王圣潔，林彩麗，嚴(yán)東輝，于少帥，李 永，汪來(lái)發(fā)，樸春根，郭民偉，淮穩(wěn)霞，田國(guó)忠

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所，國(guó)家林業(yè)局森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091)

寡核苷酸管芯片技術(shù)檢測(cè)和鑒別我國(guó)不同組植原體*

王圣潔，林彩麗，嚴(yán)東輝**，于少帥，李 永，汪來(lái)發(fā)，樸春根，郭民偉，淮穩(wěn)霞，田國(guó)忠**

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所，國(guó)家林業(yè)局森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091)

[目的]不同組植原體檢測(cè)和鑒別的特異性探針已有報(bào)道，為了篩選出適合于我國(guó)不同組植原體檢測(cè)和鑒別的特異性探針，建立管芯片檢測(cè)和鑒別植原體技術(shù)，并對(duì)我國(guó)發(fā)生的疑似植原體病害進(jìn)行鑒別。[方法]通過(guò)PCR擴(kuò)增結(jié)合管芯片雜交技術(shù)，對(duì)收集到的15種植原體侵染的植物樣品及其健康對(duì)照進(jìn)行檢測(cè)和鑒別。[結(jié)果]建立了管芯片檢測(cè)和鑒別植原體技術(shù)體系。15種病害樣品中，13種獲得顯著的陽(yáng)性雜交信號(hào)，并且所有的健康對(duì)照都呈現(xiàn)為陰性。13種植原體病害依16Sr DNA直接測(cè)序可分為16Sr Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、XIX四組植原體。在所有探針中，植原體的通用探針(Pp-502)可以檢測(cè)到所有確定的植原體樣品。16SrⅠ組特異性探針(PpⅠ-465)可以確定16SrⅠ組的泡桐叢枝、苦楝叢枝、桑樹萎縮和萵苣黃化4種植原體樣品。16SrII組特異性探針(PpⅡ-629)僅可以確定16Sr II組的花生叢枝、甘薯叢枝和臭矢菜叢枝3種植原體樣品。但16SrV組的棗瘋病、櫻桃致死黃化和重陽(yáng)木叢枝及16Sr XIX組的板栗黃化皺縮植原體與其他組?；蕴结樈杂忻黠@的交叉雜交信號(hào)。相比于PCR擴(kuò)增的凝膠電泳檢測(cè)，管芯片檢測(cè)的靈敏度提高了1 000倍。對(duì)疑似植原體病害的診斷結(jié)果顯示河南濮陽(yáng)的紅花槐叢枝的病原應(yīng)為16SrV組植原體，福建福州的長(zhǎng)春花黃化叢枝應(yīng)為16SrⅠ組植原體；而北京戒臺(tái)寺牡丹黃化皺葉和內(nèi)蒙古包頭柳樹叢枝未出現(xiàn)任何植原體?；碾s交信號(hào)。[結(jié)論]管芯片雜交技術(shù)作為一種檢測(cè)和鑒別植原體的方法，可應(yīng)用于我國(guó)植原體病害調(diào)查和診斷，并為植原體的鑒別和分類提供可靠的依據(jù)。

管芯片；植原體；病害鑒定與診斷；16Sr DNA基因

植原體(Phytoplasma，原稱 Mycoplasma-like organism 簡(jiǎn)稱MLO)，是一類類似植物病原細(xì)菌但無(wú)細(xì)胞壁的原核生物。能引起許多重要的糧食作物、蔬菜、觀賞植物和果樹等經(jīng)濟(jì)林木的嚴(yán)重病害。目前，在國(guó)際上已經(jīng)報(bào)道的植原體相關(guān)病害多達(dá)1 000余種，在我國(guó)發(fā)生的也有100多種[1]。由于植原體暫時(shí)還不能實(shí)現(xiàn)體外培養(yǎng)，針對(duì)該類病害的高度抗性品種又很難獲得，實(shí)際生產(chǎn)中該類病害的防治措施主要是依靠清除染病的植株，杜絕侵染來(lái)源。因而及早的發(fā)現(xiàn)感病植物中植原體的存在，及時(shí)采取相應(yīng)的措施，將帶毒植物予以鏟除，對(duì)該類病害的防治具有重要意義[2]。因此，建立快速、高效、準(zhǔn)確的植原體鑒定檢測(cè)體系變得尤為重要，這方面的研究經(jīng)歷了前期主要依靠生物學(xué)、電鏡觀察、抗生素試驗(yàn)相結(jié)合的傳統(tǒng)方法進(jìn)行檢測(cè)，到后期隨著生物技術(shù)的發(fā)展，基于酶聯(lián)免疫反應(yīng)、核酸雜交以及PCR技術(shù)的檢測(cè)方法也相繼建立，檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性不斷提高[3-6]。

