鄭德祥，蔡楊新，楊玉潔，鐘兆全，繆三華，吳文斌

(1.福建農(nóng)林大學林學院，福建 福州 350002； 2.順昌國有林場，福建 順昌 353200)

閩北閩粵栲天然林主要樹種幼樹器官碳氮磷化學計量特征分析

鄭德祥1*，蔡楊新1，楊玉潔1，鐘兆全2，繆三華1，吳文斌1

(1.福建農(nóng)林大學林學院，福建 福州 350002； 2.順昌國有林場，福建 順昌 353200)

[目的]選取4種主要優(yōu)勢樹種幼樹為研究對象，分析其不同器官中C、N、P的生態(tài)化學計量特征，為閩粵栲天然林的更新與保護提供理論參考。[方法]應(yīng)用碳氮分析儀與HNO3-HClO4消煮法分別測定幼樹的干、根、枝、葉中的C、N、P含量的質(zhì)量分數(shù)，在不同器官C、N、P含量差異分析的基礎(chǔ)上，通過化學計量比變化的對比分析研究幼樹不同器官的C、N、P化學計量特征。[結(jié)果]閩北閩粵栲天然林主要優(yōu)勢樹種幼樹葉片中各元素的含量均高于其他器官，而根與干中的營養(yǎng)元素含量較低；不同器官的C∶P遠高于C∶N與N∶P，其中，N∶P最小且因樹種不同而有所變化，不同器官的C、N、P含量及化學計量特征均差異極顯著。[結(jié)論]閩北閩粵栲天然林主要優(yōu)勢樹種不同器官對C、N、P的選擇與吸收存在差異，其葉片C含量最高且高于全球尺度和全國尺度，但N、P含量較低；幼樹不同器官的C∶N、C∶P高于平均水平，而N∶P>16；閩粵栲天然林主要優(yōu)勢樹種幼樹對養(yǎng)分的利用效率與生長速率均較低，幼樹的生長更新主要受N、P元素含量的影響，并可能受到P元素缺失的制約。

天然林；幼樹；器官；營養(yǎng)元素；化學計量；閩粵栲

生態(tài)化學計量學是一門結(jié)合生物學、化學和物理學基本原理的綜合學科[1]，該理論認為元素是構(gòu)成有機體的主要成分，并對有機體的許多行為進行有序調(diào)控[2-3]。2000年Elser等[4]明確提出生態(tài)化學計量學的概念，2002年，Sterner和Elser出版專著《Ecological Stoichimetry: The Biology of Elements from Molecules to the Biosphere》，成為生態(tài)化學計量學領(lǐng)域的第一部巨作，標志著生態(tài)化學計量學理論的確立與形成。在國外，生態(tài)化學計量學的研究十分活躍[5-7]，國內(nèi)對其研究起步則相對較晚，但已成為生態(tài)學研究的熱點問題之一。生態(tài)化學計量學研究從最初的水生生物生態(tài)系統(tǒng)逐漸拓展到對陸地植物生態(tài)系統(tǒng)的研究，近十余年來，諸多植物的生態(tài)化學計量特征研究見于報道，其中，又以森林生態(tài)系統(tǒng)和草原生態(tài)系統(tǒng)的研究成果居多。施家月等[8]對天童山39種常見植物幼樹各器官的氮磷養(yǎng)分特征進行了研究，發(fā)現(xiàn)不同器官吸收N和P存在正相關(guān)關(guān)系。常云妮等[9]在尤溪縣的天然米櫧林中分別對喬木層、灌木層和草本層的26個優(yōu)勢種的碳氮磷化學計量特征進行了研究，結(jié)果表明，尤溪縣天然米櫧(Castanopsiscarlesii(Hemsl.) Hayata)林內(nèi)植物葉片C、N、P含量均偏低，P是限制該林分植物生產(chǎn)力最重要的元素。陳亞南等[10]結(jié)合緯度和坡向2個相關(guān)因素，對陜西黃土高原刺槐(RobiniapseudoacaciaLinn.)枯落葉的C、N、P生態(tài)化學計量特征進行研究，表明陜西黃土高原刺槐林的生長主要受氮素限制。這些研究集中體現(xiàn)了植物體對土壤C、N、P元素的吸收與轉(zhuǎn)化及土壤C、N、P對植物生長發(fā)育具有的重要作用。幼樹階段是植物生活史中對環(huán)境最敏感的時期，幼樹體內(nèi)的養(yǎng)分含量在一定程度上反映了所處環(huán)境的養(yǎng)分條件[8]。栗忠飛等[11]、石賢萌等[12]分別對西雙版納熱帶雨林及哀牢山的幼樹生態(tài)化學計量特征進行研究，發(fā)現(xiàn)幼樹葉中C、N、P的生態(tài)化學計量比對海拔變化的響應(yīng)較為顯著，環(huán)境中N元素的變化影響幼苗對P元素的吸收，且不同物種對外源N添加具有差異性利用策略。幼苗根和莖中的N內(nèi)穩(wěn)性比葉片的更高，葉片對N沉降的響應(yīng)更敏感。幼樹體內(nèi)的C、N、P養(yǎng)分含量變化直接影響其生長發(fā)育，改變幼樹的生長發(fā)育速率，最終決定其在群落中的更新及生態(tài)適應(yīng)策略。

閩粵栲(Castanopsisfissa(Champ. ex Benth.) Rehd. et Wils.)為殼斗科(Fagaceae)栲屬(CastanopsisSpach)常綠喬木，中性偏陽的深根性樹種，是營造水土保持林、水源涵養(yǎng)林、薪炭林及用材林的優(yōu)良樹種，也是南方集體林區(qū)最常見的主要闊葉樹種之一。蘇凌燕等[9]對閩粵栲林隙特征及干擾狀態(tài)進行了研究，藍文升等[12]對閩粵栲的空間結(jié)構(gòu)、種群分布格局進行了研究，管大躍等[14]研究了閩粵栲天然林的生物量并構(gòu)建了生物量預(yù)測模型，但對閩粵栲幼樹幼苗更新及其生態(tài)化學計量研究未見報道。本研究以閩粵栲天然林中4種優(yōu)勢樹種幼樹為對象，對幼樹各器官的養(yǎng)分含量進行研究，揭示閩粵栲天然林幼樹C、N、P的生態(tài)化學計量特征，從而為閩粵栲天然林的更新與保護提供理論參考。

1 研究區(qū)概況

2 研究方法

2.1 野外調(diào)查及取樣

于2014年7月，在順昌縣國有林場下屬的高陽采育場經(jīng)營區(qū)內(nèi)，選擇保護良好的閩粵栲天然林林分進行調(diào)查。在陰坡和陽坡的林分中分別設(shè)立1塊50 m ×50 m的標準地。參考李俊清編著的《森林生態(tài)學》[16]中對森林植物群落垂直結(jié)構(gòu)的劃分標準，將林分分為喬木層、灌木層和草本層3個林層，分別對不同林層調(diào)查與記載各樹種的種類、胸徑(胸徑小于5 cm的測量地徑)、樹高等因子。以林下選擇樣地上分布最多的閩粵栲、木荷、米櫧和中華杜英4種林分優(yōu)勢樹種幼樹為研究對象，其幼樹的概況見表1。4樹種按幼樹平均狀況選取3株生長良好的幼樹進行葉、枝、干、根取樣，采集植株頂層成熟、健康葉片，當年新生枝條，高度位于植株1.3 m處的干及幼樹植株的完整主根[17]為試驗測定樣本。

表1 樣地中4種優(yōu)勢樹種幼樹概況Table 1 Average profiles of the four dominant young tree species in the sample plots

2.2 樣品處理及測定

對采集的樣品進行整理分類，包裝好帶回實驗室，75 ℃烘干粉碎后封袋保存并做好標記，各樣品重復(fù)測定3組， 1組空白為對照，植物C、N質(zhì)量分數(shù)采用碳氮分析儀測定；P質(zhì)量分數(shù)采用HNO3-HClO4消煮測定[18]。根據(jù)測定結(jié)果分析其 C、N、P 含量及化學計量特征。

3 結(jié)果與分析

3.1 主要優(yōu)勢樹種幼樹不同器官C、N、P含量

本研究分別測定閩北閩粵栲天然林林分中4種主要優(yōu)勢樹種幼樹不同器官的C、N、P含量，進而分析幼樹各器官營養(yǎng)元素含量的差異性。測定結(jié)果(表2)表明：4種優(yōu)勢樹種幼樹葉片中各元素的含量均比其他器官的高，其中，葉片中的C含量最大，4種優(yōu)勢樹種幼樹不同器官的C含量變化均表現(xiàn)為葉>枝>干>根，N、P含量變化均表現(xiàn)為葉>枝>根>干。對不同器官各元素含量進行方差分析，結(jié)果(表3)表明：不同器官間各元素含量差異極顯著(P<0.01)。

表2 4種優(yōu)勢樹種幼樹不同器官的C、N、P含量Table 2 Content of C, N and P in different organs of the four dominant young tree species

表3 4種優(yōu)勢樹種幼樹不同器官C、N、P含量 單因素方差分析結(jié)果Table 3 One-way ANOVA analysis results of the C, N and P content in different organs of the four dominant young tree species

3.2 4種優(yōu)勢樹種幼樹不同器官C、N、P的生態(tài)化學計量特征

為更好地說明閩粵栲天然林主要優(yōu)勢樹種幼樹的養(yǎng)分利用情況，進一步對幼樹不同器官中的C、N、P的生態(tài)化學計量比進行分析，4種優(yōu)勢樹種幼樹不同器官C、N、P的生態(tài)化學計量特征(表4)表明：4種優(yōu)勢樹種不同器官中的C∶P遠高于C∶N與N∶P，C∶P由高到低依次為干>根>枝>葉，其次為C∶N，其排序與C∶P類似，N∶P最小且在不同樹種中的排序有所變化，閩粵栲與米櫧的N∶P由高到低依次為干>根>葉>枝，木荷的為干>葉>根>枝，中華杜英的為干>枝>根>葉。

表4 4種優(yōu)勢樹種幼樹不同器官C、N、P的 生態(tài)化學計量特征Table 4 Stoichiometry characteristics of C, N and P in different organs of the four dominant young tree species

表5 4種優(yōu)勢樹種幼樹不同器官C、N、P生態(tài)化學 計量比單因素方差分析結(jié)果Table 5 One-way ANOVA analysis results of the stoichiometry ratio of C, N and P in different organs of the four dominant tree species

4 討論

由于葉片是植物光合作用與代謝的主要場所，植物發(fā)育過程中將大量養(yǎng)分傳遞給葉片以滿足植物生長的需要，幼樹葉片中各營養(yǎng)元素含量最高，而幼樹樹干是高度木質(zhì)化的器官，幼樹根系分布尚淺，對吸收養(yǎng)分能力較弱。故而干和根中的營養(yǎng)元素含量較少，而枝作為聯(lián)接樹干和葉的主要營養(yǎng)傳輸器官，營養(yǎng)元素含量介于二者之間，因此，閩北閩粵栲天然林4種主要優(yōu)勢樹種幼樹葉的C、N、P元素含量最大，其次為枝，而后為干或根，該結(jié)果驗證了Krieger等[19]的理論，認為木質(zhì)部的養(yǎng)分大部分被運輸至更需要的部位，植物的干和根的養(yǎng)分含量較低，也表明各優(yōu)勢樹種幼樹不同器官對C、N和P的吸收具有選擇性與差異性，其結(jié)論也與常云妮等[9]對尤溪縣米櫧林內(nèi)植物化學計量研究結(jié)果基本一致。在閩北閩粵栲天然林4種主要優(yōu)勢樹種幼樹不同器官中，葉片的C含量最高，平均為483.3 mg·g-1，大于全球492種陸生植物的平均C含量(464 mg·g-1)[4]，也高于鄰近地區(qū)同為殼斗科栲屬的天然米櫧林葉片的平均C含量(441.9 mg·g-1)[9]；閩北閩粵栲天然林4種主要優(yōu)勢樹種幼樹葉片中的N平均含量(16.2 mg·g-1)低于全球N含量水平(18.34 mg·g-1)[20]和全國753種植物葉片的N含量(18.63 mg·g-1)[21]，略低于中國東部南北樣帶654種植物葉片的N含量(17.55 mg·g-1)[22]。閩粵栲天然林4種主要優(yōu)勢樹種幼樹葉片的P含量為0.46 mg·g-1，明顯低于全球水平及全國和中國東部南北樣帶的葉片P含量(1.42、1.21、1.28 mg·g-1)[20-22]。閩北閩粵栲天然林4種主要優(yōu)勢樹種幼樹葉片的N、P含量較低，其原因可能是由于該區(qū)域高溫多雨和降水淋溶作用導(dǎo)致土壤中的N、P含量不足，間接導(dǎo)致了葉片中的N、P含量降低，幼樹不同器官對各營養(yǎng)元素的選擇與吸收存在差異，這將直接影響4種優(yōu)勢樹種幼樹的新陳代謝與更新。

