張毅寧

（杭州市學軍中學，浙江杭州 310012）

稻葉提取液促進蛋白核小球藻的生長和色素合成

張毅寧

（杭州市學軍中學，浙江杭州 310012）

蛋白核小球藻是開發(fā)營養(yǎng)食品和藥物的新材料，本文以新鮮稻葉提取液代替蒸餾水配制BG11培養(yǎng)基，研究了不同濃度稻葉提取液對蛋白核小球藻生長和葉綠素a含量的影響，采用SDS-PAGE技術(shù)分析了藻細胞蛋白組分變化。結(jié)果表明，稻葉提取液在0.5%～2.0%的濃度范圍內(nèi)均能大幅促進蛋白核小球藻的生長，提高藻細胞葉綠素a的含量，并改變藻細胞的蛋白組分。培養(yǎng)8 d后，2.0%稻葉提取液處理組藻細胞濃度是同期對照組的3.13倍，與1%處理組結(jié)果相似。培養(yǎng)4 d后，所有處理組藻細胞葉綠素a的含量達到最大值，其中2.0%稻葉提取液處理組藻細胞葉綠素a含量高達14.91 mg·g-1干重，是對照組的2.58倍。稻葉提取液培養(yǎng)使蛋白核小球藻細胞8種主要蛋白組分相對含量降低，同時產(chǎn)生了4種新蛋白組分。本文結(jié)果為水稻葉片的開發(fā)應用和蛋白核小球藻的生產(chǎn)養(yǎng)殖提供了新思路。

稻葉提取液；蛋白核小球藻；生長；葉綠素a；蛋白組分

蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）屬于綠球藻目小球藻科小球藻屬，營養(yǎng)豐富，細胞干物質(zhì)中蛋白質(zhì)占50%～65%，油脂占5%～10%，碳水化合物占10%～20%，含有大量具有抗氧化活性的維生素，如維生素C和維生素E，被FAO命名為綠色健康食品［1］。從蛋白核小球藻中還分離出具有增強機體免疫力、抑制腫瘤、降血壓、血球凝集素等功效的生物活性成分［2-4］，因此，蛋白核小球藻已成為開發(fā)營養(yǎng)食品和藥物的新材料，我國于2012年批準人工養(yǎng)殖的蛋白核小球藻為新型食品資源。此外，小球藻油脂產(chǎn)率約是所有陸生作物品種的10～100倍，是開發(fā)生物柴油的優(yōu)質(zhì)原料［5］。如何促進蛋白核小球藻生長、提高其生物量已成為國內(nèi)外研究的熱點。研究發(fā)現(xiàn)，天然植物提取液具有促進小球藻生長的效應。郭長城等［6］從蘆葦粗提液中分離出能促進蛋白核小球藻生長的生物活性物質(zhì)；李慶華等［7］發(fā)現(xiàn)，采用低濃度的柳樹葉浸提液培養(yǎng)7 d可使蛋白核小球藻密度提高16.9%～30.9%。應用植物粗提物提高小球藻的生物量具有成本低廉、操作方便等優(yōu)點，對小球藻的生產(chǎn)具有重要價值。

水稻是我國的主要農(nóng)作物，光合作用效率高，植株生長快，分蘗期葉片產(chǎn)量大。Li等［8］報道水稻秸稈酶解物能顯著促進蛋白核小球藻的生長，培養(yǎng)48 h后，蛋白核小球藻生物量和油脂產(chǎn)率均比對照提高約2倍。本文以分蘗期的水稻鮮葉為材料，初步研究了稻葉提取液對蛋白核小球藻生長速率、葉綠素a含量和細胞蛋白質(zhì)組分的影響，為稻葉的應用和蛋白核小球藻的開發(fā)提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻品種日本晴種植于浙江省富陽市中國水稻研究所試驗基地，取分蘗盛期葉片，置于60℃烘箱中烘干24 h，然后將水稻葉片粉碎，過40目篩（篩孔徑0.25～0.50 mm）得到稻葉干粉，密封于干燥容器中避光備用。蛋白核小球藻藻種購于武漢水生生物研究所淡水藻種庫。

1.2 方法

1.2.1 稻葉提取液的制備

稱取水稻葉片干粉2.5、5、10 g，分別加500 m L蒸餾水在黑暗中室溫（25℃）浸提48 h，提取液用布氏漏斗經(jīng)普通定性濾紙抽慮，用蒸餾水定容至500 m L，得到質(zhì)量比為0.5%、1.0%、2.0%的稻葉提取液。

1.2.2 培養(yǎng)方法

采用BG11基本培養(yǎng)基，處理組以稻葉提取液代替蒸餾水配制BG11培養(yǎng)基，121℃高壓滅菌后，分裝至100 m L三角瓶中，每瓶50 m L培養(yǎng)基，在無菌條件下分別接入處于對數(shù)生長期的蛋白核小球藻藻種，細胞初始接種濃度為2×106個·mL-1。在溫度為26℃、光照/黑暗為16 h/8 h的光周期條件下培養(yǎng)，早上與晚上各搖瓶1次。于培養(yǎng)的第0、2、4、6、8天進行細胞生長量和葉綠素a含量測定，每組試驗設(shè)3個重復，結(jié)果取平均值。