基因芯片又稱DNA芯片或DNA微陣列，是指固著在載體上的高密度DNA微點(diǎn)陣。其原理是根據(jù)核酸的分子雜交衍生而來(lái)，即應(yīng)用已知序列的核酸作為探針，對(duì)未知序列的核酸序列進(jìn)行雜交檢測(cè)[7]?；蛐酒鶕?jù)不同的載體類型以及用途可以分為不同的類型，如基因表達(dá)芯片、測(cè)序芯片、診斷芯片等。同時(shí)針對(duì)不同的芯片類型，又建立了不同的芯片技術(shù)平臺(tái)，比較成熟的有Affymentrix公司的Gene-Chip系列、Agilent公司的aCGH芯片系列、BioPrime公司的ArrayCGH系列、博奧生物的晶芯系列以及Alere公司的ArrayTube系列等。相比于傳統(tǒng)的核酸雜交技術(shù)，基因芯片具有快速、平行、高效、高通量、高靈敏度、可自動(dòng)化操作等特點(diǎn)，自被發(fā)明以來(lái)，在醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)、農(nóng)業(yè)、林業(yè)及環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[8-10]。

生物芯片的核心是核酸雜交技術(shù)，早在20世紀(jì)末期，已經(jīng)有不少學(xué)者將核酸雜交技術(shù)應(yīng)用于植原體的研究中[11]。2004年Herdia等[12]對(duì)DNA芯片在植物病毒、類病毒及植原體病原檢測(cè)上的應(yīng)用潛力進(jìn)行過(guò)報(bào)道。2007年Bertolini[13]將PCR與dot blot相結(jié)合成功的實(shí)現(xiàn)了16SrX組植原體的檢測(cè)。同年，Nicolaisen等[14]針對(duì)植原體的16Sr DNA基因設(shè)計(jì)特異性引物，在BioPrime Array平臺(tái)上建立了可以鑒別和檢測(cè)大部分16Sr 亞組的植原體芯片檢測(cè)方法。2011年Lenz 等[15]報(bào)道了用植原體16S-23S間區(qū)為靶標(biāo)的寡核苷酸芯片區(qū)分不同植原體，獲得了與上述16Sr DNA基因芯片類似的分辨效果；至2015年，Lenz等[16]又選取植原體核糖體蛋白基因rps3，rpl22和rps19作為靶標(biāo)基因，設(shè)計(jì)特異性探針，同樣實(shí)現(xiàn)了植原體不同亞組間的芯片鑒別和檢測(cè)，并嘗試對(duì)田間和混合感染樣品的檢測(cè)。其中，Nicolaisen所采用的方法，由于對(duì)PCR產(chǎn)物使用Cy3-dCTP進(jìn)行標(biāo)記、且需對(duì)標(biāo)記反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行純化，而且雜交反應(yīng)需過(guò)夜，導(dǎo)致檢測(cè)過(guò)程和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，操作較為繁瑣。Lenz的方法，簡(jiǎn)化了雜交的過(guò)程，可以在2小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)，但是其所需設(shè)備比較龐大、昂貴。相比于Lenz所使用的芯片掃描平臺(tái)Tyhoon 900，Alere公司的ATR 03 Reader芯片掃描平臺(tái)，具有設(shè)備簡(jiǎn)單，方便攜帶、快速反應(yīng)的特點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)在2小時(shí)內(nèi)完成雜交，非常適合野外和現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)。

我國(guó)植原體病害發(fā)生嚴(yán)重，而且存在不同亞組的植原體共同危害的現(xiàn)象。為了調(diào)查分析我國(guó)植原體的分類情況，我們將Nicolaisen針對(duì)16Sr DNA所設(shè)計(jì)的探針結(jié)合Alere公司定制的管芯片對(duì)所收集到的植原體進(jìn)行應(yīng)用研究，以期篩選出適用于我國(guó)不同組植原體分類鑒定的特異性探針組，并在此基礎(chǔ)上建立適合于野外使用的管芯片鑒定和檢測(cè)植原體的方法。與此同時(shí)，我們也將此方法應(yīng)用于我國(guó)一些疑似植原體病害的鑒別和分類研究。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所使用的植原體材料及其健康對(duì)照，采集自我國(guó)不同的地區(qū)，其編號(hào)及分類信息詳見表1。CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒(DN14)購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司。PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、以及感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α、克隆載體 pMD18-T均購(gòu)自寶生生物(大連)有限公司。管芯片雜交試劑盒購(gòu)自德國(guó)Alere生物技術(shù)有限公司。

表1 植原體樣品及來(lái)源Table 1 Origin and information of phytoplasma samples

1.2 方法

測(cè)序獲得序列與NCBI上下載的植原體各組代表序列利用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，建樹采用N-J法，Bootstrap 值為1 000，非固醇甾原體(Acholeplasmalaidlawii)和螺原體(Spiroplasmachrysopicola)作為外類群，確定所采集植原體的分類地位。1.2.2 特異性探針設(shè)計(jì)及管芯片定制 參考Nicolaise等[14]針對(duì)植原體的16Sr DNA設(shè)計(jì)的探針組，包含了一對(duì)通用引物Pp-fwd(5’-AGTGGCGAACGGGTGAGTAAC-3’)和Pp-rev (5’-CGTTTACGGCGTGGACTACCAG-3’)以及一組針對(duì)不同組植原體特異性的探針(見表2)。管芯片的制作委托德國(guó)Alere生物技術(shù)有限公司進(jìn)行，將人工合成的探針序列，經(jīng)點(diǎn)樣機(jī)按設(shè)計(jì)的排布點(diǎn)在管芯片中。探針序列及陽(yáng)性對(duì)照在載體上的分布情況(見圖1)。