幼樹不同器官中的C、N、P化學計量比變化影響幼樹生長速率，進而影響幼樹的更新及生態(tài)適應(yīng)策略[17]。閩粵栲天然林4種主要優(yōu)勢樹種的C、N、P計量比在不同器官中的變化差異顯著，由于較高的C含量及較低的N、P含量，導(dǎo)致不同器官的C∶N、C∶P均大于全球尺度內(nèi)植物的C∶N和C∶P(22.5和232)[23]，較高的C∶N與C∶P反映了幼樹對營養(yǎng)的利用效率較低，植物體內(nèi)可能由于N元素或P元素的缺失導(dǎo)致植物生長速率降低；而植物體內(nèi)N∶P化學計量特征反映N和P 2種營養(yǎng)元素的供應(yīng)狀況和相對有效性[24]，當植物N∶P<14時，植物生長主要受N限制；當N∶P>16時，植物生長主要受P限制；當14

影響植物N∶P化學計量特征的因素復(fù)雜且綜合。在天童山常綠闊葉林中，不同物種間的N∶P差異較大，但在各種植物的演替過程中，N∶P總體變化特征基本一致[26]。中亞熱帶杉木人工林中，不同生活型植物的N∶P差異不顯著[27]。因此，影響植物生態(tài)化學計量比的因素復(fù)雜多樣，不同植物、不同群落的養(yǎng)分限制性受多種因素控制。西雙版納熱帶雨林幼樹葉片中的生態(tài)化學計量比對海拔變化的響應(yīng)顯著[11]，南亞熱帶中幼林針闊混交林生態(tài)化學計量特征與其土壤存在一定關(guān)系[28]，溫度對貢嘎山峨眉冷杉幼苗化學計量特征的影響差異顯著[29]。這些研究集中體現(xiàn)了植物的生態(tài)化學計量特征與其所處海拔、土壤和溫度等因素存在一定關(guān)系，閩北閩粵栲天然林4種優(yōu)勢樹種幼樹不同器官C、N和P化學計量特征的差異是否與這些因素有關(guān)還有待進一步研究。

5 結(jié)論

(1)閩北閩粵栲天然林中4種優(yōu)勢樹種幼樹不同器官間各元素含量差異顯著，其中，C含量最大，表現(xiàn)為葉>枝>干>根，而N、P含量表現(xiàn)為葉>枝>根>干。

(2)閩北閩粵栲天然林4種優(yōu)勢樹種幼樹不同器官中C∶P遠高于C∶N與N∶P，其次為C∶N，N∶P最小，其化學計量特征在不同器官中差異極顯著，幼樹對養(yǎng)分的利用效率較低。

(3)閩北閩粵栲天然林4種優(yōu)勢樹種幼樹不同器官中的P含量均較低，且N∶P均顯著高于16，其幼樹生長更新主要受N、P元素含量的影響，并可能受P元素缺失的制約。

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(責任編輯：徐玉秀)

DOI:10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.01.022

柿炭疽病防治藥劑的篩選

鄧全恩1，丁向陽2*，徐建強3，李建安1，谷戰(zhàn)英1

(1.中南林業(yè)科技大學，經(jīng)濟林育種與栽培國家林業(yè)局重點實驗室，經(jīng)濟林培育與保護教育部重點實驗室，湖南 長沙 410004；

2.河南省林業(yè)科學研究院，河南 鄭州 450008； 3.河南科技大學，河南 洛陽 471003)

收稿日期： 2016-05-10
基金項目： 國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項“現(xiàn)代柿產(chǎn)業(yè)關(guān)鍵技術(shù)研究與試驗示范”(201203047)。
作者簡介： 鄧全恩(1987—)，男，河南商丘人，在讀博士研究生，主要從事經(jīng)濟林栽培研究.
* 通訊作者：丁向陽，研究員，主要從事柿子育種及栽培研究. E-mail：dxydd001@163.com

關(guān)鍵詞：柿；炭疽??；藥劑；篩選

Abstract: [Objective]This study was designed to screen the fungicides for controlling pathogens of persimmon anthracnose by laboratory and field test. [Method]4 representative persimmon anthracnose strains collected from Qingzhou of Shandong Province, Gongcheng of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Luanchuan of Henan Province and Fuping of Shanxi Province, were selected as the trial materials. By comparing the minimum inhibitory concentration (MIC) value and the concentration for 50% of maximal effect (EC50) value of 22 kinds of fungicides belonging to 10 categories to decide the inhibition activity of each fungicide. 5 kinds of fungicide were finally selected to conduct field trials. [Result]The results show that: benzimidazole, demethylation inhibitor and benzene-pyrrole acted better, the MIC values were below 10 μg·mL-1, and the EC50within the scope of 0.011 2-0.520 3 μg·mL-1. Field trials demonstrated that the inhibition efficacy of 30% difenoconazole WG (1500×), 240 g·L-1thifluzamide SC (2000×), 240 g·L-1pyraclostrobine SC (1000×), 25% prochloraz EC (2000×), 25 g·L-1fludioxonil SC (1000×) were between 18.72%-47.76% when investigated 10 days after the fourth spraying. [Conclusion]The speed of onset and final control effect of fludioxonil and prochloraz were better than the other three kinds of fungicides.

Keywords: persimmon; anthracnose; fungicide; screening

柿(DiospyroskakiThunb.)為柿科(Ebenaceae)柿屬(DiospyrosL.)落葉喬木或灌木，生態(tài)幅廣、適應(yīng)性極強[1]，是我國主要的木本糧食樹種，近年來隨著國家對木本糧油產(chǎn)業(yè)的重視[2]，柿重新受到了人們的關(guān)注，炭疽病是柿樹上發(fā)生的主要侵染性病害，嚴重制約了柿產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3]。

該病主要發(fā)生在柿樹葉片、枝條、果蒂和果實上，不同品種及同一品種的不同部位發(fā)病情況不同[4]。葉片發(fā)病時葉柄、葉脈變成黑色，形成壞死病斑，這也是柿炭疽病區(qū)別于其它柿葉部病害的明顯標志；枝條發(fā)病時，主要表現(xiàn)在柿樹的幼梢，嚴重時病斑互相融合，從而引起葉片脫落，甚至導(dǎo)致枝條死亡[5]；柿蒂發(fā)病時，表現(xiàn)為黑色壞死現(xiàn)象；果實發(fā)病時變紅變軟，提前脫落。柿炭疽病的病菌主要以菌絲體在幼齡枝條病組織及芽眼中越冬，也可在病果、葉痕和冬芽中越冬，翌年條件適宜時以孢子的形式借風雨和昆蟲傳播，主要侵染新梢及幼果。一般新梢6月上旬開始發(fā)病，雨季發(fā)病較為嚴重，果實6月下旬至7月中下旬發(fā)病。Weir等基于分子生物學和形態(tài)學的差異將柿樹炭疽病菌的表位型界定為柿盤長孢菌GloeosporiumkakiHori，而分類學上將其歸類為柿樹炭疽菌Colletotrichumhoriinom. nov[6]。

炭疽病在多種果樹、農(nóng)作物上均有發(fā)生和研究報道[7-11]，柿炭疽病的研究相對較少，主要集中在部分品種炭疽病菌的分離鑒定和分子序列分析[12-14]、侵染過程、發(fā)生發(fā)展規(guī)律及綜合防治技術(shù)[5,15]，對于柿炭疽病防治藥劑的篩選還處于初步研究階段[16-17]，研究涉及的藥劑種類較少或者為早期藥劑，加之炭疽病在多種植物上發(fā)生，所以生產(chǎn)中使用的防治藥劑種類繁雜、效果不一、安全性不確定，因此對柿炭疽病防治藥劑的篩選顯得格外重要。本文針對柿炭疽病菌選擇了10類22種殺菌劑，室內(nèi)測定各種藥劑對柿炭疽病菌的抑制作用，篩選出抑制力強的藥劑進行田間防治試驗。

1 材料與方法

1.1 常見殺菌劑對柿炭疽病病菌室內(nèi)毒力測定

選取采集于山東青州、廣西恭城、河南欒川及陜西富平的4個具有代表性的菌株；殺菌劑包括苯并咪唑類、三唑類、二甲酰亞胺類等10類22種。(1)MIC值測定：將供試菌株接種在含1、5、10 μg·mL-1殺菌劑的PSA平板上，不含藥的PSA平板為對照，每皿2個菌株，每處理2次重復(fù)，25℃培養(yǎng)4 d后，采用十字交叉法測量各處理的菌落直徑，求平均值后，計算抑制率，得出藥劑對炭疽病菌的最低抑制濃度(Minimum inhibitory concentration，MIC)。抑制率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑/(對照菌落直徑-5)×100%；(2)EC50值測定：采用菌絲生長速率法[18]進行測定，采用MIC測定中的抑制率公式求出各個藥劑濃度對菌絲生長抑制率，所得數(shù)據(jù)經(jīng)Finney概率分析后用DPS v12.01統(tǒng)計軟件求出毒力回歸方程式及EC50。實驗步驟包括： 1)配置殺菌劑母液。將備試原藥用丙酮溶解， 配制成10 g·L-1的母液備用。 2)炭疽菌株進行活化。把炭疽的菌絲接種于培養(yǎng)皿的PSA培養(yǎng)基平面中央，培養(yǎng)4 d左右待用。3)制備帶毒培養(yǎng)基。依據(jù)前期各殺菌劑對柿炭疽病菌MIC值的測定結(jié)果，設(shè)置系列濃度梯度(表1)，根據(jù)濃度梯度加入一定量的殺菌劑母液，制備系列濃度的帶毒培養(yǎng)基。 4)炭疽病菌接種。將活化后的炭疽病菌用打孔器在菌落邊緣打出直徑為0.5 cm的菌餅，然后接種于含藥劑系列濃度的PSA培養(yǎng)基上。 5)病菌抑制效果觀測。炭疽病菌于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d左右，觀察菌絲生長狀況，測量菌落直徑，算出抑制率。以不加藥劑的PSA平板為空白對照，每個藥劑濃度3個重復(fù)。

1.2 藥劑田間防治試驗

1.2.1 試驗地情況 試驗在廣西平樂縣(110°38＇35.91″ E，24°38＇0.32″ N)沙子鎮(zhèn)一個10年生水柿園進行，株行距為3.5 m×4 m。柿園地形為平地，紅壤，pH值6.2，肥力中等，管理水平中等，整個園區(qū)發(fā)病情況基本一致。

1.2.2 試驗方法 結(jié)合已經(jīng)得到的室內(nèi)防治藥劑篩選結(jié)果，選擇其中效果較好和未做室內(nèi)試驗但較新型藥劑共5種進行柿炭疽病室外防治藥劑的篩選試驗，設(shè)5個藥劑處理(表2)和1個清水對照，每處理3次重復(fù)，共18個小區(qū)，每小區(qū)3株柿樹，每個處理9棵樹噴1噴霧器藥液(22 kg)。施藥時間為2015年8月10日、9月1日、9月20日和10月8日，皆為晴天或多云，噴藥后3 d內(nèi)均未下雨。前兩次施藥時間為下午4：00左右，后兩次施藥時間為下午3:00左右。

1.2.3 調(diào)查方法 在每株調(diào)查柿樹的樹冠中等偏上部位東、西、南、北4個方向定枝4個，每枝果數(shù)不少于10個(廣西水柿發(fā)生該病主要表現(xiàn)在果實上，所以本試驗不調(diào)查葉片及果蒂)，于每次噴藥前調(diào)查病果率(由于柿果發(fā)生炭疽病導(dǎo)致的果實過早脫落

