劉 燕 荀來武* 鄭錦玲 馮 剛 彭 潔（云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院 云南 昆明 650212 玉溪農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院 云南 玉溪）

一株鵝源新城疫病毒分子特征和遺傳發(fā)生分析

劉 燕①荀來武*①鄭錦玲①馮 剛②彭 潔①（①云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院 云南 昆明 650212 ②玉溪農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院 云南 玉溪）

經(jīng)對2007年從昆明某鵝場疑似新城疫發(fā)病鵝體內(nèi)得到的病原進行分離鑒定，結(jié)果表明中國部分地區(qū)鵝群中已存在對鵝和雞等禽類具有較強致病性的NDV。該毒株經(jīng)毒力(MDT)檢測為強毒株，雞胚平均死亡時間為48～60h。RTPCR擴增出了融合蛋白(F)基因，測定相應(yīng)的核苷酸序列并進行遺傳發(fā)生分析和酶切位點分析，對基因編碼的氨基酸序列進行了推導，試驗毒株的蛋白酶裂解激活位點附近的氨基酸序列為112R(K)RQKR↓F117，為強毒特征序列。根據(jù)繪制的系統(tǒng)進化發(fā)生樹和F基因上限制性內(nèi)切酶(RE)位點分布，確定了這個毒株為基因Ⅶ型。以上證據(jù)表明該基因型的新城疫病毒在我國鵝群的流行占據(jù)一定的優(yōu)勢。

鵝 新城疫病毒 遺傳發(fā)生樹

新城疫(Newcastle disease，ND)是禽類的一種高度接觸性、烈性傳染病，曾多次造成世界范圍的大流行，給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[1]。自1997年以來，鵝新城疫

(鵝副粘病毒病)在我國許多地區(qū)鵝群中暴發(fā)[2,3]，由于采取了各種防疫措施，疫情得到了一定的控制，但仍有發(fā)生。據(jù)研究報道，引起鵝群發(fā)病的新城疫病毒毒株在生物學特性、毒力及基因型上與同時期引起雞群發(fā)病的新城疫病毒毒株沒有顯著差異[4,5]。筆者對2007年下半年分離到的新城疫病毒毒株的F基因進行研究，以期望了解目前鵝群中NDV的變異情況，為制定控制鵝群中新城疫的發(fā)生提供防制依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病毒和其他生物材料 NDV毒株由2007年發(fā)病鵝群中分離，命名為KM2007株。SPF雞胚購自云南省禽病研究中心SPF雞場。

1.2 主要試劑 禽白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶(AMV)、Taq DNA聚合酶、pGEM-T Easy Vector、感受態(tài)大腸桿菌等分別購自Roche公司和Promega公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純化學試劑。

1.3 引物 參照已發(fā)表的NDV毒株基因的核苷酸序列設(shè)計2對引物，P1和P2用于擴增M基因1161nt至F基因889nt間長約970pb的片段，P3和P4用于擴增F基因862nt至F基因1700nt間長約839bp的片段[4]。引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，序列為：P1 5′-GCCGAATTCCCG AATCATCACGACGCTTAA-3′，P2 5′-GTGAAGCTTGA GTCTGTGAGTCGTAC-3′，P3 5′-CACCGGTACCCCTAT TCTGATCG-3′，P4 5′-TTAAGCTTGTAGTGGCTCTCAT CTGATC-3′。

1.4 病毒毒力的測定 按照國際獸疫局(OIE)介紹的方法進行。

1.5 NDVF基因 NDV毒株的RNA抽提和F基因RT-PCR擴增按照吳艷清等[6]所報道的方法進行。RT-PCR擴增產(chǎn)物直接克隆到pGEM-T Easy Vector，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，篩選陽性克隆。

1.6 NDV F基因測定、序列分析和氨基酸序列分析 步驟1.5中篩選出的F基因陽性克隆寄送到聯(lián)合基因上海聯(lián)眾基因研究院測定核苷酸序列，用DNA Star4.0版本軟件包的各類軟件(DNA STAR Inc．Madison，wI153715，USA)分析F基因的核苷酸序列及其推導的氨基酸序列。

1.7 NDV系統(tǒng)進化發(fā)生樹和限制性內(nèi)切酶位點分布分析據(jù)Ballagi-Pordany等[7]報道的方法，根據(jù)F基因47～420nt之間的374bp片段的核苷酸序列繪制NDV系統(tǒng)進化發(fā)生樹，同時分析F基因334～1682nt之間的1349bp片段上Hinf I、BstO I和Rsa I 3種RE位點分布。