表2 探針序列Table 2 Probe sequences

1.2.3 靶標(biāo)基因的生物素標(biāo)記及管芯片雜交 本實(shí)驗(yàn)采用生物素標(biāo)記靶標(biāo)基因，方法是在合成設(shè)計(jì)的通用探針的引物Pp-fwd/Pp-rev時(shí)，在引物Pp-rev的5’端進(jìn)行生物素修飾。并以此帶有標(biāo)記的引物組對(duì)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增程序：25 μL擴(kuò)增反應(yīng)體系中含有制備的DNA模板1 μL，正反向引物各0.5 μL(10 μM)，2 × PCR預(yù)混液(0.05 U/μL Taq DNA 聚合酶, 4 mM MgCl2和 0.4 mM dNTPs)12.5 μL，ddH2O補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)程序：94℃ 3 min；94℃ 15 s, 62℃ 30 s, 72℃ 1 min, 共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。管芯片的雜交和洗滌過(guò)程，將PCR產(chǎn)物、純水和雜交緩沖液C1按照1∶9∶90配制雜交混合液，其余參照Alere公司雜交試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行。將芯片掃描的信號(hào)強(qiáng)弱按等級(jí)進(jìn)行劃分，并賦值。最強(qiáng)信號(hào)為Biotin-Marke賦值為10，無(wú)信號(hào)賦值為0，按照雜交信號(hào)的強(qiáng)弱借助軟件Heml 1.0制作雜交結(jié)果的Heatmap圖。

1.2.4 管芯片探針特異性驗(yàn)證和疑似植原體病害材料檢測(cè) 按照管芯片檢測(cè)步驟，分別對(duì)已經(jīng)確立了分類地位的16SrⅠ組、16SrⅡ組、16SrⅤ組和16SrXIX組的植原體組織和對(duì)應(yīng)的健康組織進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)對(duì)采集的疑似植原體病害的植物材料和健康對(duì)照進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證。

1.2.5 管芯片鑒定和檢測(cè)植原體靈敏度測(cè)定 將樣品PaWB-HBBD用引物R16mF2/R16mR1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒純化后，與克隆載體 pMD18-T 16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α中。在含有IPTG和X-gal的LB篩選平板上挑取白色菌落并搖菌培養(yǎng)。用質(zhì)粒純化試劑盒(Takara Mini BEST Ver.2.0)從上述培養(yǎng)液中提取重組質(zhì)粒DNA，并送北京華大基因進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

將上述提取的重組質(zhì)粒DNA，10倍梯度稀釋，并作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增和管芯片檢測(cè)。比較瓊脂糖凝膠電泳和管芯片雜交的檢測(cè)靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 植原體樣品16S rDNA的擴(kuò)增與測(cè)序

應(yīng)用植原體16Sr DNA基因的通用引物R16mF2/R16mR1對(duì)15種植原體侵染植物樣品及其健康對(duì)照的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示所有的健康植物對(duì)照均未出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果。一些疑似植原體病害的發(fā)病組織DNA也未擴(kuò)增出陽(yáng)性的結(jié)果。包括牡丹皺葉黃化(PsYC-BJMTG)和柳樹叢枝(SaWB-NMBT)。剩下的13種具有典型癥狀的發(fā)病組織DNA，均獲得陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果。將具有陽(yáng)性結(jié)果的PCR產(chǎn)物送北京六合華大基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中已報(bào)道的[18]植原體不同組的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖2)。結(jié)果顯示所收集的植原體材料分布在四個(gè)組，分別是16SrⅠ組、16SrⅡ組、16SrⅤ組和16SrXIX組。

2.2 管芯片探針雜交結(jié)果和特異性驗(yàn)證

按照所建立的管芯片檢測(cè)和鑒定植原體的方法對(duì)所收集到的我國(guó)發(fā)生的16Sr不同組植原體的DNA及其健康對(duì)照進(jìn)行管芯片雜交，從雜交結(jié)果的Heatmap圖(圖4)可以看出，Nicolaisen等所設(shè)計(jì)的針對(duì)16Sr DNA基因的探針，與健康植物對(duì)照皆無(wú)雜交信號(hào)，而分別與不同組植原體有強(qiáng)弱不同的雜交信號(hào)。其中17號(hào)探針(Pp-502)作為植原體通用探針能與我國(guó)不同地區(qū)采集的、已系統(tǒng)鑒定的不同組的所有植原體都有很強(qiáng)的雜交信號(hào)，可以成為各種植原體病害初步診斷的理想探針。但另一通用探針16號(hào)(Pp-148)按現(xiàn)有的檢測(cè)方法與條件，其所產(chǎn)生雜交信號(hào)較弱。15號(hào)探針(PpXIV-585)，原是針對(duì)16S rXIV組所設(shè)計(jì)的組特異性探針，但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻顯示其可以和16SrⅠ組、16SrⅤ組和16SrXIX組植原體產(chǎn)生相對(duì)較強(qiáng)的雜交信號(hào)。

注：a：管芯片示意圖；b：探針?lè)植紙D；c：探針點(diǎn)代號(hào)Note: a: ArrayTube diagram; b: Probe distribution; c: Probe code.圖1 管芯片示意及探針?lè)植紙DFig.1 Array diagram and probe distribution