1.2.3 小球藻生長量和細胞葉綠素a含量測定

蛋白核小球藻的生長量測定采用血球板計數(shù)法和細胞干重法。30 m L藻細胞培養(yǎng)液8 000 r· m in-1離心10 min后去上清，在60℃烘箱中干燥至恒重，稱取對應的藻細胞干重（W）。藻細胞葉綠素a的提取和含量的測定方法參照文獻［9］。取5 m L藻液，8 000 r·min-1離心10 min，棄上清；將藻細胞沉淀重懸于5 mL甲醇中，置于4℃冰箱中過夜提取小球藻葉綠素a，次日離心取上清。以甲醇為參比，在波長665 nm處測定吸光度值（D665）。應用以下公式計算細胞葉綠素a含量：

葉綠素a/（mg·g-1）=13.9×D665/W。

1.2.4 蛋白核小球藻蛋白質(zhì)組分的SDS-PAGE電泳分析

以添加1%稻葉提取液培養(yǎng)至第8天的藻細胞為材料，蛋白核小球藻蛋白提取根據(jù)王偉等［10］方法略加修改。取30 m L藻培養(yǎng)液于8 000 r·m in-1離心10 min收集藻細胞，加入300μL SDS樣品提取緩沖液（64 mmol·L-1Tris-HCl，2%SDS，10%甘油，5%巰基乙醇，pH 6.8），通過4次加熱（95℃，2 min）/冷凍（-20℃，5 min）循環(huán)破碎小球藻細胞，置室溫下浸提0.5 h，然后離心（12 000 r·min-1，5 min）除去不溶物，上清即為蛋白提取液。應用文獻［11］的方法進行蛋白質(zhì)含量的測定，根據(jù)樣品提取液的蛋白濃度進行適當調(diào)整，保證每泳道蛋白上樣量一致，均為30μg。

蛋白組分的SDS-PAGE電泳參照Laemm li方法［12］。分離膠濃度為10%，濃縮膠為5%，電泳后的凝膠用考馬斯亮藍染色液染色1 h，再采用脫色液（10%乙醇和10%乙酸）脫色約4 h至條帶清晰，拍照記錄結(jié)果，并根據(jù)蛋白質(zhì)分子量標準物遷移率計算蛋白組分的相對分子量。蛋白質(zhì)分子量標準物購于Takala公司。

2 結(jié)果與分析

2.1 對蛋白核小球藻生長的影響

圖1表明，稻葉提取液在8 d培養(yǎng)期內(nèi)均能促進蛋白核小球藻的生長。對照組小球藻在前2 d增殖緩慢，至第4天增殖開始加速，第8天培養(yǎng)液藻細胞濃度達到2.98×107個·m L-1，較初始接種藻細胞濃度增加了14.9倍。稻葉提取液在0.5%～2.0%能使小球藻的生長速率明顯加快，第2天時，3個處理組藻濃度與對照組相比顯著增高，說明在培養(yǎng)初期就有促進效果。前2 d內(nèi)，0.5%和2.0%稻葉提取液對小球藻的生長促進幅度相近，均低于1.0%添加濃度；第2～4天內(nèi)，小球藻生長速率與稻葉提取液濃度表現(xiàn)為正相關(guān)；此后，1.0%和2.0%稻葉提取液對小球藻的生長促進效應相近，顯著高于0.5%稻葉提取液處理組；第8天時，1.0%和2.0%稻葉浸提物的處理組藻濃度分別達到9.51×107和9.33×107個·m L-1，是同期對照組的3.19和3.13倍。而0.5%低濃度處理組到第6天時，對小球藻生長的促進效果最大，藻濃度比同期對照增加了1.42倍，之后趨于平緩。

圖1 稻葉提取液對蛋白核小球藻藻細胞生長的影響

2.2 對蛋白核小球藻葉綠素a含量的影響

8 d培養(yǎng)期內(nèi)稻葉提取液對蛋白核小球藻細胞葉綠素a含量的影響結(jié)果如圖2。

圖2 稻葉提取液對蛋白核小球藻葉綠素a含量的影響

圖2顯示，對照組蛋白核小球藻在0～8 d生長期內(nèi)，葉綠素a含量在5.26～5.96 mg·g-1變動，相對穩(wěn)定。除0.5%稻葉提取液處理6～8 d對小球藻葉綠素a含量的影響不明顯之外，其他處理組藻細胞葉綠素a的含量均有較大幅度提升。前2 d以1.0%稻葉提取液對藻細胞葉綠素a含量的促進效果最佳，這和小球藻的生長表現(xiàn)一致。第4天，幾乎所有處理組藻細胞葉綠素a的含量達到最大峰值，2.0%稻葉提取液處理組藻細胞葉綠素a含量高達14.91 mg·g-1干重，同比分別是1.0%和0.5%處理組的1.34和2.09倍，是對照組的2.58倍。6 d后，1.0%和2.0%稻葉提取液處理組藻細胞葉綠素a含量增幅開始下降，至8 d時，仍顯著高于對照，同比分別是對照的1.64和2.18倍。

