陳立強(qiáng)，王洋洋，司艷輝，梁潔玲，李海珠

(肇慶市第一人民醫(yī)院，廣東 肇慶 526060)

核苷酸在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸不能自由穿過(guò)細(xì)胞膜，其儲(chǔ)存與運(yùn)輸必須以囊泡運(yùn)輸?shù)姆绞竭M(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，當(dāng)囊泡與胞膜融合時(shí)將核苷酸等內(nèi)容物質(zhì)釋放到細(xì)胞外[1]。要探討細(xì)胞外核苷酸/核苷激發(fā)的信號(hào)通路，就必須要理解三磷酸腺苷(ATP)和其他核酸是如何從細(xì)胞內(nèi)釋放出來(lái)的，而這也是生理學(xué)上的一個(gè)重要問(wèn)題[2]；自從囊泡膜核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(vesicular nucleotide transporter，VNUT)被發(fā)現(xiàn)，其就作為ATP轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵因子而被廣泛關(guān)注[3]；現(xiàn)將VNUT在核苷酸囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究最新進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 VNUT

神經(jīng)內(nèi)分泌信號(hào)的傳達(dá)需要大量不同種類(lèi)的囊泡儲(chǔ)存信號(hào)分子參與和調(diào)節(jié)。這些非肽類(lèi)復(fù)合物的儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)運(yùn)都必須通過(guò)特定的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行運(yùn)輸，所有這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白都屬于溶質(zhì)載體蛋白家族(solute carrier family，SLC)[4]。研究表明囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)體內(nèi)包含多種神經(jīng)遞質(zhì)而每種神經(jīng)遞質(zhì)都需要特定的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，而且囊泡里面還包含ATP和大量不同種類(lèi)的核苷酸，囊泡內(nèi)各種生物成分的相互作用，共同完成信號(hào)的激發(fā)和傳播。囊泡一旦釋放，囊泡內(nèi)儲(chǔ)存的ATP和核苷酸分子會(huì)與囊泡分泌細(xì)胞或者相鄰細(xì)胞表面的特定P2X離子通道性受體或者P2Y代謝型受體相結(jié)合并產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)[5]。

VNUT屬于solute carrier family 17 member 9(SLC17A9)，其定位于不同的ATP貯存器的囊泡膜上(如嗜鉻顆粒和突觸囊泡等)。VNUT通過(guò)由液泡膜質(zhì)子泵產(chǎn)生囊泡膜電位差，形成的作用力從而主動(dòng)運(yùn)輸ATP。VNUT特點(diǎn)是包括：(1)VNUT在轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡中大量存在；(2)VNUT的抑制劑可使ATP的轉(zhuǎn)運(yùn)受到嚴(yán)重影響；(3)利用小干擾RNA對(duì)VNUT進(jìn)行基因敲除可減少細(xì)胞ATP的分泌[6]；VNUT是由430個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)分子，該蛋白分子有12個(gè)跨膜區(qū)間并且蛋白N和C末端都定位在細(xì)胞內(nèi)。對(duì)VNUT進(jìn)行熒光標(biāo)識(shí)定位發(fā)現(xiàn)其與突觸結(jié)合蛋白之間均存在于囊泡膜的相同位置，顯示兩種蛋白在囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)中可能相互連接并共同完成囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)和釋放過(guò)程。通過(guò)小干擾RNA技術(shù)對(duì)VNUT蛋白進(jìn)行敲除，可明顯減少KCl誘導(dǎo)的ATP的分泌反應(yīng)[7]。運(yùn)用分子檢測(cè)技術(shù)對(duì)VNUT蛋白的深入研究，發(fā)現(xiàn)VNUT在胃、腸道、肝臟、肺部、骨骼肌、甲狀腺、脾、血細(xì)胞、上皮細(xì)胞和角化細(xì)胞中均有表達(dá)，顯示VNUT調(diào)節(jié)活性分子進(jìn)入分泌囊泡的生物反應(yīng)不僅僅存在于腦組織和神經(jīng)內(nèi)分泌組織中，故VNUT在許多細(xì)胞和組織包裝ATP進(jìn)入分泌囊泡和釋放過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[8]。