16SrⅠ組的泡桐叢枝、苦楝叢枝、桑樹萎縮和萵苣黃化四種已知分類地位的植原體材料的管芯片雜交結(jié)果來(lái)看，針對(duì)16SrⅠ組所設(shè)計(jì)的組特異性的1號(hào)探針(PpⅠ-465)有很好的特異性。4種16SrⅠ組的樣品均出現(xiàn)較強(qiáng)的雜交信號(hào)，同時(shí)其他組的樣品不出現(xiàn)雜交信號(hào)。同樣，針對(duì)16SrⅡ組所設(shè)計(jì)的組特異性3號(hào)探針(PpⅡ-629)也表現(xiàn)出了良好的組間特異性，所有16SrⅡ組的花生叢枝、甘薯叢枝和臭矢菜叢枝3個(gè)植原體樣品可產(chǎn)生較強(qiáng)的雜交信號(hào)，并且其他組的樣品不出現(xiàn)雜交信號(hào)。但是同樣針對(duì)16SrⅡ組設(shè)計(jì)的另外一個(gè)特異性探針2號(hào)(PpⅡ-471)，卻沒(méi)能出現(xiàn)任何雜交信號(hào)。

16SrⅤ組的棗瘋、櫻桃致死黃化和重陽(yáng)木叢枝三個(gè)植原體樣品所產(chǎn)生的雜交信號(hào)譜較為復(fù)雜且相似，除了通用探針17號(hào)(Pp-502)外和15號(hào)探針(PpXIV-585)出現(xiàn)了較強(qiáng)的雜交信號(hào)外，6號(hào)探針(PpV-221)、8號(hào)探針(PpVII-621)、9號(hào)探針(PpVIII-634)以及16號(hào)探針(Pp-148)均出現(xiàn)了中等強(qiáng)度的雜交信號(hào)。其中只有6號(hào)探針是設(shè)計(jì)的16SrⅤ組特異性探針，與屬于B亞組的棗瘋病和櫻桃致死黃化有中等強(qiáng)度的雜交信號(hào)，但屬于H亞組的重陽(yáng)木叢枝則未出現(xiàn)雜交信號(hào)，較難判斷為陽(yáng)性結(jié)果。

圖2 基于植原體16Sr DNA 序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed based on the 16s DNA of phytoplasm

類似的情況也出現(xiàn)在板栗黃化皺縮植原體樣品中，即除與通用引物16和17號(hào)分別產(chǎn)生中等和很強(qiáng)的雜交信號(hào)外，也與16SrIV和16SrXIV探針有中等強(qiáng)度信號(hào)。根據(jù)Lin[19]的報(bào)道其屬于16SrXIX組，但是Nicolaisen在設(shè)計(jì)探針時(shí)，并沒(méi)有針對(duì)16SrXIX組設(shè)計(jì)特異性的探針，不過(guò)從系統(tǒng)發(fā)育上看16SrXIX組的植原體與16Sr IV組的植原體關(guān)系較近，因此在板栗黃化皺縮植原體樣品的管芯片雜交結(jié)果中，16Sr IV組的特異性探針5號(hào)(PpIV-630)出現(xiàn)了較弱的信號(hào)。

A：泡桐叢枝; B：健康泡桐; C：花生叢枝; D：健康花生; E：棗瘋病; F：健康棗樹; G：板栗皺縮黃化; H：健康板栗A: Paulownia witches-broom; B: Health paulownia; C: Peanut witches-broom; D: Health peanut; E: Jujube witches-broom; F: Health jujube; G: chestnut yellows crinkle; H: Health chestnut圖3 芯片雜交結(jié)果Fig.3 Results of ArrayTube hybridization

注：圖中雜交信號(hào)越強(qiáng)，顏色越紅，藍(lán)色為沒(méi)有雜交信號(hào)Note: The strong hybridization signal was red, blue repsented no signal圖4 芯片雜交結(jié)果的Heatmap圖Fig.4 Heatmap of ArrayTube Hybridization

另外，我國(guó)發(fā)生的4個(gè)組共13個(gè)植原體皆與所設(shè)計(jì)的針對(duì)與16SrIII、VI、X和XII四個(gè)組的所有探針無(wú)任何雜交信號(hào)，表明不存在于這些組的交叉反應(yīng)問(wèn)題，也意味著這些植原體樣品不存在與這四個(gè)組植原體的混合感染。

2.3 不同組植原體序列與寡核苷酸探針序列比對(duì)

