm處再行顱骨錐孔并置入Codman顱內(nèi)壓監(jiān)測(cè)探頭，外接ICP監(jiān)護(hù)儀。于左右眶緣后2 cm處對(duì)稱置入2支電極，參考電極固定在豬耳緣上并連接腦電圖機(jī)，記錄豬腦電（EEG）變化。然后以2.0 mL/min經(jīng)Foley 14F水囊導(dǎo)管行顱內(nèi)加壓，直至ICP持續(xù)大于MAP，停止注水加壓，60 min后停止所有麻醉維持藥物，繼續(xù)觀察EEG并初步判定是否腦死亡。

1.6 腦死亡判定標(biāo)準(zhǔn) 參考《腦死亡判定標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)規(guī)范（成人質(zhì)控版）》[7]擬定豬腦死亡判定標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）深昏迷，排除麻醉、低溫等導(dǎo)致的可逆性昏迷；（2）瞳孔對(duì)光反射、角膜反射均消失；（3）激發(fā)試驗(yàn)證實(shí)無(wú)自主呼吸，靠呼吸機(jī)維持通氣；（4）腦電圖呈靜息電位。

1.7 腦死亡狀態(tài)維持 根據(jù)血流動(dòng)力學(xué)、出入量、血氧飽和度等變化給予對(duì)癥處理，維持豬腦死亡狀態(tài)生命體征接近臨床腦死亡供體的要求[8-9]，即MAP>60 mm Hg，CVP 10～12 mm Hg，血氧飽和度≥95%，體溫≥35 ℃。

1.8 觀察指標(biāo) 于顱內(nèi)加壓前（T1）、腦死亡0 h（T2）、腦死亡1 h（T3）、腦死亡3 h（T4）、腦死亡6 h（T5）、腦死亡后12 h（T6）6個(gè)時(shí)間點(diǎn)采血，靜置離心后留取血清，置于-80 ℃保存待測(cè)。由廣州瑞博生物科技有限公司檢測(cè)各組樣本血清中ET-1、TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組動(dòng)物MAP與ICP變化 在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，A組動(dòng)物MAP和ICP變化小，各時(shí)間點(diǎn)間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；顱內(nèi)加壓前，兩組MAP比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；顱內(nèi)加壓過(guò)程中，B組因ICP增高出現(xiàn)Cushing反應(yīng)，且MAP較A組明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；腦死亡狀態(tài)下，B組MAP雖然較A組有所降低，但兩組比較差異無(wú)統(tǒng)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1和2。

2.2 兩組血清ET-1、TNF-α、IL-1β、IL-6水平變化 在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，B組血清ET-1水平在腦死亡時(shí)開(kāi)始升高，然而血清TNF-α、IL-1β、IL-6在腦死亡后6 h才開(kāi)始升高，且上述介質(zhì)水平與A組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；B組相鄰時(shí)間點(diǎn)各炎癥介質(zhì)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。A組血清各炎癥介質(zhì)水平變化差異小，各時(shí)間點(diǎn)間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表3～6。

3 討論

目前，動(dòng)物腦死亡模型建立方法很多（如硬腦膜外加壓法、顱內(nèi)制造血腫法、頸內(nèi)動(dòng)脈結(jié)扎法等），但應(yīng)用最廣泛的是顱內(nèi)加壓法建立的腦死亡模型，而顱內(nèi)加壓方式又分為爆發(fā)式[10]和漸進(jìn)式[5]。爆發(fā)式腦死亡模型是指在極短時(shí)間內(nèi)迅速加壓直至腦死亡，該模型常常導(dǎo)致難治性低血壓而使動(dòng)物腦死亡狀態(tài)無(wú)法長(zhǎng)時(shí)間維持。而經(jīng)典的Pratschke漸進(jìn)式腦死亡模型是指根據(jù)血流動(dòng)力學(xué)變化緩慢間斷的進(jìn)行顱內(nèi)加壓逐漸導(dǎo)致腦死亡。大量統(tǒng)計(jì)表明，臨床腦死亡患者不管是腦血管意外還是重型顱腦損傷所導(dǎo)致的顱內(nèi)持續(xù)高壓通常不是在短時(shí)間內(nèi)造成的，而是在較長(zhǎng)的一段時(shí)間后逐漸形成的。因此，改良的緩慢間斷顱內(nèi)加壓法與臨床腦死亡的發(fā)生發(fā)展最為相似，而本研究是對(duì)Pratschke等采用的經(jīng)典腦死亡模型進(jìn)行改良[2]，在實(shí)時(shí)顱內(nèi)壓監(jiān)測(cè)條件下，建立穩(wěn)定的豬腦死亡模型，即在建立模型過(guò)程中，使顱內(nèi)壓不低于平均動(dòng)脈壓，導(dǎo)致腦血流量灌注嚴(yán)重不足，引起腦代謝障礙和腦脊液循環(huán)障礙，最終造成腦嚴(yán)重缺血缺氧及腦水腫而發(fā)生腦死亡。在顱內(nèi)壓增高過(guò)程中，腦組織因缺血缺氧等理化因素，刺激交感神經(jīng)合成和分泌大量?jī)翰璺影?，進(jìn)而引發(fā)“交感風(fēng)暴”，出現(xiàn)血壓增高、心率加快等現(xiàn)象，而后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)Cushing反應(yīng)[11]（即血壓升高、心跳減慢等），此時(shí)腦血流量自動(dòng)調(diào)節(jié)功能已喪失[10，12]。筆者發(fā)現(xiàn)在實(shí)時(shí)顱內(nèi)壓監(jiān)測(cè)狀態(tài)下建立的腦死亡模型無(wú)論是在建立模型中還是腦死亡狀態(tài)下的生命體征均較其他方法更加平穩(wěn)，這可能與在實(shí)時(shí)顱內(nèi)壓監(jiān)測(cè)條件下建立腦死亡模型時(shí)，根據(jù)顱內(nèi)壓和平均動(dòng)脈壓的變化調(diào)整顱內(nèi)加壓強(qiáng)度從而避免了因盲目加壓所造成的顱內(nèi)壓大幅度波動(dòng)有關(guān)。