表1 殺菌劑來源及處理濃度梯度

Table 1 Sources of fungicides and gradient concentration of the treatment

殺菌劑Fungicides生產(chǎn)廠商Manufacturer濃度梯度Concentrationgradient/(μg·mL-1)苯醚甲環(huán)唑Difenoconazole山東濰坊雙星農(nóng)藥有限公司ShandongWeifangShuangxingPesticideCo.,Ltd.0、0.1562、0.3125、0.6250、1.2500、2.5000、5.0000戊唑醇Tebuconazole江蘇克勝股份有限公司JiangsuKeshengCo.,Ltd.0、0.1562、0.3125、0.6250、1.2500、2.5000、5.0000噻菌靈Thiabendazole浙江綠州生物技術(shù)有限公司ZhejiangLvzhouBiotechnologyCo.,Ltd.0、0.0156、0.0312、0.0625、0.1250、0.2500、0.5000多菌靈Carbendazim山東禾宜生物科技有限公司ShandongHeyiBiotechnologyCo.,Ltd.0、0.0156、0.0312、0.0625、0.1250、0.2500、0.5000甲基托布津Methylthiophanate南京柏藍科技有限公司NanjingBailanTechnologyCo.,Ltd.0、0.0312、0.0625、0.1250、0.2500、0.5000、1.0000苯菌靈Benomyl南京柏藍科技有限公司NanjingBailanTechnologyCo.,Ltd.0、0.0312、0.0625、0.1250、0.2500、0.5000、1.0000速克靈Procymidone日本住友化學株式會社JapanSumitomoChemicalCorp0、0.6250、1.2500、2.5000、5.0000、10.0000、20.0000撲海因Rovral拜耳作物科學(中國)有限公司BayerCropScience(China)Co.,Ltd.0、0.3125、0.6250、1.2500、2.5000、5.0000、10.0000嘧菌酯Azoxystrobin中國農(nóng)科院植保所農(nóng)藥廠ThePesticideFactoryofIPPofCAAS0、0.4688、0.9375、1.8750、3.7500、7.5000、15.0000噻呋酰胺Thifluzamide利民化工股份有限公司LiminChemicalCo.Ltd.0、0.6250、1.2500、2.5000、5.0000、10.0000、20.0000氟酰胺Amide拜耳作物科學(中國)有限公司BayerCropScience(China)Co.,Ltd.0、0.6250、1.2500、2.5000、5.0000、10.0000、20.0000乙霉威Diethofencarb海利爾藥業(yè)集團股份有限公司HailierPharmaceuticalGroupCo.,Ltd.0、2.5000、5.0000、10.0000、15.0000、20.0000、40.0000嘧霉胺Pyrimethanil中國農(nóng)科院植保所農(nóng)藥廠ThePesticideFactoryofIPPofCAAS0、10.0000、20.0000、40.0000、50.0000、60.0000、80.0000吡唑醚菌酯Pyraclostrobin德國巴斯夫公司GermanBasfInc0、0.4688、0.9375、1.8750、3.7500、7.5000、15.0000丙環(huán)唑Propiconazole陜西標正作物科學有限公司ShaanxiBiaozhengCropScienceCo.,Ltd.0、0.0781、0.1563、0.3125、0.6250、1.2500、2.5000烯唑醇Diniconazole江蘇劍牌農(nóng)化股份有限公司JiangsuSwordAgriculturalCo.,Ltd.0、0.3125、0.6250、1.2500、2.5000、5.0000、10.0000三唑酮Ketotriazole江蘇劍牌農(nóng)化股份有限公司JiangsuSwordAgriculturalCo.,Ltd.0、0.6250、1.2500、2.5000、5.0000、10.0000、20.0000甲基立枯磷Tolclofos-methyl青島瀚正益農(nóng)生物科技有限公司QingdaoHanzhengyinongAgroSciencesBiotechnologyCo.Ltd.0、0.3125、0.6250、1.2500、2.5000、5.0000、10.0000咯菌腈Fludioxonil瑞士先正達作物保護有限公司SyngentaCropProtectionCo.Ltd.0.0049、0.0098、0.0195、0.0391、0.0781、0.1563百菌清Chlorothalonil利民化工股份有限公司LiminChemicalCo.Ltd.0、0.3125、0.6250、1.2500、2.5000、5.0000、10.0000福美雙Thiram河北贊峰生物工程有限公司HebeiZanfengBiologicalEngineeringCo.,Ltd.0、0.3125、0.6250、1.2500、2.5000、5.0000、10.0000代森錳鋅Mancozeb美國杜邦公司DuPontEngineeringPolymers0、0.3125、0.6250、1.2500、2.5000、5.0000、10.0000

注：以上殺菌劑均按有效成分計算質(zhì)量濃度，按照每種農(nóng)藥的說明用量范圍而定。

Note: The concentration of above fungicides are calculated according to the effective composition, in accordance with the scope of the description of each pesticide dosage.

表2 田間防治試驗藥劑Table 2 Information about the fungicides of field treatment

和病斑的大小無關(guān)，所以本試驗調(diào)查時只調(diào)查病果率，不調(diào)查發(fā)病等級)，考慮到每次病果率調(diào)查時由于發(fā)生炭疽病導(dǎo)致的果實脫落情況，病果率的計算方法為：病果率=[調(diào)查當次樹上病果數(shù)+(初次調(diào)

查果實總數(shù)-當次調(diào)查果實總數(shù))-其它因素落果數(shù)]/初次調(diào)查果實總數(shù)。最后一次調(diào)查時間為噴藥后的第10天即10月18日。防治效果=(對照病果率-處理病果率)/對照病果率×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Microsoft Excel 2007、SPSS19.0和DPS v12.01統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理和制表、制圖等。

2 結(jié)果與分析

2.1 室內(nèi)不同藥劑對柿炭疽病菌的抑制作用

供試的10類22種殺菌劑對采集于山東青州、廣西恭城、河南欒川及陜西富平的4個菌株的抑制作用見表3，對柿炭疽病菌菌絲生長抑制效果較好的殺菌劑有苯并咪唑類、脫甲基抑制劑類(三唑類、DMIs)、苯吡咯類3類殺菌劑，它們有的品種已應(yīng)用在柿炭疽病的化學防治上，有的則正在作為復(fù)配劑進行開發(fā)。琥珀酸脫氫酶抑制劑類(SDHIs)及甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑(QoIs)對柿炭疽病菌毒力差異較大，需作進一步的探索。其中琥珀酸脫氫酶抑制劑類(SDHIs)中的噻呋酰胺對于廣西水柿炭疽病病菌抑制作用較強，所以選用該藥進行室外試驗。三唑類藥物雖然對于柿炭疽病病菌抑制作用較強，但其代表性藥劑多菌靈、苯菌靈等能誘發(fā)病原菌的抗性，同類品種間有正交互抗性，應(yīng)注意與其它類型殺菌劑混用或輪換使用，所以室外試驗未選擇三唑類藥劑。結(jié)合表2與市場上的新型殺菌劑使用情況，室外試驗選擇了苯醚甲環(huán)唑、咪鮮胺、咯菌腈、吡唑醚菌酯、噻呋酰胺5種殺菌劑。

表3 不同殺菌劑對柿炭疽病菌的抑制作用Table 3 Inhibition effects of different fungicides on pathogens of anthracnose of persimmon

2.2 不同藥劑田間防治效果

表4 不同殺菌劑對柿炭疽病的田間防治效果Table 4 Inhibition effects of different fungicides on anthracnose of persimmon in field treatment

注：不同小寫字母表示P≤0.05水平下顯著性差異。

Note: The different small letters represent significant difference of P level less than or equal to 0.05.

3 討論

本試驗選擇了10類22種殺菌劑，基本上覆蓋了近年來市場上病害防治的常用藥劑，并采用室內(nèi)試驗和田間試驗相結(jié)合的方法進行藥劑篩選，為制定較為有效的柿炭疽病防治方法打下了基礎(chǔ)。室內(nèi)試驗中發(fā)現(xiàn)三唑類對炭疽病菌抑制效果較好，但由于三唑類殺菌劑的作用機理是抑制病原菌體內(nèi)甾醇的脫甲基化過程，作用位點相對單一，因此存在較高的抗藥性風險[19]，所以田間試驗未選擇該類藥劑，這符合試驗方案中尋找有效、可持續(xù)藥劑的目標和理念。田間試驗結(jié)果顯示雖然進行了藥劑處理，但最終發(fā)病率都超過了30%，這可能因為試驗柿園往年發(fā)病較重且未經(jīng)過正規(guī)的防治，所以出現(xiàn)了前期防效較好，但隨著時間推移炭疽病的發(fā)病率呈現(xiàn)上升的趨勢。后續(xù)工作包括：(1)補測咪鮮胺和吡唑醚菌酯對柿炭疽病病菌的室內(nèi)毒力數(shù)據(jù)，并與其它藥劑的室內(nèi)毒力數(shù)據(jù)和大田試驗結(jié)果進行比對分析；(2)從藥劑使用時間對最終防治效果的影響方面開展研究，如發(fā)病前防治和發(fā)病后防治的效果差異來比較不同藥劑的防治效果和預(yù)防效果，進而探討不同藥劑的最佳噴藥時期[20]；(3)通過不同藥劑的配合使用篩選出效果較好的藥劑組合，為復(fù)配新型藥劑做好準備工作。由于時間限制本次室外防治試驗結(jié)果是1年得出的，后續(xù)研究需關(guān)注連續(xù)多年使用的效果差異以比較不同藥劑的長期效果；(4)對各種殺菌劑進行綜合比較，諸如對植物生長的影響、對環(huán)境的影響、成本分析等，力求經(jīng)濟合理地施用高效低毒殺菌劑。

4 結(jié)論

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(責任編輯：金立新)

DOI:10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.01.023

山核桃不同無性系果實性狀及營養(yǎng)成分分析

常 君1，任華東1*，姚小華1，王開良1，周 燕2，周振琪2

(1.中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江省林木育種技術(shù)研究重點實驗室，浙江 杭州 311400；

2.浙江省建德市林業(yè)局，浙江 建德 311600)

收稿日期： 2016-03-14
基金項目： “十二五”國家科技支撐計劃(2013BAD14B0104)；國家林業(yè)局科技發(fā)展中心山核桃遺傳資源調(diào)查項目(GR-2015-16)。
作者簡介： 常 君(1981—)，男，山西懷仁人，助理研究員，碩士，從事經(jīng)濟林栽培與育種研究.
* 通訊作者：任華東(1963—)，男，浙江永康人，副研究員，從事經(jīng)濟林栽培與育種研究. E-mail：renhd@163.com

關(guān)鍵詞：山核桃；無性系；果實性狀；營養(yǎng)成分

Abstract: [Objective]To study the nut fruit shape, the composition, the nutrient contents and their variation ofCaryacathayensisclone. [Method]11 trait and nutrient indices ofC.cathayensisnut fruit from trial forest were analyzed by the methods of variance analysis and multiple comparison based on the national standard of China. [Result]The results showed that there was a significant difference in nut length between the fresh fruits and the nuts, and no significant difference was found in the rest indices ofC.cathayensis. The kernels ofC.cathayensiswere rich in fats (52.64%-58.51%), proteins (55.07-65.50 mg·g-1), soluble sugars (0.26%-0.68%) and mineral elements such as K, Ca, Na, Mg, Zn, Mn, and Fe. 17 kinds of amino acid were identified in the kernels ofC.cathayensis. There were extremely significant differences in the contents of amino acids among the clones ofC.cathayensis. [Conclusion]According to the characteristics of the nut nutrients ofC.cathayensis, the directions of breeding and utilizing ofC.cathayensisare suggested. Three clones are comprehensively selected as the clones of high yield and high quality; one clone is selected as the clone suitable for edible oil production; and two clones are selected as the clones with high contents of amino acids.