將通過(guò)測(cè)序獲得的各個(gè)組的序列與所有具有雜交信號(hào)的探針序列進(jìn)行比對(duì)，計(jì)算各組序列與探針序列的匹配率(見表3)?？梢钥闯?，通用探針Pp-148和Pp-502與測(cè)定的四個(gè)組植原體的對(duì)應(yīng)序列幾乎完全匹配，僅16SrII組樣品序列與Pp-502探針有一個(gè)堿基的差別。16SrI組樣品序列與PpⅠ-465探針序列完全匹配。16SrII組樣品序列與PpⅡ-629探針序列完全匹配。從而確證了所設(shè)計(jì)的這幾個(gè)探針鑒定植原體的特異性和準(zhǔn)確性。然而也發(fā)現(xiàn)雖然16SrV組植原體樣品的序列與所設(shè)計(jì)的組特異性探針PpV-221探針序列完全匹配，。但是從雜交的結(jié)果上來(lái)看，雜交信號(hào)的強(qiáng)弱并不跟其序列的匹配率成完全的正相關(guān)(參見圖4)；，如通用探針Pp-148與四個(gè)組樣品的序列都完全匹配，但是其雜交的信號(hào)強(qiáng)度顯著弱于通用探針Pp-502。而且同樣，16SrV組樣品序列與PpV-221探針序列完全匹配，與PpⅦ-621探針序列有3個(gè)堿基的錯(cuò)配，與PpⅧ-634探針序列有4個(gè)堿基的錯(cuò)配，與PpXIV-585探針序列有3個(gè)堿基的錯(cuò)配，但是該組植原體與PpⅦ-621、PpⅧ-634和PpXIV-585探針?biāo)鶎?duì)應(yīng)的雜交信號(hào)卻都明顯強(qiáng)于PpV-221探針。甚至，16SrI組樣品序列與PpXIV-585探針序列錯(cuò)配堿基達(dá)到了7個(gè)，但是也出現(xiàn)了較很強(qiáng)的雜交信號(hào)。因而，我們認(rèn)為，在現(xiàn)行的Alere公司提供的試劑和雜交條件下，Nicolaisen等設(shè)計(jì)的針對(duì)16SrV、VIII、XIV等組的探針并非檢測(cè)和鑒定相應(yīng)組植原體的特異性理想探針。另外尚不清楚為什么雖然通用探針Pp-148與測(cè)定的四個(gè)組植原體樣品的序列也都完全匹配，但是其雜交的信號(hào)強(qiáng)度總是顯著弱于通用探針Pp-502。

表3 不同組樣品序列與各探針的匹配率Table 3 Matching ratio between different sample sequences and probes

注：括號(hào)內(nèi)為錯(cuò)配的堿基數(shù)，匹配率：(探針堿基總數(shù)-錯(cuò)配堿基數(shù))/探針堿基總數(shù)

Note: The number of mispairing base was indicated in brackets, matching ratio: (total number of probe bases-the number of mispairing base)/Total number of probe bases

2.4 管芯片鑒定和檢測(cè)植原體靈敏度

將泡桐叢枝樣品PaWB-HBBD的16Sr DNA基因擴(kuò)增后，連接到克隆載體pMD18-T上后組建重組質(zhì)粒，提取重組的質(zhì)粒，純化后進(jìn)行10倍梯度稀釋，并作為模板分別進(jìn)行PCR檢測(cè)和管芯片檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以植原體通用引物R16mF2/R16mR1的傳統(tǒng)PCR檢測(cè)，在質(zhì)粒濃度稀釋到10-4倍時(shí)，達(dá)到凝膠電泳的檢測(cè)限度(見圖5)。但是管芯片檢測(cè)在質(zhì)粒稀釋到10-7倍時(shí)，仍可出現(xiàn)較好的雜交信號(hào)(見圖6)。因此可以表明相比于傳統(tǒng)PCR檢測(cè)，管芯片檢測(cè)植原體的方法的靈敏度提高了1 000倍。并且采用管芯片檢測(cè)的方法，不僅能實(shí)現(xiàn)靈敏度的提高，還能實(shí)現(xiàn)植原體不同組的鑒定。而且當(dāng)稀釋度達(dá)到10-7時(shí)，與16SrXIV組探針的交叉雜交信號(hào)也明顯減弱，而16SrI?；蕴结樅屯ㄓ锰结樀男盘?hào)仍較強(qiáng)。

圖5 PCR檢測(cè)靈敏度Fig.5 PCR detection sensitivity

圖6 管芯片檢測(cè)靈敏度Fig.6 ArrayTube detection sensitivity

2.5 疑似植原體病害的檢測(cè)與鑒定

近年來(lái)，我國(guó)不同地方出現(xiàn)了一些園林綠化樹種的未知病害，如發(fā)生在北京市門頭溝戒臺(tái)寺的牡丹黃化皺葉病害，其具有典型的植原體病害特征，如皺葉、黃化、叢枝、巨芽等。發(fā)生在內(nèi)蒙古包頭市的柳樹叢枝病害，同樣出現(xiàn)小葉、叢枝等典型癥狀。以及河南濮陽(yáng)發(fā)生的紅花槐叢枝、福建福州出現(xiàn)的長(zhǎng)春花黃化叢枝均為第一次發(fā)現(xiàn)。

圖7 疑似植原體病害癥狀Fig.7 The symptom of suspected phytoplasma disease

我們將新建立的管芯片鑒定與檢測(cè)植原體的方法應(yīng)用于這些未知疑似植原體病害的檢測(cè)與鑒定中。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，牡丹黃化皺葉和柳樹叢枝樣品，均沒(méi)能出現(xiàn)陽(yáng)性雜交信號(hào)。紅花槐叢枝產(chǎn)生了很好的雜交信號(hào)，并且雜交結(jié)果和16SrⅤ組的棗瘋病、重陽(yáng)木叢枝等結(jié)果相一致。因此可以判定引起河南濮陽(yáng)紅花槐叢枝的病原是屬于16SrⅤ組的植原體。同樣長(zhǎng)春花黃化叢枝的雜交結(jié)果與16SrI組的泡桐叢枝病、苦楝叢枝病等相一致，因此判定出現(xiàn)在福建福州的長(zhǎng)春花黃化叢枝的病原菌為16SrI組的植原體。