腦死亡可促進(jìn)細(xì)胞介質(zhì)大量釋放及免疫功能的過(guò)度激活，而發(fā)生急性非特異性炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答反應(yīng)，導(dǎo)致腦死亡從局部病變迅速發(fā)展為全身炎癥綜合征，從而嚴(yán)重影響著腦死亡供體器官的功能及其移植的預(yù)后[2-3，13]。國(guó)外學(xué)者Skrabal等[1]在研究動(dòng)物腦死亡與炎癥介質(zhì)的關(guān)系時(shí)，發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-1β、IL-6在血清中均明顯升高，IL-1β、IL-6在心肺腎組織中均明顯升高，然而TNF-α僅在肺組織中顯著升高。Barklin[4]卻發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-6、IL-10在腦死亡組心肝腎組織中的表達(dá)水平和對(duì)照組比較無(wú)明顯差異。Amado等[14]在研究18例腦死亡患者血清炎癥介質(zhì)水平的變化規(guī)律時(shí)，發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-1β的表達(dá)水平無(wú)明顯，而IL-6的表達(dá)水平卻顯著升高。孫振濤等[15]和朱長(zhǎng)舉[16]通過(guò)采用改良的緩慢間斷顱內(nèi)加壓法建立腦死亡模型來(lái)研究豬腦死亡與炎癥的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-1β、IL-6在血清中的表達(dá)水平自腦死亡后3 h就已經(jīng)顯著升高了，而筆者在研究探討豬腦死亡與炎癥介質(zhì)的關(guān)系時(shí)，發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-1β、IL-6血清的表達(dá)水平自腦死亡后6 h才開(kāi)始逐漸升高。這可能是因?yàn)樵趯?shí)時(shí)顱內(nèi)壓監(jiān)測(cè)條件下建立腦死亡模型時(shí)，根據(jù)顱內(nèi)壓和平均動(dòng)脈壓的變化調(diào)整顱內(nèi)加壓強(qiáng)度，不僅避免了顱內(nèi)壓升高過(guò)快或過(guò)高所造成不必要的腦組織損傷，而且避免了因顱內(nèi)壓波動(dòng)過(guò)度造成的血流動(dòng)力學(xué)的大幅度波動(dòng)有關(guān)，因?yàn)樯鲜鰞烧呔蓪?dǎo)致機(jī)體血流動(dòng)力學(xué)紊亂，各個(gè)組織器官灌注不足等進(jìn)而發(fā)生炎癥反應(yīng)。

除了TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥反應(yīng)常見(jiàn)檢測(cè)指標(biāo)，筆者對(duì)最強(qiáng)的縮血管活性肽，內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1），也進(jìn)行了檢測(cè)。ET-1是由21個(gè)氨基酸組成的，主要由內(nèi)皮細(xì)胞合成和分泌，也廣泛存在于各個(gè)臟器組織細(xì)胞內(nèi)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)ET-1在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著不可取代的促炎作用。Foitzik等[17]和Paulino等[18]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮素可介導(dǎo)小鼠體內(nèi)的單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等合成和分泌大量炎癥介質(zhì)，誘導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)以及多器官功能衰竭。黃瑩等[19]在重癥急性胰腺炎SD大鼠模型中發(fā)現(xiàn)血清內(nèi)皮素水平顯著升高。李莉等[20]在研究腦死亡大鼠肝功能時(shí)發(fā)現(xiàn)血清ET-1在腦死亡時(shí)就開(kāi)始升高，并隨著腦死亡時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高。筆者在研究探討豬腦死亡血清ET-1水平的變化時(shí)，發(fā)現(xiàn)血清ET-1水平在判定腦死亡時(shí)就已經(jīng)明顯升高，而且較TNF-α、IL-1β、IL-6等典型炎癥因子水平升高提前，這是因?yàn)樵陲B內(nèi)壓增高過(guò)程中，動(dòng)物發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)促進(jìn)ET-1分泌，而ET-1又作為前炎癥因子可誘導(dǎo)白細(xì)胞等合成和分泌炎癥介質(zhì)而激發(fā)急性非特異性炎癥反應(yīng)，同時(shí)這些炎癥介質(zhì)又可通過(guò)正反饋?zhàn)饔么龠M(jìn)ET-1的合成和分泌以及誘導(dǎo)其他多種炎癥介質(zhì)的分泌，可見(jiàn)ET-1用于檢測(cè)腦死亡所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)較其他炎癥介質(zhì)更靈敏。

綜上所述，腦死亡時(shí)炎癥反應(yīng)及炎癥因子表達(dá)與腦死亡過(guò)程的快、慢密切相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)采取實(shí)時(shí)顱內(nèi)壓監(jiān)測(cè)下“漸進(jìn)式”顱內(nèi)加壓法建立的腦死亡模型不僅更加穩(wěn)定，而且急性非特異性炎癥反應(yīng)發(fā)生相對(duì)遲緩且較輕。就本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的指標(biāo)而言，TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子升高相對(duì)遲緩，ET-1水平升高較早，靈敏度高，這可能與其作為前炎癥介質(zhì)有關(guān)。

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（收稿日期：2016-11-16） （本文編輯：程旭然）