曲朋濤 （山東省煙臺市萊州市土山畜牧獸醫(yī)站 261400)

雞致病性大腸桿菌的分離鑒定與藥敏試驗研究

曲朋濤 （山東省煙臺市萊州市土山畜牧獸醫(yī)站 261400)

本文主要介紹了山東省煙臺市(萊州、海陽、萊陽、龍口、招遠等地)各雞場近一年來發(fā)生的雞致病性大腸桿菌所進行的實驗室試驗。試驗通過收集萊州市畜牧局禽病門診臨床診斷為大腸桿菌病的雞群作為病料，進行分離培養(yǎng)、生化鑒定、動物試驗。并對本菌做了藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)該菌對頭孢噻呋鈉、阿米卡星、左旋氧氟沙星、氟苯尼考等藥物有較高的敏感性，而對四環(huán)素、鏈霉素、阿莫西林等藥物的敏感性較低。在生產(chǎn)實踐中具有很好的臨床指導意義。

雞致病性大腸桿菌 分離鑒定 藥敏試驗

雞大腸桿菌病是由致病性血清型的埃希氏大腸桿菌引起的一類傳染病的總稱。本病的感染途徑很多，主要通過消化道和呼吸道感染，也可通過種蛋垂直傳播等，臨床上可引起急性敗血癥、眼炎、心包炎、肝周炎、輸卵管炎、氣囊炎、關節(jié)炎等多種病型。近年來，隨著集約化養(yǎng)禽業(yè)的迅速發(fā)展，在一些養(yǎng)殖密集區(qū)廣泛流行，個別地方已呈爆發(fā)流行的趨勢，發(fā)病率有時可高達60%左右，死亡率在40%不等，該病已成為困擾養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展的主要疫病之一。

本試驗通過對細菌的分離培養(yǎng)、生化試驗、動物試驗、藥敏試驗等一系列細菌生物學試驗，來分析研究本地區(qū)養(yǎng)雞場內(nèi)常發(fā)生的大腸桿菌病，并深入了解其發(fā)病機理、病原特性以及預防機制，以便獲得更好的臨床應用效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 所有病料均來自于萊州市畜牧局禽病門診日常診斷病例，初步確診為大腸桿菌病的病雞76只，其中肉仔雞、蛋雛雞48只，育成雞28只。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑 麥康凱瓊脂(NA)、伊紅美蘭瓊脂、普通肉湯、營養(yǎng)瓊脂(NA)(均購自上海伯奧生物科技有限公)；硝酸鹽還原劑、氧化酶試劑、微量生化試驗管、藥敏紙片購自(均購自杭州天和微生物試劑有限公司)。

1.1.3 試驗動物 各日齡健康雞(購自山東濟南SPF種雞場)。

1.1.4 儀器及設備 光學顯微鏡、恒溫箱、高壓滅菌器、無菌實驗臺、微量移液器等

1.2 方法

1.2.1 大腸桿菌的分離培養(yǎng) 以無菌操作的方法，采取病死雞的肝、脾、心包液、氣囊膜等處病料，劃線于麥康凱瓊脂上，37℃培養(yǎng)24～48h挑取紅色單個菌落劃線接種于伊紅美藍瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18～24h，挑取紫黑色帶金屬光澤的單個菌落接種于普通肉湯和普通瓊脂斜面，37℃培養(yǎng)18～24h，用石蠟膠塞密封，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 形態(tài)學觀察 取伊紅美藍瓊脂平板上紫黑色帶金屬光澤的單個菌落涂片，革蘭氏染色鏡檢，觀察記錄菌體形態(tài)和染色特征。

1.2.3 生化鑒定 取微量生化管及各種生化培養(yǎng)基，將分離菌純培養(yǎng)物的菌種接入后封口，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h，觀察結(jié)果。

1.2.4 致病性試驗 將分離到的大腸桿菌接種普通肉湯培養(yǎng)物，37℃培養(yǎng)24h。經(jīng)測定每毫升肉湯培養(yǎng)物約含1×109CFU。按每株菌3只(5日齡健康非免疫雛雞)，頸部皮下注射0.2ml/只。對照組6只頸部皮下注射滅菌肉湯。及時剖檢死亡雞，分離細菌。判定標準:能使試驗雞在24h內(nèi)全部死亡或在48h內(nèi)死亡2/3以上的菌株作為致病菌株。