2 核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制

人類(lèi)基因組至少有19種含有嘌呤受體的核苷酸/核苷激活細(xì)胞存在，一旦嘌呤受體激活，可激活受體下游信號(hào)通路而引起一系列機(jī)體的生理反應(yīng)。嘌呤受體包括三個(gè)亞型，分別是(1)ATP門(mén)控離子通道P2X受體；(2)G蛋白偶聯(lián)P2Y受體，該受體可與ATP、ADP、UTP、UDP和糖化UDP相結(jié)合；(3)G蛋白偶聯(lián)腺苷酸受體；該類(lèi)受體在ATP的催化、轉(zhuǎn)換和合成ADP、UDP和腺苷酸的過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[9]。ATP、神經(jīng)遞質(zhì)和其他活性分子在神經(jīng)內(nèi)分泌組織和細(xì)胞中是以囊泡形式進(jìn)行儲(chǔ)存和釋放的，包囊物質(zhì)通過(guò)電化學(xué)電位梯度(Δψ)和囊泡膜鑲嵌的V-type H+-ATPase (V/H+-ATPase) 提供pH梯度產(chǎn)生的作用力進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。例如交感節(jié)前神經(jīng)元嗜鉻細(xì)胞在依賴鈣離子的情況下利用梯度作用力將囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)至胞膜，當(dāng)細(xì)胞接收到釋放信號(hào)，囊泡會(huì)與胞膜融合而釋放囊泡內(nèi)的信號(hào)物質(zhì)到細(xì)胞外[10]。另外，研究顯示ATP的囊泡釋放過(guò)程存在于許多細(xì)胞，例如胰腺腺泡細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞、胰腺β細(xì)胞和其他外分泌或內(nèi)分泌組織。囊泡的分泌過(guò)程需要有可溶性N-乙基馬來(lái)酰亞胺敏感因子附著蛋白受體(soluble N-ethyl maleimidesensitive factor attachment protein receptor，SNARE)受體蛋白家族共同完成的，v-SNARE和t-SNARE受體家族會(huì)相互協(xié)調(diào)共同完成囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)、定位連接和融合[11]。SNARE的主要組成包括t-SNAREs突觸融合蛋白、SNAP-25和v-SNARE突觸囊泡蛋白(v-SNARE synaptobrevin，VAMP)。突觸融合復(fù)合物的初始形成由突觸融合蛋白、SNAP-25和突觸囊泡蛋白；此外還需要其他蛋白的共同參與，包括Rabs和Muncs等蛋白，這些蛋白復(fù)合體共同形成SNARE的構(gòu)成[12]。在神經(jīng)遞質(zhì)釋放的后期，突觸融合蛋白/SNAP 25復(fù)合體會(huì)與突觸囊泡蛋白結(jié)合，在依賴Ca2+的情況下，激發(fā)突觸囊泡蛋白向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移且與胞膜融合，囊泡膜融合并釋放神經(jīng)遞質(zhì)[13]。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)移胞質(zhì)的ATP進(jìn)入分泌囊泡和通過(guò)囊泡和胞質(zhì)的融合將囊泡內(nèi)容物分泌到細(xì)胞外。

3 VNUT參與核苷酸囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)

組織和細(xì)胞在ATP的分泌過(guò)程中VNUT充當(dāng)著重要角色存在，例如T細(xì)胞受體(T cell receptors，TCR)被激活可導(dǎo)致淋巴細(xì)胞快速并大量分泌ATP，ATP的大量釋放可激活P2X受體誘導(dǎo)的生理反應(yīng)，如細(xì)胞增殖等[14]。通過(guò)利用巴佛洛霉素A1對(duì)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)和釋放進(jìn)行抑制，可發(fā)現(xiàn)TCR在依賴Ca2+的情況下誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞分泌ATP的機(jī)制受到嚴(yán)重影響；另外對(duì)VNUT基因進(jìn)行敲除，可發(fā)現(xiàn)TCR誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞分泌ATP會(huì)明顯下降。大量研究表明，VNUT在不同組織中對(duì)ATP轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌均起到關(guān)鍵作用，例如在星形膠質(zhì)細(xì)胞、肝細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞A549和腸系膜上皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞和食管角質(zhì)形成細(xì)胞等都有相關(guān)研究報(bào)道[15]；通過(guò)利用這些ATP存量豐富的細(xì)胞系的試驗(yàn)，更能體現(xiàn)ATP的儲(chǔ)存和釋放過(guò)程VNUT扮演的角色和價(jià)值。

