阮升　顧志成　張世華

【摘要】 目的：研究紫檀芪（pterostilbene，PTE）體外抑制C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡的作用，探討其可能的作用機(jī)制。方法：運(yùn)用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率，吖啶橙/溴化乙錠（AO/EB）雙熒光染色觀察C6細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定Caspase-3活性變化，并用Western blot法檢測(cè)Fas、FasL蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：由MTT結(jié)果知紫檀芪可以顯著抑制C6細(xì)胞的增殖（P<0.01），呈現(xiàn)藥物濃度與時(shí)間依賴性；AO/EB熒光染色（24 h）可見典型的凋亡形態(tài)學(xué)特征；酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測(cè)表現(xiàn)為隨PTE濃度升高，Caspase-3活性逐步升高（P<0.01）；Western blot檢測(cè)顯示PTE可以使Fas、FasL蛋白表達(dá)顯著增加（P<0.01）。結(jié)論：PTE可誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系C6細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與激活Fas/FasL通路、上調(diào)Caspase-3活性有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 紫檀芪； 膠質(zhì)瘤細(xì)胞； 細(xì)胞凋亡； Fas/FasL； Caspase-3

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of pterostilbene（PTE） on the proliferation and apoptosis of glioma cell C6 in vitro，to probe into its mechanism.Method：MTT method was used to detect the survival rate of cells，using AO/EB fluorescent staining methods to observe apoptotic morphological changes of C6 cells.The enzymatic acitivity of Csapase-3 was measured by ELISA.The protein levels of Fas and FasL were detected by Western blot.Result：MTT result showed that PTE can effectively inhibit the proliferation of C6（P<0.01），these effects were showed to be time-and dose-dependent.The result of AO/EB fluorescent staining（24 h） showed that C6 treated by PTE was seen typical apoptotic morphological features.Besides，the enzymatic activity of Csapase-3 was promoted obviously after the effect of PTE on C6 cells by ELISA（P<0.01）.The result of Western blot showed that the protein levels of Fas and FasL in the C6 were upgraded significantly（P<0.01）. Conclusion：PTE can induce apoptosis of glioma cell C6，which is concerned with upgrading Fas and FasL，thereby affecting activation of apoptotic factor Caspase-3 protein.

【Key words】 Pterostilbene； Glioma cells； Apoptosis； Fas/FasL； Caspase-3

First-authors address：The First Affiliated Hospital of Jiamusi University，Jiamusi 154003，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.01.005

腦膠質(zhì)瘤作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率及死亡率居顱內(nèi)腫瘤之首，具有無控增殖、侵潤(rùn)生長(zhǎng)、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)[1-2]。目前腦膠質(zhì)瘤的治療方案主要是以手術(shù)切除為主，化療及放療為輔，盡管綜合以上各種治療手段，但膠質(zhì)瘤患者的中位生存期并無明顯改善，患者大多于明確診斷后1年內(nèi)死亡[3]。近年來，一些天然物質(zhì)（ 青蒿琥酯、白藜蘆醇、雷公藤內(nèi)酯醇等）被逐漸應(yīng)用于腫瘤的防治，其優(yōu)異的效果使人們?cè)絹碓街匾曁烊凰幬镌诳鼓[瘤方面的研究與應(yīng)用[4-7]。目前關(guān)于白藜蘆醇抗腫瘤的研究很多，其可抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[8-9]。紫檀芪（pterostilbene，PTE）作為白藜蘆醇的甲基化衍生物，與白藜蘆醇相比，具有更高的的生物活性[10]，更好的安全性[11]。關(guān)于PTE治療腦膠質(zhì)瘤的研究國(guó)內(nèi)外目前尚無報(bào)道，本研究將以體外培養(yǎng)的腦膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞系作為研究對(duì)象，觀察PTE對(duì)其增殖及凋亡的影響，從而為臨床藥物治療腦膠質(zhì)瘤提供新的思路與方法?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 大鼠腦膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞株（上海拜力生物科技有限公）；PTE（南京世洲生物科技有限公司，純度>99%），用DMSO溶解。DMEM培養(yǎng)基，0.25%胰酶和胎牛血清（Hyclone公司）；四甲基偶氮唑藍(lán)（methylthiazolyl tetrazolium，MTT）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；Fas、FasL抗體（北京中杉公司）；β-actin 抗體（北京中杉公司）；大鼠Caspase-3 Elisa試劑盒（上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司）。Allegra 64R超低溫高速離心機(jī)（Beckman公司）；Synergy HT全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Bio-Tek公司）；Tanon 5200圖像分析管理系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；激光共聚焦顯微鏡（OLYMPUS）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將C6細(xì)胞用完全培養(yǎng)基（DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清及1%雙抗）置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期備用。