Keywords:Caryacathayensis; clones; fruit characteristics; nutrients

山核桃(CaryacathayensisSarg.)，又稱山核、山蟹、小核桃，屬胡桃科(Juglandaceae)、山核桃屬(CaryaNutt.)[1-3]物種，其堅果種仁富含脂肪、蛋白質(zhì)及大量人體必需礦質(zhì)元素，風味獨特，深受消費者喜愛，是我國南方重要的特色干果和木本油料樹種，也是我國特有的堅果樹種。我國浙皖天目山區(qū)是山核桃天然分布區(qū)，也是山核桃的主產(chǎn)區(qū)，主要包括浙江杭州地區(qū)的臨安市、淳安縣、桐廬縣、富陽市、建德市和湖州市的安吉縣，安徽黃山市的歙縣和宣城市旌德縣、績溪市、寧國市等縣(市)[4-6]。種植山核桃經(jīng)濟效益好，年畝產(chǎn)值可達萬元以上，是產(chǎn)區(qū)群眾主要的收入來源，隨著栽培面積不斷擴大，山核桃產(chǎn)業(yè)已成為主產(chǎn)區(qū)重要支柱產(chǎn)業(yè)。

長期以來我國山核桃生產(chǎn)以實生栽培為主，生產(chǎn)林分個體分化嚴重，存在產(chǎn)量、品質(zhì)不穩(wěn)定等問題。實現(xiàn)種植品種無性化是山核桃產(chǎn)業(yè)持續(xù)高效發(fā)展的必然選擇，也是我國山核桃產(chǎn)業(yè)亟待解決的科學問題。有關(guān)山核桃無性系品種選育的研究國內(nèi)僅有無性擴繁方面的研究報道[7-12]，未見成功的無性系選育研究報道，對山核桃果實性狀及營養(yǎng)成分分析與評價也多是基于實生優(yōu)株或?qū)嵣Y源果實生長發(fā)育規(guī)律、蛋白質(zhì)及氨基酸含量與變異、土壤微生物量碳氮的變化、山核桃油提取工藝、脂肪酸組成及加工炒制過程中營養(yǎng)成分、脂肪酸氧化及抗氧化能力變化中的部分指標進行分析[13-22]。作者單位在攻克無性繁殖技術(shù)后成功開展了山核桃無性系測定試驗，在浙江省金華市東方紅林場建立了山核桃無性系測定試驗林。本文以該試驗林無性系為研究對象，對11個參試無性系的果實性狀及營養(yǎng)成分組成和含量進行了測定與分析，旨在探明山核桃無性系果實形態(tài)結(jié)構(gòu)特征、內(nèi)含物營養(yǎng)成分組成與含量及其變異規(guī)律，并依據(jù)各參試無性系的果實性狀和種仁營養(yǎng)成分特點，探討山核桃無性系選育方向并篩選適宜不同利用方向的優(yōu)良無性系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料取自浙江省金華市東方紅林場8年生山核桃無性系試驗林，試驗地為丘陵緩坡地，普通紅壤，立地條件較一致，土地肥力一般。試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計，5株小區(qū)3次重復(fù)，參試無性系共11個，分別為大源2號、大源4號、大源5號、高嶺1號、高嶺3號、高嶺5號、高嶺7號、高嶺8號、徐坑24號、徐坑40號和徐坑89號。

1.2 測定方法

采用山核桃鮮仁為測定材料，按照以下方法進行相關(guān)指標的測定：粗脂肪含量按照GB/T14772-2008《食品中粗脂肪的測定》方法測定，蛋白質(zhì)含量按照GB 5009.5-2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》方法測定，可溶性糖含量按照NY/T 1278-2007《蔬菜及其制品中可溶性糖的測定 銅還原碘量法》方法測定，單寧含量按照NY/T 1600-2008《水果、蔬菜及其制品中單寧含量的測定 分光光度法》方法測定，鉻含量按照GB 5009.123-2014《食品安全國家標準 食品中鉻的測定》方法測定，鈣含量按照GB/T 5009.92-2003《食品中鈣的測定》方法測定，銅含量按照GB/T 5009.13-2003《食品中銅的測定》方法測定，鋅含量按照GB/T 5009.14-2003《食品中鋅的測定》方法測定，鉀、鈉含量按照GB/T 5009.91-2003《食品中鉀、鈉的測定》方法測定，鎂、錳、鐵含量按照GB/T 5009.90-2003《食品中鐵、鎂、錳的測定》方法測定，參照GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的測定》方法測定氨基酸含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用Excel 2007、DPS 14.5數(shù)據(jù)處理軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 山核桃無性系果實形態(tài)特征性狀變異分析

表1為11個山核桃參試無性系果實形態(tài)特征性狀的變異分析結(jié)果。從分析結(jié)果可以看出，山核桃果實在青果單果質(zhì)量、青果果長、青果果寬、堅果單果質(zhì)量、出籽率、堅果果長、堅果果寬、堅果殼厚、果仁質(zhì)量及出仁率10個測定性狀上無性系間均存在一定程度的變異，但多數(shù)性狀變異幅度不大，變異幅度最大的性狀是堅果殼厚(變異系數(shù)為7.15%)，堅果果寬變異幅度最小(變異系數(shù)為0.83%)。方差分析結(jié)果表明，除青果果長與堅果果長無性系間表現(xiàn)出顯著差異外，其它8個指標無性系間差異均未達到顯著水平，表明山核桃果實形態(tài)無性系間總體上比較一 致，但山核桃青(堅)果果長性狀在參試無性系間確實存在本質(zhì)上的差異，差異具有一定的遺傳穩(wěn)定性，說明在無性系水平上進行山核桃果長特征的選擇改良是可能的，有可能取得良好的效果。進一步對參試無性系的SSR多重比較表明：高嶺7號、高嶺8號及高嶺3號3個無性系的青果果長顯著高于其它無性系，其中高嶺7號無性系青果果長最長(為35.95 mm)，高出最短青果果長大源4號無性系(為32.84 mm)9.47%。堅果果長SSR多重比較結(jié)果表明：高嶺8號、高嶺7號2個無性系堅果果長顯著高于其它無性系，其中高嶺8號無性系堅果果長最長(為26.67 mm)，較最短堅果果長大源4號無性系(為24.98 mm)高出6.77%。

表1 山核桃無性系果實形態(tài)特征變異分析結(jié)果Table 1 Variation analysis of characteristics of C. cathayensis clones

注：顯著水平為5%，字母相同為差異不顯著，字母不同為差異顯著，*為差異顯著。

Note: At the significant level of 5%, no significant difference for the same letter, and different letters for the significant difference, *mean the differences was significant.

2.2 不同山核桃無性系種仁內(nèi)含物含量比較分析

粗脂肪、蛋白質(zhì)、可溶性糖和單寧是影響山核桃種仁品質(zhì)的重要質(zhì)量指標。對11個山核桃參試無性系種仁粗脂肪、蛋白質(zhì)、可溶性糖和單寧含量的測定分析結(jié)果表明(表2)：種仁粗脂肪、蛋白質(zhì)、可溶性糖和單寧含量在參試無性系間均存在一定的變異，變異程度差異較大，種仁可溶性糖含量變異程度最大，無性系間變異系數(shù)高達39.67%，粗脂肪含量無性系間變異較小，變異系數(shù)僅為2.76%。進一步的方差分析結(jié)果表明，可溶性糖含量參試無性系間的差異達極顯著差異水平，說明山核桃無性系在種仁可溶性糖含量上存在顯著的遺傳變異。經(jīng)SSR多重比較結(jié)果表明：高嶺7號、徐坑40號與高嶺8號3個無性系種仁可溶性糖含量極顯著高于其它無性系，種仁可溶性糖含量最高的無性系是高嶺7號，含量達0.68%，高出參試無性系總體均值74.00%，是含量最低無性系高嶺1號(含量0.29%)的2.34倍。種仁中的單寧是導(dǎo)致種仁澀口的主要物質(zhì)，其含量高低直接影響山核桃仁的風味，種仁單寧含量在參試無性系中也表現(xiàn)出較大的差異，無性系間的變異系數(shù)達13.7%，其含量最高的是徐坑40號(單寧含量12.43 mg·g-1)，其含量高出所有參試無性系總體均值(9.87 mg·g-1)25.9%，是含量最低無性系大源4號(單寧含量8.11 mg·g-1)的1.53倍。

表2 山核桃不同無性系營養(yǎng)成分指標變異分析Table 2 Variation analysis of nutrients of C. cathayensis clones

注：顯著水平為1%，字母相同為差異不顯著，字母不同為差異顯著，**為差異極顯著。

Note: At the significant level of 1%, no significant difference for the same letter, and different letters for the significant difference, ** mean the difference was extremely significant.

2.3 山核桃不同無性系礦質(zhì)元素含量比較分析

植物籽粒微量元素質(zhì)量分數(shù)常受土壤母質(zhì)性質(zhì)的巨大影響，并可能由此影響農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)[23]，礦質(zhì)元素含量的高低是評鑒山核桃種仁品質(zhì)的主要指標。山核桃種仁中富含鉀、鈣、鈉、鎂、鋅等人體必需礦質(zhì)營養(yǎng)物質(zhì)，與鄭春霞等[24]測定的新疆9種干果微量元素比較可以發(fā)現(xiàn)，山核桃種仁中的錳、銅、鋅含量明顯大于新疆地區(qū)9種干果的含量，這也與錢新標等[23]研究結(jié)果一致。表3為11個山核桃參試無性系種仁中9種礦質(zhì)元素含量變異分析結(jié)果，從中可以看出：山核桃種仁礦質(zhì)元素總量及各元素含量在無性系間均存在一定程度的差異，種仁中礦質(zhì)元素總量參試無性系總體均值為4 530.49 ug·g-1，變異系數(shù)6.51%，總量最高的是徐坑24號(5 073.78 ug·g-1)，最低的是高嶺7號(3 906.71 ug·g-1)，兩者相差1 167.07 ug·g-1；山核桃種仁中含量最高的礦質(zhì)元素是鉀(K)(平均含量為3 087.66 ug·g-1)，其次為鎂(Mg)(平均含量為818.98 ug·g-1)。9種礦質(zhì)元素中，無性系間變異最大的是鈉(Na)和鉻(Cr)，變異系數(shù)分別高達46.15%和24.00%，說明鉻(Cr)和鈉(Na)在參試無性系間存在較大的差異。對參試無性系種仁礦質(zhì)元素總量及各元素含量的方差分析結(jié)果表明，山核桃種仁中鈉(Na)含量參試無性系間差異達極顯著水平，鈣(Ca)含量參試無性系間差異達顯著水平。經(jīng)SSR多重比較，大源4號無性系鈉(Na)含量高達11.53 ug·g-1，極顯著高于其它無性系，是所有參試無性系總體均值(5.36 ug·g-1)的2.15倍；徐坑24號和徐坑89號鈣(Ca)含量顯著高于其它無性系，其中徐坑24號無性系鈣(Ca)含量最高，其含量(507.93 ug·g-1)高出所有參試無性系總體均值(424.89 ug·g-1)19.54%，是含量最低無性系高嶺7號(322.53 ug·g-1)的1.57倍。

表3 山核桃不同無性系的礦質(zhì)元素含量方差分析、多重比較及變異分析Table 3 Variance analysis, multiple comparison and variation analysis of mineral element contents ofC. cathayensis clones ug·g-1

注：顯著水平為1%，字母相同為差異不顯著，字母不同為差異顯著，*為差異顯著，**為差異極顯著。

Note: At the significant level of 1%, no significant difference for the same letter, and different letters for the significant difference, *mean the differences was significant, ** mean the difference was extremely significant.