3 討論

植物病害的準(zhǔn)確快速診斷、病菌的檢測(cè)與鑒別是病害防治的前提與基礎(chǔ)。植原體的檢測(cè)與鑒別目前主要依靠針對(duì)16Sr DNA的PCR擴(kuò)增及測(cè)序來(lái)進(jìn)行。生物芯片技術(shù)作為新興的高度集成化的分析和研究手段，在植物病原檢測(cè)與鑒定方面，因其無(wú)可比擬的高信息量、高通量、靈敏、快速和準(zhǔn)確的特點(diǎn)顯示出了巨大潛力。特別是針對(duì)一些混合感染的植物病害，生物芯片由于可以同時(shí)針對(duì)不同的病原設(shè)計(jì)檢測(cè)探針，其檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)將更加明顯。Lenz等對(duì)rp基因設(shè)計(jì)的探針芯片采用多引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行芯片雜交，證明不同組植原體間的兩兩人工混樣可以被同時(shí)檢測(cè)，而且也能從田間采集的樣品中檢測(cè)出16SrI組和16SrX組植原體的混合感染。本研究將Nicolaisen所設(shè)計(jì)16Sr DNA探針整合到Alere公司的管芯片和ATR 03 Reader芯片掃描平臺(tái)上，用生物素標(biāo)記引物直接PCR，建立在管狀芯片內(nèi)進(jìn)行植原體鑒定和檢測(cè)的方法。首次利用植原體管芯片并結(jié)合序列分析技術(shù)，對(duì)我國(guó)植原體病原種類進(jìn)行系統(tǒng)的比較鑒定和生態(tài)調(diào)查，進(jìn)一步明確了我國(guó)不同地區(qū)、不同寄主植物上發(fā)生的重要植原體病原的分類地位。

3.1 管芯片探針的特異性對(duì)植原體檢測(cè)的影響

在收集到的11種已確定分類地位的植原體以及4種疑似植原體病害材料的管芯片檢測(cè)中，結(jié)果顯示16Sr DNA基因的探針，與健康植物對(duì)照皆無(wú)雜交信號(hào)，而分別與不同組植原體有強(qiáng)弱不同的雜交信號(hào)。由此肯定所設(shè)計(jì)的17種探針都具植原體特異性，因而都具備植原體病害診斷和病原檢測(cè)價(jià)值；特別是17號(hào)探針(Pp-502)作為植原體通用探針能與我國(guó)不同地區(qū)采集的、已系統(tǒng)鑒定的不同組的所有植原體都有很強(qiáng)的雜交信號(hào)，因而是確定各種植原體侵染和病害初步診斷的首選通用探針。組特異性的1號(hào)探針(PpⅠ-465)對(duì)4種不同寄主植物上的16SrⅠ組植原體均有很好的鑒定效果，且與其它組的樣品不出現(xiàn)交叉雜交信號(hào)。3號(hào)探針(PpⅡ-629)對(duì)16SrⅡ組的分別來(lái)源于福建泉州的花生叢枝和甘薯叢枝及海南三亞的臭矢菜叢枝3個(gè)植原體專化性理想。所以1號(hào)探針和3號(hào)探針可以作為16SrⅠ組和16SrⅡ組植原體?；澡b定的鑒定探針。

1：牡丹黃化皺縮; 2：健康牡丹; 3：柳樹叢枝; 4：健康柳樹; 5：紅花槐叢枝; 6：健康槐樹; 7：長(zhǎng)春花黃化叢枝; 8：健康長(zhǎng)春花1: Peony yellows crinkle; 2: Health peony; 3: Willow witch-broom; 4: Health willow; 5: Robinia hispida L. witches-broom; 6: Health Robinia hispida L.; 7: Periwinkle yellow and witches-broom; 8: Health periwinkle圖8 疑似植原體病害管芯片雜交結(jié)果Fig.8 ArryayTube hybridization of suspected phytoplasma disease

16SrⅤ組的組特異性探針(PpV-221)與我國(guó)發(fā)生的該組B亞組的棗瘋和櫻桃致死黃化和H亞組的重陽(yáng)木叢枝植原體的特異性較差，專化性雜交信號(hào)較弱，且與其他組的探針存在不同程度的交叉雜交現(xiàn)象。從我們所建立的系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看出16SrVII組的Erigeron witches’-broom[18]和16SrVIII組的Loofah witches’-broom[20]在進(jìn)化上與16SrⅤ組的植物原體較近，因此其16Sr RNA相似度較高，探針的序列比對(duì)也顯示，它們之間僅有幾個(gè)堿基的差別，因此會(huì)出現(xiàn)交叉雜交反應(yīng)。但對(duì)比這三個(gè)16SrV組植原體探針雜交結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)三者具有相似陽(yáng)性雜交點(diǎn)陣圖，似乎可以作為該組植原體的特征性識(shí)別標(biāo)簽或指紋。比如，田間采集的福建福州的長(zhǎng)春花黃化叢枝的芯片雜交點(diǎn)陣圖與16SrI組的所有植原體芯片檢測(cè)結(jié)果完全一致，因而應(yīng)鑒定為該組植原體。而發(fā)生在河南濮陽(yáng)的紅花槐叢枝應(yīng)是16SrV組植原體侵染所致。從常規(guī)PCR的測(cè)序驗(yàn)證上也印證了芯片雜交結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.2 管芯片檢測(cè)技術(shù)的影響因素

