肖琛聞，金妙仁，劉 燕，韋 強(qiáng)，季權(quán)安，李 科，趙 劍，鮑國(guó)連*

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，浙江杭州 310021；2.杭州啟明星生物營(yíng)養(yǎng)有限公司，浙江杭州 310021）

大豆異黃酮對(duì)家兔健康性能的影響試驗(yàn)

肖琛聞1，金妙仁2，劉 燕1，韋 強(qiáng)1，季權(quán)安1，李 科1，趙 劍1，鮑國(guó)連1*

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，浙江杭州 310021；2.杭州啟明星生物營(yíng)養(yǎng)有限公司，浙江杭州 310021）

選用健康7周齡新西蘭肉兔96只，分為4個(gè)處理組，每組24只，分別用4種含不同劑量大豆異黃酮的大豆蛋白飼料飼喂。在連續(xù)飼喂3周、5周后進(jìn)行血清SOD活性、MDA含量測(cè)定，IgG和IgA水平測(cè)定，IL-4和IL-6測(cè)定，以及淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)。結(jié)果大豆異黃酮可以顯著提高家兔SOD水平，顯著降低MDA水平和細(xì)胞免疫水平，提高細(xì)胞因子IL-4的表達(dá)，提高IgA水平，說明大豆異黃酮能夠提高家兔免疫健康狀態(tài)。

大豆異黃酮；家兔；健康性能

隨著畜禽業(yè)的集約化發(fā)展，對(duì)飼料原料要求越來越高。大豆是重要的植物蛋白質(zhì)和油脂來源，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，但是大豆中含有一些抗?fàn)I養(yǎng)因子如血球凝集素、脲酶、胰蛋白酶抑制因子等，制約了其在畜禽飼料中的利用。但這些抗?fàn)I養(yǎng)因子不耐熱，擠壓膨化處理后的全脂膨化大豆可通過淀粉糊化、蛋白質(zhì)變性等途徑破壞抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高大豆蛋白質(zhì)的消化率。近年來，全脂膨化大豆作為高能、高蛋白飼料資源應(yīng)用于畜禽飼料中，效果顯著，可降低成本，提高效益。

與傳統(tǒng)飼料生產(chǎn)模式相比，全脂膨化大豆具有更高的優(yōu)越性，不僅使其添加油脂等工藝與設(shè)備復(fù)雜性的缺點(diǎn)得到改善，而且除了脂肪以外，還產(chǎn)生對(duì)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)有益的如脂質(zhì)，包括磷脂等物質(zhì)。大豆異黃酮（soybean isoflavones，SI）是一種從大豆中提取的具有弱雌激素作用的化合物，可以作為雌激素受體的激動(dòng)劑或拮抗劑發(fā)揮作用，SI具有多種生物活性，能促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)，提高其繁殖性能，促進(jìn)動(dòng)物乳腺的發(fā)育，增加泌乳量，同時(shí)具有無毒性、無藥物殘留和添加劑量小等優(yōu)點(diǎn)，與雌激素具有相同的性能而又完全符合畜產(chǎn)品安全生產(chǎn)的需要，極具作為新一代飼料添加劑的潛質(zhì)［1］。本實(shí)驗(yàn)以大豆活性因子大豆異黃酮飼料為實(shí)驗(yàn)材料，以含膨化大豆成分的常規(guī)飼料為對(duì)比飼喂家兔，檢測(cè)家兔的生長(zhǎng)性能以及相關(guān)免疫指標(biāo)，探討含大豆異黃酮的膨化大豆飼料作為家兔生產(chǎn)的可行性，為生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用提供理論依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)藥品

大豆異黃酮（SI）購自上海邁瑞爾，編號(hào)486-66-8，膨化大豆由杭州啟明星有限公司提供。SOD、MDA試劑盒均購自南京建成生物科技有限公司。IgG、IgA測(cè)定試劑盒，兔白介素-4（IL-4）、兔白介素-6（IL-6）購自上海西唐生物科技有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)日糧

全價(jià)日糧（不含抗生素和抗球蟲藥）由本所兔場(chǎng)提供。飼料配方為玉米12.00%、麩皮18.00%、膨化大豆8.00%、草粉30.67%、麥芽根10.00%、大糠16.00%、石粉0.83%、食鹽0.50%、添加劑4.00%。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和處理