2.4 山核桃不同無性系種仁蛋白氨基酸組分含量比較分析

氨基酸是蛋白質(zhì)的組成成分，在人體營養(yǎng)和生理上占有重要地位，為滿足人體新陳代謝的需要，人們必須從食物中攝取人體所需的氨基酸[25]。山核桃種仁中富含17種氨基酸，包含人體所必需8種氨基酸中的7種。表4為11個山核桃參試無性系種仁氨基酸含量的分析測定結(jié)果，從中可以看出：參試無性系種仁中氨基酸總量總體均值為53.99 mg·g-1，7種人體必需氨基酸總量總體均值為18.39 mg·g-1，占氨基酸總量的34.06%。山核桃種仁所含的17種氨基酸中，大源2號谷氨酸和精氨酸含量最高，分別為12.02 mg·g-1和7.51 mg·g-1。在山核桃種仁所含人體所必需的7種氨基酸中，大源2號亮氨酸含量最高，含量為4.59 mg·g-1，占7種人體必需氨基酸總量的24.96%。

3 討論

對11個山核桃參試無性系果實形態(tài)10個指標的測定分析結(jié)果表明：參試無性系平均青果單果質(zhì)量為17.99 g，平均堅果單果質(zhì)量為5.57 g，較解紅恩等[26]對山核桃實生起源林分測定的平均鮮果單果質(zhì)量13.58 g和賈曉東等[27]平均堅果單果質(zhì)量3.81 g高出32.47%和46.19%，平均堅果果長和堅果果寬分別為26.05 mm和21.46 mm，較賈曉東等[27]平均堅果果長21.85 mm和堅果果寬19.82 mm分別高出19.22%和8.27%，主要原因可能是山核桃無性系化種植果實大小較實生種植更為均一，品質(zhì)更好。在10個果實形態(tài)測定指標中，僅青果果長和堅果果長在無性系間存在顯著水平的差異，在11個山核桃參試無性系中，高嶺8號、高嶺7號2個無性系堅果果長顯著高于其它無性系。

對11個山核桃無性系果實種仁蛋白內(nèi)含氨基酸組分及含量測定分析結(jié)果表明：山核桃種仁含有17種氨基酸，包含人體所必需8種氨基酸中的7種，這與王冀平等[13]、劉力等[15]、李新委等[17]和章亭洲等[29]研究結(jié)果一致。參試無性系種仁氨基酸總量均值為53.99 mg·g-1，必需氨基酸總量均值為18.39 mg·g-1，占總氨基酸含量的34.06%，與WHO/FAO規(guī)定的標準(40%)[30]差距較小，在所檢測出的氨基酸中，谷氨酸和精氨酸含量顯著高于其它氨基酸含量，精氨酸含量次之。谷氨酸和天冬氨酸是鮮味氨基酸，其中谷氨酸還參與腦組織代謝，具有健腦作用，能促進腦細胞進行呼吸，有利于腦組織中的氨排除，天冬氨酸還具有降血壓、抗疲勞等多種生理功能[29,33]，精氨酸可促進生長發(fā)育、創(chuàng)傷愈合和增強細胞免疫功能等效用[13,34]，因此山核桃可作為優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源。對11個山核桃無性系種仁氨基酸含量的方差分析結(jié)果表明，氨基酸總量、人體必需氨基酸總量及各氨基酸含量在參試無性系間均表現(xiàn)出極顯著差異。在參試無性系中，大源2號、大源4號和高嶺7號3個無性系的氨基酸總量和人體必需氨基酸總量極顯著高于其它無性系；大源2號、大源4號和高嶺7號3個無性系的天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸和精氨酸10種氨基酸含量極顯著高于其它無性系；大源2號無性系的蘇氨酸、胱氨酸和組氨酸含量極顯著高于其它無性系；徐坑40號無性系蛋氨酸含量極顯著高于其它無性系；大源4號無性系酪氨酸含量極顯著高于其它無性系；大源2號和大源4號2個無性系的苯丙氨酸和脯氨酸含量極顯著高于其它無性系。

4 小結(jié)

同核桃種仁[31]、薄殼山核桃種仁[32]一樣，山核桃種仁也富含蛋白質(zhì)、可溶性糖、礦質(zhì)元素和各種氨基酸，具有較高的營養(yǎng)和保健價值。山核桃作為浙皖天目山區(qū)最重要的特色干果和木本油料樹種，對山核桃無性系的篩選評價，在優(yōu)先考慮豐產(chǎn)性的同時，應(yīng)對果實形態(tài)結(jié)構(gòu)及種仁內(nèi)含物營養(yǎng)指標進行綜合分析與評價。本文對11個山核桃參試無性系果實性狀及營養(yǎng)成分研究結(jié)果表明：大源4號、高嶺8號和高嶺4號3個無性系的堅果大小、出籽率、出仁率、果仁質(zhì)量等均高于其它幾個無性系，具有優(yōu)良的干果利用性狀特點，可以作為山核桃干果利用無性系予以重點關(guān)注，徐坑89號無性系粗脂肪含量明顯高于其它參試無性系，可作為山核桃高檔食用油定向開發(fā)的重要資源。大源2號和大源4號無性系谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸含量相對最高，可以作為氨基酸類產(chǎn)品開發(fā)的無性系進行進一步的評價。

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(責任編輯：金立新)

DOI:10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.01.024

鈣濃度對馬尾松幼苗生長和生理特征的影響

李德燕1,2,3，周運超1,3*

(1.貴州大學貴州省森林資源與環(huán)境研究中心，貴州 貴陽 550025； 2.安順學院，貴州 安順 561000；

3.貴州大學林學院，貴州 貴陽 550025)

收稿日期： 2016-06-07
基金項目： 貴州省重大專項“馬尾松多目標培育及產(chǎn)業(yè)關(guān)鍵技術(shù)研究與示范”(黔科合重大專項字(2012)6001號)；“百”層次人才計劃(黔科合人才(2015)4022)
作者簡介： 李德燕(1978—)，女，貴州福泉人，博士研究生，主要從事植物生理生態(tài)方面的研究.E-mail：lideyan1234@163.com
* 通訊作者：周運超(1964—)，教授，博導(dǎo).E-mail：yczhou@gzu.edu.cn

關(guān)鍵詞：馬尾松； Ca2+濃度；生長；生理特性

中圖分類號：S791.248 文獻標識碼：A 文章編號：1001-1498(2017)01-0174-07

Abstract：[Objective]To select the optimal Ca2+concentration forPinusmassonianaseedling growth and to provide evidence for plantation cultivation and rational application of calcium fertilization by studying the effects of Ca2+concentration on growth and physiological characteristics ofP.massonianaseedlings. [Method]A greenhouse sand culture experiment was carried out to study the growth and physiological characteristics of half-year-old seedlings ofP.massonianain different Ca2+concentrations (0.0, 0.4, 1.0, 2.0, 3.0 mmol·L-1and 4.0 mmol·L-1(CK)). [Result]The results showed that both the height and stem increments ofP.massonianaunder 1.0—2.0 mmol·L-1Ca2+for five months were higher, and seedlings grew best in 2.0 mmol·L-1Ca2+. The adaptable strong-to-weak sequence ofP.massonianaseedlings was 2.0, 1.0, 0.4, 3.0, 0.0 mmol·L-1and 4.0 mmol·L-1(CK) of Ca2+. At different growth periods, these indices of pine needles, including O2-generation rate, H2O2content, protective enzyme activities (SOD, POD, CAT and APX), the contents of GSH, AsA and proline, decreased at first and then increased subsequently along with the increasing Ca2+concentration, and all minimums occurred at 1.0 mmol·L-1or 2.0 mmol·L-1of Ca2+. [Conclusion]P.massonianaseedlings is suitable to grow in the soil with Ca2+concentration of 1.0—2.0 mmol·L-1according to the experiment results. Based on comprehensive analysis to soil available calcium ofP.massonianaforestland, the growth and physiological characteristics of seedlings, it is necessary to applying rationally calcium fertilization so as to boost the productivity ofP.massoniana.

Keywords：Pinusmassoniana; calcium concentration; growth; physiological properties

馬尾松(PinusmassonianaLamb.)作為中國南方的主要造林樹種，占中國用材林面積的17.6%，具有較高的經(jīng)濟效益、社會效益和生態(tài)效益，為避免馬尾松林生產(chǎn)力下降，實現(xiàn)馬尾松人工林可持續(xù)經(jīng)營已成為當前的一項迫切任務(wù)。然而，長期種植馬尾松會造成林地水土流失加重，土壤養(yǎng)分如Ca、Mg和K等流失加快，引起林地養(yǎng)分缺乏，導(dǎo)致馬尾松生產(chǎn)力降低[7-8]；而周期性采伐使大量養(yǎng)分元素隨木材及其他器官的收獲而被移出，造成林地養(yǎng)分凈消耗，影響了鈣在生態(tài)系統(tǒng)中的循環(huán)，致使鈣流失，從而導(dǎo)致地力衰退[9-12]。此外，酸雨作用也會導(dǎo)致林地土壤酸化，使土壤中鹽基離子淋失，特別是Ca2+的流失[13-14]。研究結(jié)果表明，在馬尾松林中土壤鈣含量降低可能是導(dǎo)致馬尾松林分衰退及生產(chǎn)力降低的重要原因之一。

前人對黔中地區(qū)馬尾松生長的影響因子進行研究，結(jié)果表明，馬尾松幼樹的株高生長與土壤中CaO、Fe2O3含量及pH值呈負相關(guān)，土壤中鈣含量對馬尾松生長發(fā)育影響較大[15]。目前，專門針對鈣與馬尾松相關(guān)的研究主要集中在養(yǎng)分含量分析[16-18]及種源[19]等方面，而有關(guān)不同Ca2+水平對馬尾松生長及生理特征的影響尚不清楚。本文以半年生馬尾松幼苗為研究對象，用不同Ca2+水平的Hoagland營養(yǎng)液對馬尾松幼苗進行砂培，研究其生長情況及針葉生理指標的變化特征，掌握馬尾松適宜生長的鈣濃度范圍，闡明不同供Ca2+水平下馬尾松生理指標的變化規(guī)律及響應(yīng)機理，為不同Ca2+水平下馬尾松人工林培育及合理施用鈣肥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料處理及試驗設(shè)計

1.2 研究方法

參照湯紹虎等[22]的方法測定功能葉的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性以及丙二醛(MDA)和脯氨酸含量，參照張亞宏等[23]的方法測定抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性，參照湯章城[24]和彭建等[25]的方法測定活性氧(ROS)中氧陰離子自由基(O2-)產(chǎn)生速率和過氧化氫(H2O2)濃度，參照Queval等[26]的方法測定抗壞血酸(AsA)及谷胱甘肽(GSH)的含量，參照李合生等[27]的方法測定類胡蘿卜素的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)為平均值±標準差(3次重復(fù))，使用Excel進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與作圖，SPSS(V20.0)進行數(shù)據(jù)分析。采用隸屬函數(shù)法對馬尾松生理指標進行綜合評定；采用80 d時各處理的生理和生長指標進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同供Ca2+水平下馬尾松苗的生長特征

從表1可看出：隨著供Ca2+水平的增加，馬尾松幼苗株高增量和地徑增量均呈先增加后降低的趨勢，其中，供Ca2+水平為2.0 mmol·L-1的株高增量和地徑增量均最大，分別比CK高51.84%和47.78%，而供Ca2+水平為4.0 mmol·L-1(CK)和0.0 mmol·L-1的株高增量和地徑增量最小。供Ca2+水平為2.0 mmol·L-1的株高增量和地徑增量除與1.0 mmol·L-1處理的差異不顯著外，均顯著高于其他處理。

表1 不同供Ca2+水平下馬尾松的生長情況Table 1 Growth of P. massoniana seedling under different Ca2+ concentrations

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note: Data with different lowercase letters in the same column are highly significantly different(P<0. 05). The same below.