探針核酸分子與待檢測(cè)樣本中的目標(biāo)核酸分子的結(jié)合緊密程度，決定了雜交反應(yīng)的熒光信號(hào)強(qiáng)度。由于AT與GC結(jié)合的自由能有差別，不同的探針在雜交熱力學(xué)性質(zhì)上有差別。在雜交的過(guò)程中，雜交的溫度，雜交溶液中的Na+、Mg2+離子濃度以及溶液的pH值都會(huì)影響雙鏈DNA的穩(wěn)定性。本研究中所采用的雜交體系，與Nicolaisen等所報(bào)道的并不完全相同，因此在結(jié)果上產(chǎn)生了不同組之間的交叉雜交信號(hào)。也可能正是由于雜交條件的不同，使得在匹配率上完全匹配的通用探針Pp-148并沒(méi)有出現(xiàn)較好的雜交結(jié)果。

基于16Sr DNA和16S-23S間區(qū)序列設(shè)計(jì)的芯片目前也存在技術(shù)難點(diǎn)。由于擴(kuò)增產(chǎn)生的片段不能過(guò)長(zhǎng)，不同組之間16SrRNA的變異性不高，設(shè)計(jì)區(qū)分度很高的探針具有一定的難度。加之植原體大都具有兩個(gè)核糖體操縱子，因而如果其中一個(gè)操縱子發(fā)生了變異，將直接影響鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。進(jìn)一步選擇單拷貝、且變異程度較高的靶標(biāo)基因?yàn)閞p基因仍具有一定的局限性，不能實(shí)現(xiàn)針對(duì)如16Sr VIII, XI, XIII, XIV, XV組的植原體的檢測(cè)[16]。因此進(jìn)一步的研究可以通過(guò)選擇一些相對(duì)保守，又有一定變異性的、單拷貝基因作為探針設(shè)計(jì)的靶標(biāo)基因，來(lái)實(shí)現(xiàn)不同組之間、組內(nèi)不同亞組乃至不同植原體株系的的區(qū)分。利用管芯片技術(shù)對(duì)支原體[21]和其他細(xì)菌菌株[22-23]的基因分型已有成功的報(bào)道。

3.3 管芯片檢測(cè)技術(shù)具有較高的靈敏度

芯片檢測(cè)靈敏度的實(shí)驗(yàn)表明，相比于傳統(tǒng)PCR的方法，管芯片的檢測(cè)方法靈敏度提高了1 000倍。這可能是兩個(gè)方面的原因：首先管芯片的檢測(cè)技術(shù)是在PCR擴(kuò)增的基礎(chǔ)上，結(jié)合顏色反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)果的判定，其中由酶促反應(yīng)介導(dǎo)的生物素與底物的顏色反應(yīng)是一個(gè)信號(hào)放大的過(guò)程，因此提高了靈敏度。其次管芯片檢測(cè)在第一步擴(kuò)增時(shí)，所使用的引物組為Pp-fwd/Pp-rev所擴(kuò)增的片段遠(yuǎn)小于引物組R16mF2/R16mR1。因此在同樣循環(huán)的情況下，短片段的擴(kuò)增效率更高。

3.4 管芯片技術(shù)在植原體檢測(cè)方面具有較大的應(yīng)用潛力

植原體病害，具有一些典型的癥狀，如黃化、叢枝等。這些病害作為生產(chǎn)上急需解決的疑難問(wèn)題，其檢測(cè)與鑒定對(duì)開展相應(yīng)的植物保護(hù)措施具有指導(dǎo)性的意義。1994年 KHADHAIR[24]首次報(bào)道了發(fā)生在加拿大埃德蒙頓地區(qū)的柳樹叢枝病。2012年Zhang[25]報(bào)道了發(fā)生在我國(guó)內(nèi)蒙古鄂爾多斯等地區(qū)的柳樹叢枝病，并根據(jù)其16Sr DNA的RFLP分析，將其歸類為16SrVI-A組。針對(duì)我國(guó)出現(xiàn)的一些疑似植原體的病害如牡丹黃化皺葉和柳樹叢枝。我們也進(jìn)行了管芯片的檢測(cè)研究。但是根據(jù)我們管芯片的檢測(cè)結(jié)果中，柳樹叢枝和牡丹黃化皺葉的樣品并沒(méi)有明顯的植原體信號(hào)產(chǎn)生。相比與采用的巢氏PCR的方法，管芯片的檢測(cè)靈敏度較弱。但是考慮到巢氏PCR假陽(yáng)性結(jié)果較高，因此柳樹叢枝植原體的鑒定方面，需要其他方法相互驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究基于管芯片技術(shù)平臺(tái)建立了植原體病害檢測(cè)與鑒定的新方法，篩選出一系列具有特異性的探針。所建立的新的檢測(cè)方法，相較于普通PCR，其檢測(cè)靈敏度提高，省去序列分析鑒定步驟，且具有結(jié)果穩(wěn)定可靠、高通量和檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。因而，在植原體病原菌的診斷、檢測(cè)、鑒定和系統(tǒng)分類及病害生態(tài)調(diào)查中會(huì)具有較大的應(yīng)用潛力。