選用健康7周齡新西蘭肉兔96只，由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所試驗(yàn)兔場(chǎng)提供。將兔分為4個(gè)處理組，每組24只。分別用4種不同日糧飼喂，其中包括對(duì)照組、大豆異黃酮低劑量組（SI：0.001 5%）、中劑量組（SI：0.003 0%）和高劑量組（SI：0.006 0%）。分別在試驗(yàn)開始后第0天、第14天和第28天稱量每個(gè)重復(fù)的兔子體質(zhì)量和飼料消耗；在連續(xù)飼喂飼料3周、5周進(jìn)行SOD、MDA測(cè)定、血清IL-4和IL-6測(cè)定；在連續(xù)飼喂飼料2周、5周進(jìn)行IgG、IgA測(cè)定。在飼喂6周結(jié)束時(shí)進(jìn)行活體質(zhì)量和胴體質(zhì)量測(cè)定。計(jì)算平均日增重、平均日采食量和飼料增重比。

1.2.2 血清SOD活性和MDA含量測(cè)定

試驗(yàn)開始后第3周、第5周每個(gè)試驗(yàn)組采6只兔子耳緣靜脈血，凝固后1 500 g，離心10 min取血清。按試劑盒說明檢測(cè)。

超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定。將血清用生理鹽水稀釋成不同濃度進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定最佳稀釋倍數(shù)。按試劑盒說明檢測(cè)。

丙二醛（MDA）測(cè)定。按試劑盒說明檢測(cè)。漩渦混勻器混勻，試管口用封口膜扎緊，用針刺一小孔，95℃水浴40 min，后取出流水冷卻，然后1 500 g，離心10 min。去上清，532 nm處，1 cm光徑，雙蒸水調(diào)零，測(cè)各管吸光度（D）值。血清MDA含量/（nmol·m L-1）=（測(cè)定管D-對(duì)照管D）/（標(biāo)準(zhǔn)管D-空白管D）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×樣本稀釋倍數(shù)。

1.2.3 血清IgG、IgA測(cè)定

在連續(xù)飼喂2周、5周結(jié)束時(shí)采集血液，分離血清。10×標(biāo)本稀釋液用蒸餾水1：10倍稀釋。加樣：每孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100μL，將反應(yīng)板充分混勻后置37℃，40 m in。洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4次，在濾紙上印干。每孔加入蒸餾水和第一抗體工作液各50μL（空白除外）。將反應(yīng)板充分混勻后置37℃20 m in。洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4次，在濾紙上印干。每孔加入酶標(biāo)抗體工作液100μL，將反應(yīng)板置37℃，10 min。洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4次，在濾紙上印干。每孔加入底物工作液100μL，置37℃暗反應(yīng)15 min。每孔加入終止液100μL混勻。30 min內(nèi)用酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)吸光度值。

1.2.4 血清IL-4和IL-6測(cè)定

在連續(xù)飼喂3周、5周結(jié)束時(shí)采集血液，分離血清，測(cè)定細(xì)胞因子。標(biāo)準(zhǔn)品液配置。加樣：每孔加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100μL，將反應(yīng)板充分混勻后置37℃10 min。洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4次，在濾紙上印干。每孔加入蒸餾水和第一抗體工作液各50μL（空白除外）。將反應(yīng)板充分混勻后置37℃20 m in。洗板：同前。每孔加酶標(biāo)抗體工作液100μL。將反應(yīng)板置37℃10 min。洗板：同前。每孔加入底物工作液100μL，置37℃暗處反應(yīng)15 min。每孔加入100μL終止液混勻。30 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)吸光值。