2.2 不同供Ca2+水平下馬尾松針葉生理指標的變化

2.2.1 ROS生成的變化

2.2.1.1 O2-產(chǎn)生速率 圖1 A表明：不同供Ca2+水平下，馬尾松在相同的生長期內(nèi)O2-產(chǎn)生速率均呈先降低后升高的趨勢。處理20、40、60、80 d時，針葉中O2-產(chǎn)生速率均在2.0 mmol·L-1供Ca2+水平時最低，比CK分別降低了5.12%、5.33%、5.92%和10.02%。處理20 d時，O2-產(chǎn)生速率在0 mmol·L-1供Ca2+水平時最高，且比CK高4.26%；而處理40、60、80 d時，O2-產(chǎn)生速率均在4.0 mmol·L-1供Ca2+水平時最高。相同供Ca2+水平的馬尾松針葉內(nèi)的O2-產(chǎn)生速率隨生長期的延長呈不斷上升趨勢。

2.2.1.2 H2O2含量 圖1 B表明：不同供Ca2+水平下，馬尾松幼苗針葉內(nèi)的H2O2濃度隨生長期的延長呈不斷增加的趨勢。處理20、40、60、80 d時，針葉內(nèi)的H2O2濃度均在1.0 mmol·L-1供Ca2+水平時最低，分別比對照低7.63%、25.75%、28.72%、20.88%；均在4.0 mmol·L-1供Ca2+水平時最高，而0.0 mmol·L-1供Ca2+水平的次之，僅比4.0 mmol·L-1(CK)處理依次低0.67%、2.48%、1.55%和4.87%。

2.2.2 MDA含量的變化 從圖2看出：在相同的生長期內(nèi)，馬尾松幼苗針葉內(nèi)的MDA含量隨供Ca2+水平的增加均呈先降低后增加的趨勢。處理20、40、60、80 d時，MDA含量均在2.0 mmol·L-1供Ca2+水平最低，分別比4.0 mmol·L-1(CK)下降了11.98%、10.25%、14.69%、13.25%；除處理80 d外，MDA含量的最高值均在0.0 mmol·L-1供Ca2+水平，分別比4.0 mmol·L-1(CK)增加了0.31%、0.14%、0.20%，而處理80 d時，MDA含量最高值在4.0 mmol·L-1(CK)供Ca2+水平。相同供Ca2+水平的馬尾松幼苗針葉中的MDA含量隨著生長期的延長呈上升趨勢。2.2.3 不同供Ca2+水平對馬尾松抗氧化系統(tǒng)的影響

圖1 不同供Ca2+水平下馬尾松針葉O2-產(chǎn)生速率和H2O2含量的變化(圖中不同小寫字母表示在相同生長期不同供Ca2+水平間差異顯著(P<0.05)，下同)Fig.1 Change of O2- generation rate and H2O2 content of P. massoniana seedling under different Ca2+ concentrations(Date with different lowercase letters are highly significantly different on the column top(P<0.05).The same below.)

圖2 不同供Ca2+水平下馬尾松針葉MDA含量的變化Fig.2 Change of MDA content of P. massoniana seedling under different Ca2+ concentrations

圖3 不同供Ca2+水平下馬尾松SOD、POD、CAT和APX活性的變化Fig.3 Change of SOD, POD, CAT and APX activities of P. massoniana seedling under different Ca2+ concentrations

2.2.4 脯氨酸含量 在相同生長期內(nèi)，馬尾松幼苗針葉中的脯氨酸含量均隨供Ca2+水平的增加先降低后增加，最小值均出現(xiàn)在2.0 mmol·L-1Ca2+處理中，在20、40、60、80 d時，分別比4.0 mmol·L-1(CK)降低了5.01%、7.16%、7.92%、18.09%；馬尾松幼苗針葉中的脯氨酸含量最大值均出現(xiàn)在0.0 mmol·L-1Ca2+處理中，在20、40、60、80 d時，分別比4.0 mmol·L-1(CK)升高了4.21%、3.90%、4.73%、1.23%。相同供Ca2+水平下，馬尾松幼苗針葉內(nèi)的脯氨酸含量隨處理時間的延長總體呈上升趨勢，而對照80 d時的脯氨酸含量比60 d時的增加24.27%(圖4D)。

圖4 不同供Ca2+水平下馬尾松AsA、GSH、類胡蘿卜素和脯氨酸含量的變化Fig.4 Change of AsA，GSH，carotenoids and proline contents of P.massoniana seedling under different Ca2+ concentrations

2.3 不同供Ca2+水平對馬尾松生理影響的綜合評價

利用模糊數(shù)學的隸屬函數(shù)法對生理指標進行分析，馬尾松幼苗生理指標受不同供Ca2+水平影響由強到弱的供Ca2+濃度順序為：4.0(CK)>0.0>3.0>0.4>1.0>2.0 mmol·L-1(表3)。

3 討論

3.1 馬尾松生長適宜的鈣濃度

表2 馬尾松幼苗生理指標與生長的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis between physiological indexes and growth indexes of P.massoniana seedling

注： *、** 分別表示在0.05水平(雙側(cè))和0.01水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。

Note: *、** means that correlation is significant at the 0.05 level(2-tailed),0.01 level (2-tailed),respectively.

表3 馬尾松生理指標的平均隸屬函數(shù)均值Table 3 Synthetical membership function value ofP. massoniana seedling in physiological indices

3.2 不同供Ca2+水平對馬尾松生理的影響

4 結(jié)論

(1)馬尾松幼苗在Ca2+水平為1.0 mmol·L-1和2.0 mmol·L-1的株高增量和地徑增量較高，其中，Ca2+水平2.0 mmol·L-1的株高增量和地徑增量最高。馬尾松幼苗對Ca2+水平適應(yīng)能力強弱順序為2.0>1.0>0.4>3.0>0>4.0 mmol·L-1(CK)。

(2)在不同生長期內(nèi)，隨著供Ca2+水平的增加，馬尾松針葉中ROS(O2-產(chǎn)生速率、H2O2濃度)、MDA含量、抗氧化酶(SOD、POD、CAT和APX)活性、抗氧化物質(zhì)(GSH、AsA)含量、脯氨酸含量均先降低后增加，最小值均出現(xiàn)在供Ca2+水平1.0 mmol·L-1或2.0 mmol·L-1處理中；類胡蘿卜素含量先增加后降低，其最高值均出現(xiàn)在供Ca2+水平2.0 mmol·L-1處理中。

(3)馬尾松幼苗的株高增量和地徑增量與類胡蘿卜素含量關(guān)系不明顯，而與其他生理指標均呈顯著或極顯著負相關(guān)。

綜上，本文研究鈣濃度對馬尾松生長及生理指標的影響，明確了適宜馬尾松生長的鈣濃度及生理指標的變化規(guī)律，為馬尾松人工林培育及合理施用鈣肥提供一定的理論支持。

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(責任編輯：徐玉秀)

DOI:10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.01.025

赤霉素GA4+7處理下白樺無性系生長及

差異基因表達分析

劉 宇，徐煥文，劉桂豐，姜 靜*

(林木遺傳育種國家重點實驗室，東北林業(yè)大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

收稿日期： 2015-12-23
基金項目： 珍貴用材樹種新品種選育技術(shù)研究(2012BAD01B05)。
作者簡介： 劉 宇(1990—)，男(漢族)，黑龍江齊齊哈爾人，碩士研究生，主要從事林木遺傳育種研究
* 通訊作者：姜 靜(1960—)，女(漢族)，黑龍江哈爾濱人，教授，主要從事林木遺傳育種研究。

摘要：[目的]為研究赤霉素GA4+7對白樺生長的調(diào)控機制。[方法]試驗利用1個白樺無性系的分株材料，連續(xù)2年分別葉面噴施濃度為0.2 g·L-1(T1)、0.4 g·L-1(T2)的GA4+7溶液，對實驗苗木的生長情況進行跟蹤調(diào)查，并對相應(yīng)頂端生長組織進行轉(zhuǎn)錄組測序和差異基因分析。[結(jié)果]對2個年份的苗高、地徑等性狀分析發(fā)現(xiàn)，不同處理間苗高與地徑的差異均達到顯著或極顯著水平，GA4+7對高生長有明顯的促進作用，2年后的T2白樺苗高較CK提高了19.65%。于6月28日取GA4+7連續(xù)處理2年的白樺頂芽開展RNA-seq分析，結(jié)果顯示：0.4 g·L-1GA4+7(T2)處理與對照(CK)間的差異基因數(shù)量最多，即上調(diào)表達的基因有181個，下調(diào)表達的基因有55個，這些差異基因在葉綠體類囊體膜、紅光、遠紅光及藍光的細胞響應(yīng)等方面富集明顯。Pathway富集分析顯示：氧化磷酸化途徑與光合途徑中的8條基因呈上調(diào)表達，認為施加0.4 g·L-1GA4+7處理后，上述基因的上調(diào)表達加快電子傳遞進程、催化ATP的合成，從而促進白樺光合作用增強，提高苗期生長量。[結(jié)論]對白樺外源施加赤霉素GA4+7后，可上調(diào)氧化磷酸化途徑和光合途徑相關(guān)基因的表達，進而促進苗木的高和地徑生長。研究結(jié)果可為白樺生長相關(guān)途徑基因的克隆提供參考。

關(guān)鍵字：GA4+7；白樺無性系；轉(zhuǎn)錄組；生長

中圖分類號：S792.153 文獻標識碼：A 文章編號：1001-1498(2017)01-0181-09

Abstract: [Objective]To explore the regulation mechanism of gibberellin GA4+7on the growth of birch.[Method]The experiment was carried out by using two treatments from a tissue-cultured plantlet. The leaf surface was treated by foliar spraying GA4+7solution with concentrations of 0.2 g·L-1(T1) and 0.4 g·L-1(T2) for two consecutive years, respectively. Then the differential gene and transcriptome sequencing of the corresponding top growth tissue were analyzed. [Result]It was found that the difference of height and ground diameter of the plantlet under different treatments reached significant or extremely significant level after two years. It is proved that the GA4+7has a significant promoting effect on height growth. The height of birch seedlings under T2 treatment increased by 19.65% compared with the CK. The results of RNA-seq analysis of birch bud for treated by GA4+7for continuous 2 years showed that the number of different gene was the most between the 0.4 g·L-1of GA4+7(T2) treatment and the CK, a total of 181 up-regulated expression genes and 55 down-regulated expression genes were observed. These genes presented significantly enrichment in the chloroplast thylakoid membrane, red light and far red light and blue light cell response. Pathway enrichment analysis showed that 8 genes in the oxidative phosphorylation pathway and photosynthetic pathway were up-regulated, indicating that applying on 0.4 g·L-1GA4+7treatment, the up-regulated gene expression above promoted the electron transfer process, catalyzing ATP synthesis, thereby promoting birch photosynthetic enhancement, and improved seedling growth.[Conclusion]The application of exogenous gibberellin GA4+7can upregulate the expression of related genes, which participates oxidative phosphorylation pathway and photosynthetic pathway, thus contributing to seedling height and diameter growth.

Keywords: GA4+7, birch clones, transcriptome, growth

赤霉素是控制植物生長并作用于植物整個生命周期的一種激素，屬于四環(huán)二萜類化合物。目前已知的赤霉素種類至少有130種，但僅有部分赤霉素的活性較高，GA4與GA7是其中活性很高的兩種。由于這兩種赤霉素分子結(jié)構(gòu)相似，分離困難，常以混合物即GA4+7的形式存在[1]。迄今為止，有關(guān)GA4+7影響樹木生長報道最多的是促進杉科(Taxodiaceae)、松科(Pinaceae)等針葉樹種開花結(jié)實的研究[2-5]。如Almqvist等[6]人采用GA4+7莖干注射處理21年生的挪威云杉(Piceaabies)，顯著增加了雌雄花的數(shù)量；趙鵬等[7]對15年生落葉松噴灑0.5 g·L-1的赤霉素GA4+7，噴灑的枝條雌球花量是對照枝條的2.9倍。另外，在果樹中研究發(fā)現(xiàn)，GA4+7有效促進植株營養(yǎng)生長，并且大幅提高開花率及座果率[8-9]。目前，GA4+7在植物生長調(diào)節(jié)和促進開花結(jié)實兩方面所起的作用已被證實，但是在國內(nèi)利用GA4+7促進闊葉用材樹種的生長相關(guān)報道還較少，主要集中在施加GA3或其它易于提取的赤霉素，研究其對植物的生長影響，其主要原因是由于GA4+7難以獲得，且生產(chǎn)價格昂貴，限制了其廣泛應(yīng)用[1]，所以GA4+7對于闊葉樹種的處理方式、處理時間以及作用效果尚未明確。但隨著GA4+7合成途徑的確定，生產(chǎn)菌株的獲得，使其使用成本大幅減少，大大推動GA4+7在針闊葉樹種中的應(yīng)用。因此本試驗以1個白樺(B.platyphylla×B.pendula)無性系為研究對象，采用不同濃度赤霉素GA4+7處理，在生長最旺盛的6月末取材測定基因的轉(zhuǎn)錄組，目的是為了研究GA4+7對白樺生長的影響及分子機制，也為GA4+7在白樺中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 方法

參考Philipson的方法[10]設(shè)置0.2 g·L-1GA4+7(T1處理)、0.4 g·L-1GA4+7(T2處理)2種濃度，以不噴施任何溶液為空白對照(CK)，每個處理9株，共計27株白樺無性系。2014年4月20日至7月20日期間對參試苗木進行葉面噴施處理，每隔15 d處理1次，10月初待苗木封頂時調(diào)查1年生苗高、地徑。2015年4月20日開始重復(fù)上述GA4+7處理，并于2015年6月28日分別取T1、T2、CK的白樺頂端組織(包含頂芽及第一片幼葉)，迅速置于液氮中帶回實驗室。10月初待苗木封頂時調(diào)查2年生苗高、地徑。