1.2.2 MTT法檢測(cè)PTE對(duì)C6細(xì)胞增殖的抑制作用 調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107/L，96孔培養(yǎng)板中每孔加入100 μL，待其貼壁后，再加入PTE溶液100 μL，使PTE終濃度為10、20、40 μmol/L，對(duì)照組加入同體積含0.01%DMSO的完全培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)24、48、72 h，加20 μL的MTT，4 h后棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，在37 ℃恒溫?fù)u床上震蕩10 min，酶標(biāo)儀570/630 nm處測(cè)定各組OD值。

1.2.3 AO/EB熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 C6細(xì)胞以3×107/L的濃度鋪100 μL于激光共聚焦培養(yǎng)皿，4 h后棄掉舊培養(yǎng)液，加入不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入PTE（分組同1.2.2）繼續(xù)培養(yǎng)24 h。吸棄原培養(yǎng)液，用PBS洗滌3遍，加入AO/EB 雙熒光染色液100 μL（AO、EB的終濃度為5 μg/mL）。染色8 min后，吸棄染液，加PBS洗滌3遍，于激光共聚焦顯微鏡下觀察并記錄。

1.2.4 Caspase-3活化程度的測(cè)定 取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞（分組同1.2.2）：用PBS洗滌2遍，離心（1200 r/min，3 min）收集的沉淀后加入裂解液，在冰上超聲裂解細(xì)胞后，于4 ℃，12 000 r/min離心10 min，吸取上清液備用。按BCA試劑盒說明書操作，計(jì)算各組中的蛋白濃度，取100 μL含150 μg蛋白的樣品，加入反應(yīng)緩沖液100 μL，再加入10 μL Caspase-3熒光底物于恒溫箱中培養(yǎng)4 h，在405 nm波長(zhǎng)測(cè)定其OD值。

1.2.5 Western blot檢測(cè)Fas、FasL蛋白表達(dá) 以細(xì)胞密度為5×107/L， 接種于培養(yǎng)皿中，加入PTE（分組同1.2.2），培養(yǎng)24 h后，裂解細(xì)胞，按BCA試劑盒檢測(cè)樣品蛋白的濃度后，按30 μg體系加樣，垂直電泳，270 mA電轉(zhuǎn)膜70 min，封閉50 min，一抗孵育過夜，二抗孵育60 min，加入ECL發(fā)光液，Tanon 5200采集圖像，并對(duì)Western blot結(jié)果進(jìn)行灰度掃描。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法測(cè)定PTE對(duì)C6細(xì)胞增殖的影響 不同濃度PTE（ 10、20、40 μmol/L） 培養(yǎng)24、48、72 h后細(xì)胞存活率結(jié)果，見表1。由10、20、

40 μmol/L的PTE對(duì)C6細(xì)胞作用48 h的抑制率分別為（45.88±0.74）%、（52.37±1.59）%、（63.97±1.47）%，可見隨著藥物濃度的升高，抑制作用逐漸增強(qiáng)，同時(shí)24、48、72 h半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為75.2、14.6、4.8 μmol/L，顯示隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，抑制作用逐漸增強(qiáng)。上述結(jié)果表明PTE可以有效抑制C6細(xì)胞的增殖，結(jié)果呈濃度時(shí)間依賴性。

2.2 激光共聚焦觀察C6細(xì)胞核形態(tài)改變 經(jīng)AO/EB

熒光染色后，對(duì)照組的細(xì)胞核染色質(zhì)均被染成綠色，深淺不一致，同時(shí)細(xì)胞核仍呈正常形態(tài)；經(jīng)10、20 μmol/L PTE處理24 h后細(xì)胞大多核染色質(zhì)染成綠色，染色增強(qiáng)，熒光更為明亮，呈固縮狀或圓珠狀，體積也較對(duì)照組的細(xì)胞大，為早期凋亡細(xì)胞；經(jīng)40 μmol/L PTE處理24 h后，有些細(xì)胞核染色質(zhì)被染成橘紅色，碎裂散布于胞漿中，細(xì)胞膜完整性遭到破壞，這些為晚期凋亡細(xì)胞。見圖1。隨著藥物濃度的增加，橘紅色熒光增強(qiáng)，被染細(xì)胞核的比例也隨之增高，同時(shí)細(xì)胞數(shù)目隨著減少，呈典型的凋亡特征。