1.2.5 家兔淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

在連續(xù)飼喂飼料3周后進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)取少量血液進(jìn)行血液細(xì)胞分類測(cè)定。無菌心臟采集抗凝血，5 m L·只-1，加等量PBS稀釋；取稀釋好的9 m L血樣輕輕加到3 m L淋巴細(xì)胞分離液上方（每管3 mL稀釋后的血樣），550 g，19℃，離心20 min；吸取中間云霧狀白細(xì)胞層，加入2 mL PBS，550 g，4℃，20 min離心；棄上清，加PBS，550 g，4℃，20 min離心洗滌細(xì)胞2次；進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量的計(jì)數(shù)。棄上清，加入完全培養(yǎng)基RPM I1640（10%小牛血清）重懸細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106個(gè)· m L-1；將細(xì)胞加入24孔板，每孔0.5 m L，每孔再加入0.5 m L脂多糖（LPS）或刀豆素A（ConA），濃度分別為5μg·mL-1、12.5μg·mL-1。每個(gè)樣品重復(fù)2孔，然后置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，在48 h以后，每孔取出200μL的細(xì)胞上清液，-20℃凍存?zhèn)溆茫y(cè)細(xì)胞因子）。每孔加2 mg·m L-1的MTT 50μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去上清液，每孔加酸化異丙醇150μL，用槍將細(xì)胞板孔內(nèi)的MTT反復(fù)抽吸，使沉淀完全溶解，從24孔中，每孔取出100μL加入到96孔板上，在酶標(biāo)儀檢測(cè)D570值。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和One-way ANOVA單因素方差分析，Tukey’s HSD方法進(jìn)行組間多重比較和顯著性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 活體質(zhì)量和胴體質(zhì)量

從圖1中可以看出，添加了大豆異黃酮的兔飼料能夠顯著提高家兔體質(zhì)量和胴體質(zhì)量。

2.2 血清中SOD活性和M DA含量

從圖2中A可見，大豆異黃酮能夠顯著提高家兔SOD水平，在連續(xù)飼喂3周以后，中劑量組顯著高于其他各組；在連續(xù)飼喂5周以后，高劑量組顯著高于對(duì)照組和低劑量組。從圖2中B可見，大豆異黃酮能夠顯著降低家兔MDA水平，在連續(xù)飼喂3周以后，各劑量組MDA含量均顯著低于對(duì)照組；在連續(xù)飼喂5周以后，雖無顯著性差異，但各劑量組仍能降低血清中MDA含量。

圖1 家兔體質(zhì)量和胴體質(zhì)量

圖2 家兔血清SOD活性（A）和MDA（B）含量

2.3 血清IgG、IgA水平

從圖3中A可見，在飼喂大豆異黃酮2周或5周，血清中IgG水平各組之間無顯著性差異。從圖3中B可見，飼喂大豆異黃酮5周后，低劑量組IgA含量顯著高于其余各組。雖然各組的IgG均與對(duì)照組無顯著性差異，但是在連續(xù)飼喂5周以后，添加大豆異黃酮組IgG平均值均高于對(duì)照組。IgA在連續(xù)飼喂5周以后，低劑量組顯著高于其余各組。

2.4 血清IL-4和IL-6

從圖4中A可見，細(xì)胞因子IL-4在不同刺激物下，各組的刺激指數(shù)均有差異。其中在LPS刺激下，中劑量組的IL-4顯著高于對(duì)照組；在ConA刺激下，高、中、低劑量組IL-4均顯著高于對(duì)照組；在沒有刺激物刺激下，中劑量組和高劑量組IL-4顯著高于對(duì)照組。從圖4中B可見，細(xì)胞因子IL-6在不同刺激物下，各組的刺激指數(shù)均無差異。但是高、中、低劑量組IL-6平均值均高于對(duì)照組。

圖3 血清IgG（A）和IgA（B）水平

圖4 家兔血清IL-4（A）和IL-6（B）含量

2.5 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

LPS主要是刺激B淋巴細(xì)胞增殖，B細(xì)胞在體液免疫反應(yīng)中起主要作用，ConA主要是刺激T細(xì)胞增殖，T細(xì)胞主要在細(xì)胞免疫反應(yīng)中起主要作用。從圖5可見，高劑量大豆異黃酮能夠顯著提高家兔體液免疫（P＜0.05）和細(xì)胞免疫（P＜0.01）反應(yīng)，說明大豆異黃酮能夠顯著提高提高家兔的免疫機(jī)能。

圖5 家兔外周血淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)