2 結(jié)果

2.1 病毒毒力的測定結(jié)果 根據(jù)OIE有關(guān)NDV毒力標準，該株鵝源NDV的雞胚死亡時間為48～60h，為強毒株。

附圖 新城疫病毒系統(tǒng)進化發(fā)生樹

2.2 NDV F基因片段的擴增、克隆 該毒株經(jīng)RT-PCR擴增出了大小為970pb和839bp的特異性條帶。

2.3 NDV F基因序列測定和序列分析 （1）NDV F基因序列測定和氨基酸序列推導分析：測定得到F基因全長核苷酸序列，其同源性高達98%以上。推導出相應(yīng)編碼氨基酸，該毒株的F基因編碼由553個氨基酸組成的F蛋白前體，這種前體上分布了N末端信號肽區(qū)、蛋白酶裂解激活區(qū)、融合誘導區(qū)和C末端跨膜區(qū)等功能區(qū)，在糖基化位點和半胱氨酸分布方面高度保守。試驗毒株的蛋白酶裂解激活位點附近的氨基酸序列為112R(K)RQKR↓F117，符合NDV強毒株的規(guī)律[8]。（2）NDV系統(tǒng)進化發(fā)生樹和限制性內(nèi)切酶位點分布：用DNA Star軟件對該分離毒株和28個參考毒株的F基因47～420nt區(qū)域進行同源性比較，繪制了系統(tǒng)進化發(fā)生樹(附圖)。結(jié)果顯示，本試驗中該毒株在系統(tǒng)進化發(fā)生樹的Ⅶ型主干分枝的1個分枝上，為基因Ⅶc亞型。（3）NDV基因型的分類最初是以F基因334～1682nt間3種RE(Hinf I、BstO I和Rsa I)位點分布的差異為依據(jù)的，后又發(fā)現(xiàn)以F基因47～420nt之間的核苷酸序列繪制的系統(tǒng)進化發(fā)生樹與RE位點分布所反映的毒株間遺傳關(guān)系一致，有些RE位點可作為鑒別基因型的標志。（4）本試驗的NDV分離株歸于Ⅶc亞型，具有特定的RE位點分布。在736、883nt具有Hinf I位點，而在1198、1350nt不具有Hinf I位點，在752、1116nt具有Hinf I位點，而在953、1478、1601nt不具有Hinf I位點。在872、973、1249nt具有Hinf I位點，而在540、683、1593、1625nt不具有Hinf I位點。

3 討論

（1）2007年下半年筆者從發(fā)病鵝群中分離到了1株NDV，按照OIE介紹的方法對其毒力進行測定。鵝源NDV的雞胚死亡時間為48～60h，而F蛋白裂解位點的氨基酸推導序列為l12R(K)RQKR↓F117，證實為強毒株。這說明自從1997年鵝源新城疫在我國暴發(fā)流行以來。目前該病雖然被控制，但在局部地區(qū)仍時有發(fā)生，而且強毒株在鵝群中仍然存在，在適當?shù)那闆r下還會導致疫病的發(fā)生。（2）通過對該株NDV的系統(tǒng)進化發(fā)生樹和限制性內(nèi)切酶位點分布分析，發(fā)現(xiàn)分離到的NDV毒株屬于Ⅶc亞型，并且和近年來在鵝群和雞群中流行的NDV毒株分布在一個分支上，同源性很高，并且3種限制性內(nèi)切酶的酶切位點相同，與以前報道的同一亞型毒株的限制性內(nèi)切酶的酶切位點一致。這說明該毒株在鵝群和雞群中長期存在和循環(huán)傳播，而非外來病毒所致。（3）由于我國對新城疫采取的是疫苗接種為主的防制措施，而疫苗的制造、運輸、保存和使用都會存在較多的問題，且多數(shù)養(yǎng)殖場缺少免疫監(jiān)測，制訂的免疫程序或多或少存在問題，免疫抑制性疾病的發(fā)生等導致預(yù)防措施達不到預(yù)期目標，因而對本病的防制仍然存在較大困難。

[1] 國際獸醫(yī)局. 農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局編譯. 診斷試驗和疫苗標準手冊第3版[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)科學出版社, 1996.

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S852.65

A

1007-1733(2017)02-0010-02

2016–10–22）

項目來源：云南省教育廳科學研究基金項目(2015Y615)

*通訊作者