1.2.5 藥敏試驗 將獲得的致病菌株的菌液，均勻涂抹于營養(yǎng)瓊脂平板，每菌株兩板，然后將藥敏紙片平均分布，37℃培養(yǎng)24h。

2 結(jié)果

2.1 大腸桿菌的分離培養(yǎng)

麥康凱瓊脂上形成紅色、圓形隆起、光滑濕潤、邊緣整齊、直徑為1.5～2.5mm的小菌落;在伊紅美藍瓊脂上形成紫黑色、具有金屬光澤的小菌落;在普通瓊脂斜面上的菌落為灰白色;在普通肉湯中呈均勻渾濁，管底有灰白色沉淀，并有糞臭味。

2.2 形態(tài)學觀察

經(jīng)鏡檢可見到革蘭氏陰性，兩端鈍圓，長約1.5～3.0μm的短小桿菌，多單在，偶有2～3個菌體相連，無芽孢。

2.3 生化鑒定

將分離到的76個菌株，經(jīng)生化試驗鑒定，符合大腸桿菌特征見表1。

表1 分離菌生化試驗結(jié)果

2.4 致病性試驗

大部分雛雞6h以后開始出現(xiàn)癥狀，表現(xiàn)精神沉郁，食欲下降，多數(shù)出現(xiàn)腹瀉，有的出現(xiàn)神經(jīng)癥狀。接種12h后開始出現(xiàn)死亡。剖檢死亡雞，表現(xiàn)為典型大腸桿菌病病變，并從死亡雞病變組織均回收到相應接種致病菌株。在分離的76株菌中確認66株為致病性菌株，占分離菌株的87%。

2.5 藥敏試驗

其中對頭孢噻呋鈉、阿米卡星、左旋氧氟沙星、氟苯尼考敏感率達到83%以上，而四環(huán)素、鏈霉素、阿莫西林等藥物的敏感性較低。統(tǒng)計情況見表2。

表2 耐藥性實驗結(jié)果統(tǒng)計

抑菌圈直徑15.1～20mm者為高度敏感；直徑10.1～15mm者為中度敏感；直徑在l0mm以下者為耐藥。

3 討論

3.1 關于試驗結(jié)果

從畜牧局禽病門診日常疑似病例抽取的76只病雞中分離出76株菌株，涂片鏡檢、生化試驗等方法分離鑒定，均符合大腸桿菌特征，確定全部為大腸桿菌。經(jīng)致病性動物試驗，共66株菌為致病性大腸桿菌。說明本地區(qū)雞大腸桿菌的致病率與致死率都很高，需要本地區(qū)的養(yǎng)殖場及農(nóng)戶提高警惕與做好防范措施。

3.2 疫苗免疫

由于大腸桿菌血清型多，不同血清型抗原性不同，因此市場上的疫苗具有一定的局限性。在常發(fā)病的養(yǎng)禽場，可從本場病禽中分離出致病性的大腸桿菌，制成自家多價滅活疫苗。建議在雛雞7～15日齡、25～35日齡、120～140日齡各免疫一次。

3.3 藥物防治

藥敏試驗發(fā)現(xiàn)，本地區(qū)雞致病性大腸桿菌對頭孢噻呋鈉、阿米卡星、左旋氧氟沙星、氟苯尼考有較高的敏感性，可考慮投入臨床使用，而四環(huán)素、鏈霉素、阿莫西林等藥物的敏感性較低，該區(qū)養(yǎng)殖戶應慎用。該區(qū)養(yǎng)殖戶還應注意正確的用藥措施，長時間使用一種藥物易產(chǎn)生耐藥性。細菌耐性的發(fā)生和發(fā)展正是抗菌藥物廣泛應用，特別是濫用藥物的結(jié)果。因此廣大養(yǎng)殖戶在治療大腸桿菌病時必須注意用藥問題，加強抗菌藥物的質(zhì)量監(jiān)督，合理選用藥物，在有限的條件下盡量避免耐藥菌株的產(chǎn)生。所以選擇藥物時必須先進行藥敏試驗，應盡量采取“交替”的用藥方案，可在發(fā)病日齡前1～2d進行預防性投藥。近些年來，利用中草藥防治雞大腸桿菌病取得了明顯的效果。目前業(yè)內(nèi)已有報道，用清瘟敗毒散、復方黃連口服液、禽菌靈、大腸桿菌凈等藥物對大腸桿菌性腹瀉治愈率達80%以上，臨床效果比較理想。

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