應(yīng)用管芯片檢測(cè)技術(shù)，對(duì)疑似植原體病害的診斷結(jié)果顯示河南濮陽(yáng)的紅花槐叢枝的病原應(yīng)為16SrV組植原體，福建福州的長(zhǎng)春花黃化叢枝應(yīng)為16SrⅠ組植原體；而北京戒臺(tái)寺牡丹黃化皺葉和內(nèi)蒙古包頭柳樹叢枝未出現(xiàn)任何植原體?；碾s交信號(hào)。同時(shí)在本次田間調(diào)查和采樣過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)一些植原體病害已分布范圍廣、危害嚴(yán)重，如泡桐叢枝、棗瘋病等；而另一些病害，比如四川西昌的櫻桃致死黃化、北京懷柔的板栗黃化皺縮、福建泉州的花生和甘薯叢枝、永安的萵苣黃化等。雖然為區(qū)域性病害，但危害和造成的經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重，且存在進(jìn)一步擴(kuò)展蔓延的風(fēng)險(xiǎn)。

管芯片雜交技術(shù)作為一種檢測(cè)和鑒別植原體的新方法，可應(yīng)用于我國(guó)植原體病害調(diào)查和診斷，并為植原體病害更為科學(xué)有效的防控提供技術(shù)支撐。

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(責(zé)任編輯：崔 貝)

Diagnostics and Detection of Different Groups Phytoplasmas in China Using an Oligonucleotide Microarray on the Platform of ArrayTube

WANGSheng-jie,LINCai-li,YANDong-hui,YUShao-shuai,LIYong,WANGLai-faPIAOChun-gen,GUOMin-wei,HUAIWen-xia,TIANGuo-zhong

(Key Laboratory of Forest Protection of State Forestry Administration, Research Institute of Forest Ecology, Environment and Protection,Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China)

[Objective]To find the optimal specific probe and develop the detection technique using oligonucleotide microarray on the platform of ArrayTube to detect and identify the phytoplasmas associated with plant disease in China. [Method]PCR amplification and microarray hybridization were used to detect 15 symptomatic plants probably infected with phytoplasma and asymptomatic plants as healthy controls collected from different regions in China. [Result] Phytoplasma 16S rDNA were detected in 13 of 15 symptomatic plants but not in all the healthy controls. Thirteen phytoplasmas were classified into 16Sr I, 16Sr II, 16Sr V and 16Sr XIX groups. Among 17 tested probes, the universal probe designated Pp-502 could be used to detect all phytoplasmas associated with plant disease. The specific probe designated Pp I-465 for 16Sr I group could be used to detect four phytoplasma strains of 16Sr I group associated with paulownia witches’-broom, chinaberry witches’-broom, mulberry dwarf and lettuce yellows. The probe Pp II-629 for 16Sr II could be used to detect three phytoplasma strains 16Sr II group associated with peanut witches’-broom, sweet potato witches’-broom and cleome witches’-broom. Three phytoplasma strains of 16Sr V associated with jujube witches’-broom, cherry lethal yellows andBischofiapolycarpawitches broom and chestnut yellows crinkle phytoplasma of 16Sr XIX could also be detected by specific probes, but they showed obvious cross hybridization with other group probes. Compared with PCR amplification, the sensitivity of microarray to detect phytoplasma in plant increased by 1000-fold. Phytoplasmas of 16SrI and 16SrV group respectively were detected in periwinkle with symptoms of phyllody and witches’-broom collected from Fujian province andRobiniahispidawith symptom of witches’-broom collected from Henan province. While no phytoplasma was detected in peony with symptom of yellowing collected from Beijing and willow with symptom of witches’ broom collected from Inner Mongolia Autonomous Region. [Conclusion]The oligonucleotide microarray on the platform of ArrayTube could be used as a method to investigate phytoplasmas in China, and could provide a sound basis for the phytoplasma identification and classification.

Phytoplasma; detection and identification; 16Sr DNA gene; ArrayTube

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.01.014

2016-02-01

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展科技計(jì)劃(863)課題(2012AA101501)、林業(yè)微生物資源子平臺(tái)運(yùn)行與服務(wù)項(xiàng)目(NIMR2016-7)。

王圣潔(1989—)，男，博士研究生。主要方向：分子植物病理。E-mail:wsjguoyang@126.com
* 致謝：德國(guó)Alere公司Regina Heinze博士、孫曉明碩士等提供的技術(shù)幫助；河南濮陽(yáng)林科院謝守江、包頭林科所王立清、北京戒臺(tái)寺等提供病害樣品；北京農(nóng)學(xué)院任爭(zhēng)光博士提取部分DNA樣品
** 共同通訊作者：田國(guó)忠，研究員，博士生導(dǎo)師，從事分子植物病理研究。E-mail: tian3691@163.com；嚴(yán)東輝，研究員，碩士生導(dǎo)師，從事樹木微生物及寄主-病原分子互作研究。E-mail: yandh@caf.ac.cn

S763.1

A

1001-1498(2017)01-0099-12