1.2.1 RNA的提取及cDNA文庫的構(gòu)建 采用CTAB法提取樣品總RNA后，用DNaseⅠ(Promega，USA)消化去除DNA污染，采用Qubit 2.0、Aglient 2100方法檢測RNA樣品的純度、濃度和完整性，從3個RNA樣品中各取20 μg由百邁克生物科技有限公司進行cDNA文庫的構(gòu)建。分別使用Qubit2.0和Agilent 2100 Bioanalyzer對文庫的濃度和插入片段大小進行檢測，使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量，以保證文庫質(zhì)量。庫檢合格后，用HiSeq2500進行測序并進行有參考基因組的轉(zhuǎn)錄組分析。

將測序所得Raw Data去除測序接頭以及引物序列，過濾低質(zhì)量值數(shù)據(jù)，獲得高質(zhì)量的Clean Data。將其與白樺基因組進行比對，比對上的reads稱為Mapped Data。通過檢驗插入片段在基因組上的分布，評估m(xù)RNA片段化的隨機性及mRNA的降解情況；通過插入片段的長度分布，評估插入片段長度的離散程度；通過繪制飽和度圖，評估文庫質(zhì)量。

1.2.2 差異基因的篩選、GO、pathway分析 使用EBSeq進行差異表達分析，獲得2個樣品之間的差異表達基因集，采用RPKM(Reads Per Kb per Million reads)作為衡量轉(zhuǎn)錄本或基因表達水平的指標[11]，計算得到的基因表達量可直接用于比較不同樣品間的基因表達差異。在差異表達基因檢測過程中，將Fold Change≥2且FDR(false discovery rate)<0.01作為篩選標準定義差異表達基因。得到差異表達基因之后，對差異表達基因做GO功能分析和KEGG Pathway分析。

RPKM計算公式為：

RPKM = 106C/(NL /103)

設(shè)RPKM(A)為geneA的表達量，則C為唯一比對到gene A的reads數(shù)，N為唯一比對到所有g(shù)ene的總reads數(shù)，L為gene A的堿基數(shù)，RPKM法能消除基因長度和測序量差異對計算基因表達的影響。

1.2.3 qRT-PCR驗證 采用CTAB法分別提取T1、T2以及CK白樺頂端分生組織的總RNA，經(jīng)DNaseI(RNase free)消化后使用ReverTre Ace?qPCR RT Kit(Toyobo，Osaka，Japan)將提取的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10倍，用作定量PCR的模板，以BpUBC和BpSAND作為內(nèi)參基因，進行實時定量PCR 擴增(所有試樣進行3次重復(fù))。PCR的反應(yīng)體系為：SYBR? Premix ExTaqTMⅡ(2×)10 μL，引物各1 μL(10 μmol·L-1)，水6 μL，模板2 μL，反應(yīng)參數(shù)為95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，58℃退火延伸34 s，循環(huán)40 次，繪制溶解曲線，溫度由95℃ 15 s，60 ℃ 1 min，至95℃ 15 s止。以上反應(yīng)在ABI PRISM? 7500 熒光定量PCR儀上完成。選取未處理白樺(CK)作為對照，用2-ΔΔCT方法[12]對定量PCR的結(jié)果進行分析，引物序列見表1。

1.3 遺傳參數(shù)分析

運用MicrosoftExcel進行數(shù)據(jù)處理，用SPSSv16.0軟件進行方差分析及多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度赤霉素GA4+7對白樺無性系生長的影響

對GA4+7處理白樺無性系獲得的2個年度生長性狀進行方差分析以及主要遺傳參數(shù)分析(表2)。在第1個年度，發(fā)現(xiàn)不同濃度的GA4+7對苗高的生長有極顯著促進作用(P<0.01)，而對地徑的影響不明顯(P>0.05)；在連續(xù)處理的第2個年度，GA4+7不但延續(xù)了對高生長的極顯著促進作用(P<0.01)，而且對地徑生長的促進作用也達到了顯著水平(0.01

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequence

對各處理的生長性狀進行多重比較發(fā)現(xiàn)(見圖1)，白樺的苗高生長在各處理間的差異達到顯著水平(0.01

2.2 不同濃度GA4+7處理下白樺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)統(tǒng)計及文庫質(zhì)量評價

對CK、T1、T2等白樺樣品測序數(shù)據(jù)評估顯示，Q30堿基百分比均不低于91.94%，并且3個樣品與基因組的比對率在79.00%以上，說明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)滿足后續(xù)信息分析的需求及數(shù)據(jù)分析的可靠性。通過對插入片段在基因組上的分布及插入片段的長度分布進行檢測、飽和圖的繪制，表明該轉(zhuǎn)錄組文庫可以用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組測序。

表2 赤霉素GA4+7處理白樺無性系苗高、地徑方差分析及主要遺傳參數(shù)Table 2 Analysis of variance and genetic parameters among gibberellin GA4+7 treatment birch clones on height and base diameter

注：圖中a、b和c表示差異顯著程度，不同字母表示差異顯著(n =3，P<0.05，Duncan多重比較分析，誤差線表示標準偏差)，相同字母表示差異不顯著Note: a, b and c in the figure showed significant difference degree, different letters mean significant difference (n=3, P<0.05, Duncan multiple comparison analysis, error line shows the standard deviation), the same letter indicates no significant difference.圖1 赤霉素GA4+7處理白樺無性系苗高、地徑生長情況Fig.1 Height and base diameter growth of gibberellin GA4+7 treatment birch clonal

表3 樣品測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計及比對效率Table 3 Samples sequencing data statistics and mapped ratio

2.3 不同濃度GA4+7處理下白樺無性系的差異表達基因

根據(jù)RPKM獲得CK、T1、T2處理的白樺3個樣本轉(zhuǎn)錄組文庫的基因表達量，比較每2樣本間的差異表達基因(圖2)，CK_vs_T1有145個差異基因(95個上調(diào)，50個下調(diào))，CK_vs_T2有236個差異基因(181個上調(diào)，55個下調(diào))，T1_vs_T2有82個差異基因(46個上調(diào)，36個下調(diào))，其中T1_vs_T2的差異基因最少。繪制維恩圖分析3個處理差異表達基因的分布(圖3)，發(fā)現(xiàn)有6個基因在CK_vs_T1、CK_vs_T2、T1_vs_T2間差異表達，有29個基因在CK_vs_T1和T1_vs_T2中差異表達，有33個基因在CK_vs_T2和T1_vs_T2中差異表達，有73個基因在CK_vs_T1和CK_vs_T2中差異表達。

圖2 不同處理間上調(diào)和下調(diào)差異基因數(shù)量Fig.2 The number of up-regulated and down-regulated differential expressed genes between the different treatments

2.4 差異基因的GO分類及富集分析

GO功能顯著性富集分析能確定差異表達基因行使的主要生物學功能，可將基因分為細胞組成、生物過程、分子功能3個大類，因此對3個處理的差異表達基因進行了功能分類，結(jié)果見圖4。差異表達基因主要集中在細胞組成的細胞(cell)、細胞器(organelle)、細胞部分(cell part)；分子功能的催化活性(catalytic activity)、結(jié)合(binding)；生物過程的代謝過程(metabolic process)、細胞過程(cellular process)、單一有機體過程(single-organism process)、刺激響應(yīng)(response to stimulus)、生物調(diào)控(biological regulation)。由圖2可知，CK_vs_T1的差異基因數(shù)量明顯少于CK_vs_T2的差異基因數(shù)量，說明施加高濃度的GA4+7引起的差異基因數(shù)目增多。

其中G0: CK_vs_T1；G1：CK_vs_T2；G2：T1_vs_T2
圖3 不同處理下白樺差異表達基因維恩圖
Fig.3 Venn diagram of differentially expressed genes of birch under different treatments

注：細胞組成：C1 胞外區(qū)，C2 細胞，C3 擬核，C4 細胞膜，C5 病毒體，C6 細胞連接，C7 細胞外基質(zhì)，C8 膜包圍的內(nèi)腔，C9 高分子復(fù)合物，C10 細胞器，C11 細胞外部分基質(zhì)，C12 細胞外部分基質(zhì)，C13 部分細胞器，C14 部分病毒體，C15 部分細胞膜，C16 部分細胞。分子功能：M1 蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性，M2 核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性，M3 催化活性，M4 受體活性，M5 甲脒基核苷酸交換因子活性，M6 結(jié)構(gòu)因子活性，M7 運輸活性，M8 結(jié)合，M9 電子載體活性，M10 抗氧化活性，M11 通道調(diào)控活性，M12 金屬伴侶活性，M13 酶調(diào)節(jié)活性，M14 標簽蛋白，M15 翻譯調(diào)節(jié)活性，M16 營養(yǎng)容量活性，M17分子翻譯活性。生物過程：B1 復(fù)制，B2 細胞殺傷，B3 免疫系統(tǒng)過程，B4 代謝過程，B5 細胞過程，B6 生殖過程，B7 生物附著，B8 信號，B9 多細胞有機體過程，B10 發(fā)育過程，B11 生長，B12 移動，B13 單一有機體過程，B14生物學時期，B15 節(jié)律過程，B16 響應(yīng)刺激，B17 定位，B18 多有機體過程，B19 生物調(diào)節(jié)，B20 細胞組成組織起源。Note: Cellular component: extracellular region, cell, nucleoid, membrane, virion, cell junction, extracellular matrix, membrane-enclosed lumen, macromolecular complex, organelle, extracellular matrix part, extracellular region part, organelle part, virion part, membrane part, cell part. Molecule function: protein binding transcription factor activity, nucleic acid binding transcription factor activity, catalytic activity, receptor activity, guanyl-nucleotide exchange factor activity, structural molecule activity, transporter activity, binding, electron carrier activity, antioxidant activit , channel regulator activity, metallochaperone activity, enzyme regulator activity, protein tag, translation regulator activity, nutrient reservoir activity, molecular transducer activity. Biological process: reproduction, cell killing, immune system process, metabolic process, cellular process, reproductive process, biological adhesion, signaling, multicellular organismal process, developmental process, growth, locomotion, single-organism process, biological phase, rhythmic process, response to stimulus, localization, multi-organism process, biological regulation, cellular component organization or biogenesis.圖4 不同樣品間表達差異基因的GO分類Fig.4 GO classification of differentially expressed genes between the different birch samples

對每2個處理樣品間的差異基因進行GO富集分析，以CK_vs_T2為例(圖5)，差異基因在葉綠體類囊體膜(chloroplast thylakoid membrane)、紅光的細胞響應(yīng)(cellular response to red light)、遠紅光的細胞響應(yīng)(cellular response to far red light)、藍光的細胞響應(yīng)(cellular response to blue light)等方面富集顯著。

注：分子功能：醌結(jié)合活性、杜松烯合酶活性、電子運輸轉(zhuǎn)運活性、右旋大根香葉烯合酶活性、germacradienol合酶活性、葉綠素結(jié)合；細胞組成：質(zhì)體球、葉綠體類囊體膜；生物過程：光系統(tǒng)Ⅱ組裝、光合作用光反應(yīng)、杜松烯生物合成過程、花青素組成、卡里金響應(yīng)、高亮度細胞響應(yīng)、紅光響應(yīng)、紫外光的細胞響應(yīng)、光保護、紅光的細胞響應(yīng)、遠紅光的細胞響應(yīng)、藍光的細胞響應(yīng)。Note: Molecule function: quinone binding,(+)delta cadinene synthase activity, electronic transporter transfer activity, germacrene-D synthase activity, germacradienol synthase activity,chlorophyⅡ binding; Cellular component: plastoglobule, chloroplast thylakoid membrane; Biological process: photosysemⅡassembly, photosynthesis light reaction, cadinene biosynthesis process ,anthocyanin-containing compound ,response to karrikin ,cellular response to high light ,response to red light ,cellular response to UV-A ,photoprotection ,cellular response to red light, cellular response to far red light, cellular response to blue light.圖5 CK_vs_T2差異基因的富集分析Fig.5 Analysis of CK_vs_T2 difference gene enrichment