3 討論

本研究得出，家兔日糧中添加大豆異黃酮，可以提高家兔的活體質(zhì)量和胴體質(zhì)量。大豆異黃酮（SI）主要活性成分有染料木黃酮（GEN），大豆黃素（DAI），黃豆黃素（GLY）等，大部分與糖結(jié)合以糖苷形式存在。大豆異黃酮可發(fā)揮間接抗氧化作用抑制促氧化酶如還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶（NOX）的活性，增加抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）的活性等［2］。本研究中試驗(yàn)組的SOD顯著提高，表明膨化大豆蛋白飼料中添加大豆異黃酮起到了上調(diào)SOD的效果。丙二醛（MDA）是膜脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一，其含量高低可以作為考察細(xì)胞受到脅迫嚴(yán)重程度的指標(biāo)之一，它的主要傷害是導(dǎo)致膜脂質(zhì)過氧化，損傷生物膜結(jié)構(gòu)，主要是細(xì)胞質(zhì)膜，使得細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能上受到損傷，改變膜的通透性，從而影響一系列生理生化反應(yīng)的正常進(jìn)行。本研究中各試驗(yàn)組血清MDA含量均顯著低于對(duì)照組，說明大豆異黃酮能顯著抑制機(jī)體MDA的產(chǎn)生，從而起到保護(hù)細(xì)胞的作用。

IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白，占血清免疫球蛋白的70%～75%，在疾病免疫中起重要作用。本研究中各試驗(yàn)組在飼喂大豆異黃酮飼料5周后，IgG平均值高于對(duì)照組，雖然無顯著性差異，但仍能說明大豆異黃酮具有促進(jìn)機(jī)體免疫功能的作用，是一種良好的植物性免疫促進(jìn)劑［3］。分泌型IgA是機(jī)體黏膜局部抗感染的主要抗體。故又稱黏膜局部抗體。在飼喂5周后，低劑量試驗(yàn)組IgA顯著高于對(duì)照組，說明大豆異黃酮能夠提高家兔體內(nèi)黏膜局部抗體，保護(hù)家兔免受病原微生物特別是呼吸道黏膜或者消化道黏膜易感菌的侵染［4］。

IL-4的生物作用包括刺激和活化B細(xì)胞，促進(jìn)體液免疫應(yīng)答，刺激Th0細(xì)胞增殖并朝Th2型細(xì)胞分化以及促進(jìn)IgE分泌型B細(xì)胞轉(zhuǎn)化與增殖等，故對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞有募集、趨化、浸潤(rùn)等作用［5］。IL-6是炎癥起始階段的一個(gè)重要致炎因子，它通過誘導(dǎo)多種細(xì)胞合成和分泌多種急性期蛋白，促進(jìn)感染時(shí)PMN（中性粒細(xì)胞）產(chǎn)生、活化、促進(jìn)B細(xì)胞增殖、分化及產(chǎn)生免疫球蛋白、促進(jìn)T細(xì)胞增殖、分化等，在急性期炎癥反應(yīng)中扮演著十分重要的角色［6］。從結(jié)果分析，細(xì)胞因子IL-4在不同刺激物下，各組的刺激指數(shù)均有差異。其中在LPS刺激下，中劑量組的IL-4顯著高于對(duì)照組；在ConA刺激下，高、中、低劑量組IL-4均顯著高于對(duì)照組；在沒有刺激物刺激下，中劑量組和高劑量組IL-4顯著高于對(duì)照組?？梢姶蠖巩慄S酮能夠提高動(dòng)物分泌IL-4的水平，從而達(dá)到提高動(dòng)物免疫力的效果。各組IL-6均未顯著高于對(duì)照組，說明大豆異黃酮并未對(duì)IL-6起顯著提高的作用。淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果表明，大豆異黃酮能夠顯著提高家兔T、B淋巴細(xì)胞反應(yīng)水平，提高家兔免疫機(jī)能。

4 小結(jié)

大豆異黃酮能夠可以提高家兔細(xì)胞免疫的水平，提高細(xì)胞因子表達(dá)，以及動(dòng)物抗氧化能力的提高。大豆異黃酮能夠?yàn)榧彝媒】叼B(yǎng)殖提供有力保障。

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（責(zé)任編輯：盧福莊）

S829.1；S816.42

A

0528-9017（2017）01-0139-04

文獻(xiàn)著錄格式：肖琛聞，金妙人，劉燕，等.大豆異黃酮對(duì)家兔健康性能的影響試驗(yàn)［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58（1）：139-142.

10.16178/j.issn.0528-9017.20170145

2016-09-26

杭州市重大科技創(chuàng)新專項(xiàng)（20142012A34）

肖琛聞（1979-），浙江杭州人，副研究員，從事家畜疾病防控工作。

鮑國(guó)連，E-mail：baoguolian@163.com。