2.3 PTE對(duì)C6 細(xì)胞中Caspase-3活性影響 各濃度PTE組C6 細(xì)胞Caspase-3蛋白含量較對(duì)照組明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表2。

2.4 Western blot檢測(cè)Fas、FasL的表達(dá) Fas和FasL表達(dá)的蛋白水平隨著PTE濃度增加而增加，同時(shí)各指標(biāo)在各組間表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見圖2，即PTE誘導(dǎo) Fas和FasL蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)劑量依賴性。

3 討論

腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生演化與細(xì)胞調(diào)控增殖、分化、凋亡三者的平衡失調(diào)相關(guān)聯(lián)，是由多個(gè)基因、多個(gè)步驟、多個(gè)階段的共同作用[12]，其中細(xì)胞增殖與凋亡的平衡失調(diào)在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生過程中可能起著十分重要的作用[13]。有學(xué)者提出啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞自身凋亡機(jī)制，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡對(duì)腫瘤治愈有重要的意義[14-15]。目前在哺乳動(dòng)物中存在著內(nèi)源性線粒體途徑和外源性死亡受體途徑這兩條細(xì)胞凋亡途徑[16]。而Caspase-3是這2條信號(hào)途徑的關(guān)鍵通道，它的表達(dá)增加及活化標(biāo)志著細(xì)胞啟動(dòng)了凋亡機(jī)制[17]。Fas/FasL是腫瘤細(xì)胞中廣泛存在且極為重要的受體[18]，作為體內(nèi)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的一對(duì)糖蛋白分子，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用[19]，F(xiàn)as與FasL配體結(jié)合后可通過 Fas分子啟動(dòng)膜受體途徑信號(hào)，激活Caspase-3，最終啟動(dòng)細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑[20]。

PTE作為一種天然物質(zhì)，具有明確的抗腫瘤效應(yīng)，與傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物相比，其安全范圍很大，基本無不良反應(yīng)[10-11]，同時(shí)具有較好的脂溶性，極易通過血腦屏障[21]。有研究顯示PTE能通過線粒體途徑和死亡受體途徑傳遞凋亡信號(hào)，多靶點(diǎn)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，最終發(fā)揮其抗腫瘤效應(yīng)[22]。但是在不同的腫瘤細(xì)胞中，其具體作用方式及作用靶點(diǎn)仍不甚清楚。有學(xué)者指出PTE能通過促使線粒體膜電位去極化及上調(diào)Caspase-3活性來誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞凋亡[23]。

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)AO/EB熒光染色法觀察到C6細(xì)胞核中可見典型的凋亡形態(tài)學(xué)特征。MTT的結(jié)果呈現(xiàn)出PTE對(duì)于C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制具有時(shí)間及濃度依賴性。為了進(jìn)一步探討PTE誘導(dǎo)C6細(xì)胞凋亡的具體作用方式，對(duì)Caspase-3酶活性及Fas、FasL蛋白的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)：PTE作用于C6細(xì)胞24 h后Caspase-3活性顯著上升（P<0.01），F(xiàn)as、FasL蛋白表達(dá)明顯增加（P<0.01）。由此推斷，PTE誘導(dǎo)C6細(xì)胞凋亡的作用與調(diào)控死亡受體途徑的相關(guān)蛋白的表達(dá)存在一定的聯(lián)系。同時(shí)，可進(jìn)一步提出猜想PTE能否干擾線粒體膜的穩(wěn)定性，并圍繞線粒體凋亡途徑是否也參與了PTE誘導(dǎo)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡進(jìn)程，開展進(jìn)一步的深入研究。

綜上所述，PTE可能通過激活Fas/FasL通路，活化Caspase-3，從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。基于本實(shí)驗(yàn)研究成果，PTE在腦膠質(zhì)瘤藥物治療領(lǐng)域中有很高的研究?jī)r(jià)值及開拓前景。

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（收稿日期：2016-09-01） （本文編輯：程旭然）