2.3 對蛋白核小球藻蛋白質(zhì)組分的影響

蛋白質(zhì)是基因表達的產(chǎn)物，與藻類細胞的生長環(huán)境和生理狀態(tài)密切相關(guān)，培養(yǎng)基中的有效成分可能通過影響細胞蛋白組分而發(fā)揮功能。以培養(yǎng)至第8天的藻細胞為材料，應用SDS-PAGE技術(shù)分析1%稻葉提取液對蛋白核小球藻細胞蛋白組分的影響，結(jié)果如圖3。由于對照組和處理組電泳時上樣量均為30μg蛋白，因此電泳圖譜上條帶數(shù)目和顏色深淺的差異能直接反映藻細胞蛋白組分和相對含量的變化。

圖3 稻葉提取液對蛋白核小球藻蛋白質(zhì)組分的影響

從圖3可知，對照組藻細胞含有豐富的蛋白質(zhì)組分，分子量分布范圍從14.3～110.5 ku（樣品a）。相比對照組，經(jīng)稻葉提取液處理的藻細胞蛋白組分發(fā)生了明顯變化（樣品b），主要表現(xiàn)為分子量大于100.7 ku的條帶和分子量為77.5、63.7、61.2、38.4、19.9、18.4和14.3 ku的變淡或消失，說明這些組分蛋白質(zhì)相對含量降低；另一方面，稻葉提取液處理組的蛋白核小球藻細胞46.5 ku蛋白條帶顏色變濃，相對含量增加，還出現(xiàn)了分子量分別為100.1、98.2、27.3和17.7 ku的4種新蛋白組分。

3 小結(jié)與討論

天然植物提取液中既含有抑制蛋白核小球藻生長的生物活性物質(zhì)，也含有促進蛋白核小球藻生長的活性物質(zhì)［6-7］。本文研究發(fā)現(xiàn)，鮮稻葉提取液對蛋白核小球藻的生長具有顯著的促進作用。第8天時，1.0%和2.0%稻葉浸提物的處理組藻濃度分別達到同期對照組的3.19和3.13倍，促進效果優(yōu)于前人報道的蘆葦活性組分（2.79倍）［6］、柳樹葉浸提液（1.31倍）［7］和水稻秸稈酶解液（2.00倍）［8］。稻葉提取液促進蛋白核小球藻生長的原因一方面可能是其中的糖類、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)提供了優(yōu)質(zhì)碳源和/或氮源；另一方面稻葉提取液可能含有內(nèi)源激素或其他生物活性成分，這些成分改變了蛋白核小球藻的基因表達模式，從而加速了細胞生長和分裂。本研究發(fā)現(xiàn)添加稻葉提取液后，蛋白核小球藻細胞的蛋白組分確實發(fā)生了明顯改變，說明稻葉提取液中存在改變藻細胞基因表達模式的生物活性物質(zhì)。

藻體中葉綠素a含量往往與藻細胞生長狀態(tài)和光合作用密切相關(guān)，是藻類生長的特征參數(shù)［6］。本文以藻細胞干重的葉綠素a含量為指標，發(fā)現(xiàn)藻細胞生長量與細胞葉綠素a含量的增加趨勢并不完全一致。如在培養(yǎng)的2～4 d，對照組和稻葉提取液1.0%處理組，藻細胞仍在增殖，但葉綠素a含量維持恒定；在培養(yǎng)4～8 d，藻細胞生長量仍在增加，但葉綠素a含量維持恒定之后下降或直接下降，說明稻葉提取液對藻細胞分裂速度、細胞干物質(zhì)積累量和細胞葉綠素合成的影響并不完全同步。但總體上，稻葉提取液處理能使藻細胞葉綠素a的含量明顯提高，如第4天，2.0%稻葉提取液處理組藻細胞葉綠素a含量高達14.91 mg·g-1，干重同比達到對照組的2.58倍，至8 d時，同比為對照的2.18倍，效果極為顯著。

本研究表明，稻葉提取液能顯著促進蛋白核小球藻的生長，提高其生物量和葉綠素a含量。我國是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大國，農(nóng)作物種植面積大，葉片易收獲，將農(nóng)作物葉片提取液應用于培養(yǎng)營養(yǎng)物質(zhì)豐富的蛋白核小球藻，這為蛋白核小球藻的生產(chǎn)養(yǎng)殖提供了新思路。

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（責任編輯：張瑞麟）

S963

A

0528-9017（2017）01-0176-04

文獻著錄格式：張毅寧.稻葉提取液促進蛋白核小球藻的生長和色素合成［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學，2017，58（1）：176-179.

10.16178/j.issn.0528-9017.20170155

2016-08-30

張毅寧（1999-），男，浙江杭州人，在校學生，進行小球藻應用研究科技實踐活動，E-mail：815975625@qq.com。

注：中國水稻研究所國家水稻生物學重點實驗室為本研究提供了水稻材料，杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院于彥春教授在實驗操作和論文寫作方面給予了指導，特此表示感謝！