在許多細(xì)胞中，ATP不通過(guò)囊泡運(yùn)輸進(jìn)行釋放，而且巴佛洛霉素A1對(duì)這類(lèi)細(xì)胞ATP釋放的抑制作用不明顯；而利用阻礙囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)和融合的囊泡抑制劑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行作用，發(fā)現(xiàn)該類(lèi)抑制劑對(duì)細(xì)胞ATP的釋放亦不產(chǎn)生影響[16]。多藥耐藥基因(multidrug resistance，MDR-1)蛋白，Cl-跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)器(CF transmembrane conductance regulator，CFTR)，線粒體電壓依賴性陰離子通道-1( mitochondrial voltage-dep -endent anion channel-1，VDAC -1)被認(rèn)為是激發(fā)ATP釋放的通路或者促進(jìn)了ATP的釋放，對(duì)這類(lèi)蛋白的深入研究有利于了解ATP釋放信號(hào)激發(fā)和傳導(dǎo)過(guò)程，為準(zhǔn)確描述ATP信號(hào)通路提供有價(jià)值的素材。研究表明ATP的轉(zhuǎn)運(yùn)與釋放與兩種質(zhì)膜通道相關(guān)，一是Cl-離子通道，例如maxi陰離子通道電壓門(mén)控通道等；二是孔型連接蛋白、泛連接蛋白Pannexins家族和 P2X7受體等[17]。在胰腺腺泡細(xì)胞中，ATP與胰腺消化酶共同儲(chǔ)存于囊泡細(xì)胞，在受到釋放信號(hào)的刺激下，ATP與胰腺酶原顆粒(zymogen granules，ZG)一起釋放到腺泡細(xì)胞外；而在ATP轉(zhuǎn)運(yùn)到ZG的分子動(dòng)力學(xué)和藥理學(xué)特性的研究中表明ATP必須VNUT的參與與調(diào)節(jié)。例如，ATP的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)會(huì)被巴佛洛霉素A1抑制和通過(guò)Cl-誘導(dǎo)激發(fā)，同時(shí)表現(xiàn)出KM通道和pH通道的依賴性，這些分子特性都與VNUT的生理特性一致，而且通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)顯示在分離的ZG中，VNUT表現(xiàn)出很強(qiáng)的免疫反應(yīng)性[18]。

研究表明有許多蛋白參與ATP傳導(dǎo)通道，包括Panx 1和連接蛋白(connexins，Cx)可協(xié)助ATP和UDP從胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外；VNUT負(fù)責(zé)將ATP轉(zhuǎn)運(yùn)到儲(chǔ)存囊泡內(nèi)，在Ca2+通道激發(fā)狀態(tài)下協(xié)助分泌囊泡與薄膜融合并釋放ATP。UDP-葡萄糖(UDPG)和ATP可通過(guò)位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/高爾基體的類(lèi)似于SLC-35轉(zhuǎn)運(yùn)體的協(xié)助下，分別利用UMP和AMP作為逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體的底物而逆向轉(zhuǎn)運(yùn)到分泌通路中。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/高爾基體核苷酸進(jìn)行糖基化反應(yīng)并產(chǎn)生能量驅(qū)動(dòng)作用，該驅(qū)動(dòng)作用力為囊泡運(yùn)輸提供能量來(lái)源，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/高爾基體的代謝分子也能通過(guò)囊泡分泌旁路伴隨核苷酸共同分泌到胞質(zhì)中或者細(xì)胞外[19]。利用基因敲除技術(shù)對(duì)VNUT基因進(jìn)行敲除，發(fā)現(xiàn)ATP的囊泡儲(chǔ)存與釋放受到了嚴(yán)重影響，ATP胞外釋放的量嚴(yán)重減少，從而認(rèn)證了VNUT在ATP轉(zhuǎn)運(yùn)到囊泡和囊泡ATP的胞外釋放過(guò)程中均發(fā)揮著關(guān)鍵作用[20]。

4 小結(jié)

VNUT參與核苷酸囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程且發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其作用一是在核苷酸的囊泡內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)儲(chǔ)存，為囊泡的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸提供能量支持；其二是ATP等高能分子的釋放可激活一系列的細(xì)胞信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[21]。對(duì)VNUT蛋白及其調(diào)控因素的深入研究，有利于更加深入了解VNUT蛋白在囊泡運(yùn)輸未知的相關(guān)機(jī)制，從而為揭示囊泡運(yùn)輸過(guò)程提供更為可靠的科學(xué)依據(jù)。

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