2.5 赤霉素處理下白樺無性系生長相關(guān)基因的初步分析

Pathway顯著性富集分析能確定差異表達基因參與的主要生物過程，因此用KEGG數(shù)據(jù)庫對差異基因進行Pathway富集分析，研究富集的主要生物學過程。

2.5.1 光合作用途徑相關(guān)基因 根據(jù)白樺無性系生長情況發(fā)現(xiàn)，GA4+7處理對白樺苗期高生長有顯著促進作用，且0.4 g·L-1GA4+7對白樺的促進作用較0.2 g·L-1的促進作用更顯著。由于植物生物量與光合作用呈正相關(guān)關(guān)系[14]，因此對光合作用途徑相關(guān)基因進行深入挖掘。Pathway富集分析結(jié)果顯示：GA4+7處理白樺苗木后，CK_vs_T2的光合作用途徑有4個差異基因上調(diào)表達，基因的表達量見圖6，這些差異基因編碼的蛋白分別是光系統(tǒng)Ⅱ蛋白D1(photosystem II protein D1)、光系統(tǒng)ⅠP700葉綠素A脫輔基蛋白A2(photosystem I P700 chlorophyll A apoprotein A2)、細胞色素b6f亞組4(cytochrome b6-f complex subunit 4)、葉綠體中CF1ɑ亞組ATP合成酶(ATP synthase CF1 alpha subunit (chloroplast))。

注：BP028367編碼光系統(tǒng)Ⅱ蛋白D1；BP028372編碼光系統(tǒng)ⅠP700葉綠素A脫輔基蛋白A2； BP028382編碼細胞色素b6f亞組4；BP029736編碼葉綠體中CF1ɑ亞組ATP合成酶。Note: BP028367 Ⅱcoding photosystem II protein D1;BP028372 coding photosystem I P700 chlorophyll A apoprotein A2;BP028382 coding cytochrome b6-f complex subunit 4;BP029736 coding ATP synthase CF1 alpha subunit (chloroplast)圖6 光合作用途徑相關(guān)基因在不同樣品間的表達水平Fig.6 Related gene expression levels among different samples in photosynthesis pathway

2.5.2 氧化磷酸化途徑相關(guān)基因 氧化磷酸化途徑是有機物在分解過程中的氧化步驟所釋放的能量，驅(qū)動ATP合成的過程，即ATP的生成過程，ATP是植物的各項生命活動直接能源物質(zhì)[15]。Pathway富集結(jié)果表明：CK_vs_T2的氧化磷酸化途徑有4個差異基因上調(diào)表達，基因的表達量見表4，它們分別編碼ATP合成酶F1亞組1(ATP synthase F1 subunit 1)、細胞色素c氧化酶亞組1(cytochrome oxidase subunit 1)、NADH-質(zhì)體醌氧化還原酶亞組K(NAD(P)H-quinone oxidoreductase subunit K)、NADH錕氧化還原酶亞組2(NAD(P)H-quinone oxidoreductase subunit 2)。

2.5.3 qRT-PCR驗證 為驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的可靠性，分別以T1、T2和CK白樺頂尖組織的RNA為試材，對光合作用途徑表達差異顯著的4條基因和氧化磷酸化途徑表達差異顯著的4條基因進行qRT-PCR分析，結(jié)果顯示：與CK相比，T1、T2中上述8條基因均呈上調(diào)表達，與Illumina/Solexa測序結(jié)果具有相同的表達趨勢(圖7)，說明測序結(jié)果是可靠的。

表4 氧化磷酸化途徑相關(guān)基因在不同處理間的 表達水平(RPKM值)Table 4 Related gene expression levels between different treatment in oxidative phosphorylation pathway (RPKM value)

注：相對表達水平由實時定量PCR以BpUBC和BpSAND為內(nèi)參計算而來，每個基因3次重復(fù)。Note: the relative expression level by real-time quantitative PCR with BpUBC and BpSAND as reference genes to calculated, repeat 3 times each gene.圖7 實時定量PCR驗證各樣品之間候選基因的表達差異Fig.7 Real-time quantitative PCR to verify differentially expressed between each candidate gene samples

3 討論

調(diào)節(jié)樹木生長，使其短時間內(nèi)獲得較大生長增益從而縮短育種周期是林木育種的重要課題，人們通常采取施肥、環(huán)割、斷根、施加外源激素等措施促進樹木生長[7,16-18]。試驗證明，對于果材兼用樹種施加GA4+7在促進開花及生長、提高座果率方面效果顯著，因此，備受育種工作者的重視[8-9]。

為了探討GA4+7在促進白樺生長方面的作用，試驗利用遺傳組成完全相同的1個白樺無性系為材料，分別噴施0.2 g·L-1和0.4 g·L-1GA4+7，結(jié)果表明，施加GA4+7對白樺苗期生長具有促進作用，在苗高方面，2個濃度的GA4+7均能顯著促進苗高生長，0.2 g·L-1和0.4 g·L-1GA4+7處理2年后無性系苗高均值分別高于CK的9.05%、19.65%；在地徑方面，在GA4+7連續(xù)處理2年后地徑均值顯著高于CK，GA4+7濃度為0.4 g·L-1時對白樺苗期生長促進效果好。這一實驗結(jié)果與Bottini等人[9]對蘋果(Maluspumila)樹的研究結(jié)果相吻合，即赤霉素促進植株的營養(yǎng)生長。

GA4+7處理下白樺無性系生長量的增加，必然與生長相關(guān)基因的上調(diào)表達密切關(guān)聯(lián)，對白樺苗木生長旺盛期的轉(zhuǎn)錄組測序也證明了0.4 g·L-1GA4+7(T2)處理苗高增長顯著，同時與對照(CK)之間差異基因的數(shù)量也最多，即上調(diào)表達的基因有181個，下調(diào)表達的基因有55個(圖2)，這些差異基因在葉綠體類囊體膜、紅光、遠紅光及藍光的細胞響應(yīng)等方面富集明顯(圖5)，進一步Pathway富集分析發(fā)現(xiàn)：葉綠體中CF1ɑ亞組ATP合成酶、細胞色素b6f亞組4、光系統(tǒng)Ⅱ蛋白D1、光系統(tǒng)ⅠP700葉綠素A脫輔基蛋白A2等4條光合代謝相關(guān)的基因呈上調(diào)表達，這些基因參與光合作用的光反應(yīng)過程。另外還有氧化磷酸化途徑的ATP合成酶F1亞組1、細胞色素c氧化酶亞組1、NADH-質(zhì)體醌氧化還原酶亞組K、NADH錕氧化還原酶亞組2等4條基因呈上調(diào)表達，上述8條基因表達量的升高，可能是通過加快電子傳遞過程、催化ATP的合成，而促進植物的光合作用增強[19-25]?？傊珿A4+7處理后白樺通過上調(diào)光合途徑和氧化磷酸化途徑的相關(guān)基因的表達，加快其細胞內(nèi)有機物的合成，進而促進其苗高、地徑的生長。由于參試的白樺無性系放置于塑料大棚外，按常規(guī)管理這些苗木進入開花結(jié)實期還需2～3年的時間，GA4+7處理后能否加快白樺營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變進程還有待于后續(xù)研究，按照前期試驗設(shè)計繼續(xù)施加GA4+7，觀察試驗組是否縮短童期、是否增加開花數(shù)量提高種子產(chǎn)量，進而在基因表達水平上探討GA4+7對白樺生長的影響。

4 結(jié)論

本研究外源施加赤霉素GA4+7可促進白樺苗木的高生長和地徑生長。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明：赤霉素GA4+7處理前后的差異基因主要富集在葉綠體類囊體膜、紅光、遠紅光及藍光的細胞響應(yīng)等方面；同時赤霉素GA4+7可上調(diào)氧化磷酸化途徑和光合途徑相關(guān)基因的表達，研究結(jié)果可為深入了解赤霉素GA4+7對白樺生長的調(diào)控機制及生長相關(guān)途徑重要基因的克隆提供參考。

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(責任編輯：張 研)

Stoichiometric Characteristics of C, N and P in the Dominant Species Sapling Organs ofCastanopsisfissaNatural Forest in Northern Fujian

ZHENGDe-xiang1,CAIYang-xin1,YANGYu-jie1,ZHONGZhao-quan2,MIAOSan-hua1,WUWen-bin1

(1.College of Forestry, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian, China；2.State-owned Forest Farm of Shunchang, Shunchang 353200, Fujian, China)

[Objective]Sample plots were set inCastanopsisfissanatural forest in Northern Fujian. The saplings of four dominant species were used to study the stoichiometric characteristics of C, N and P in different organs, so as to lay a theoretical basis for the regeneration and protection ofC.fissanatural forest. [Method]The mass fractions of C, N and P in stem, root, branch and leaf of the sampling trees were determined with carbon-nitrogen analyzer and HNO3-HClO4heating digestion method. Based on variance analysis of C, N and P contents in different organs, the stoichiometric characteristics of C, N and P were studied with the comparison of the changing stoichiometric ratio. [Result]The contents of C, N and P in leaf were higher than in other organs, whereas those in root and stem were lower for the saplings of dominant species ofC.fissanatural forest in Northern Fujian. Moreover, the C∶P ratio in different organs was higher than the C∶N ratio and N∶P ratio. The N∶P ratio was the minimum and varied among different tree species. There were highly significant differences in the contents and the stoichiometric characteristics of C, N and P in different organs of the tree species. [Conclusion]Compared with N and P, the C content was higher in different organs of the dominant tree species inC.fissanatural forest in Northern Fujian. The C∶N ratio and C∶P ratio were higher than the average level while the N∶P ratio was higher than 16, indicating that the nutrient utilization efficiency and growth rate of the saplings of dominant species inC.fissanatural forest were suboptimal. The growth and the regeneration of the saplings were influenced by the content of N and P and restricted by the missing of P.

natural forest; young tree; organ; nutrient element; stoichiometric;Castanopsisfissa

Screening of Fungicides to Pathogens of Persimmon Anthracnose

DENGQuan-en1,DINGXiang-yang2,XUJian-qiang3,LIJian-an1,GUZhan-ying1

(1.Central South University of Forestry and Technology, Key Laboratory of Non-Wood Forest Product of State Forestry Administration, Key Laboratory of Cultivation and Protection for Non-Wood Forest Trees of Ministry of Education, Changsha 410004, Hunan, China; 2.Henan Academy of Forestry, Zhengzhou 450008, Henan, China; 3.Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, Henan, China)

Nut Fruit Characteristics and Nutrients ofCaryacathayensisClones

CHANGJun1,RENHua-dong1,YAOXiao-hua1,WANGKai-liang1,ZHOUYan2,ZHOUZhen-qi2

(1.Research Institute of Subtropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Key Laboratory of Tree Breeding of Zhejiang Province,Hangzhou 311400, Zhejiang, China; 2.Jiande Forestry Bureau, Jiande 311600, Zhejiang, China)

Effects of Calcium Concentration on Growth and Physiological Characteristics ofPinusmassonianaSeedling

LIDe-yan1,2,3，ZHOUYun-chao1,3

(1.Research Center of Forest Resources and Environment in Guizhou Province, Guizhou University, Guiyang 550025, Guizhou, China; 2.College of Agronomy, Anshun University, Anshun 561000, Guizhou, China; 3.College of Forestry, Guizhou University, Guiyang 550025, Guizhou, China)

Analysis of Clonal Growth and Differences in Gene Expression ofBetulaplatyphylla×B.pendulaunder GA4+7Treatment

LIUYu,XUHuan-wen,LIUGui-feng,JIANGJing

(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, Harbin 150040, Heilongjiang, China)

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.01.021

2016-05-03

福建省教育廳資助項目(JA12112)；福建農(nóng)林大學校重點項目建設(shè)專項(6112C035H)資助

鄭德祥(1975—)，男，福建仙游人，博士，副教授，主要從事森林經(jīng)理學研究.E-mail：fjzdx@126.com
* 通訊作者.

S718.55

A 文章編號：1001-1498(2017)01-0154-06

63.1 文獻標識碼：A

1001-1498(2017)01-0160-06

文獻標識碼：A 文章編號：1001-1498(2017)01-0166-08