徐宗昌王萌孔英珍

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草遺傳改良與生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，青島 266101；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081）

煙草堿法提取基因組DNA的改進(jìn)

徐宗昌1，2王萌1，2孔英珍1

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草遺傳改良與生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，青島 266101；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081）

為能夠快速高效的對大量轉(zhuǎn)基因煙草樣品進(jìn)行DNA提取，對堿法提取煙草組織DNA的方法進(jìn)行了改進(jìn)。采用0.01 mol/L的NaOH溶液為提取液，破碎轉(zhuǎn)基因煙草葉片組織后無需經(jīng)過加熱煮沸中和等步驟，上清液可直接用作PCR反應(yīng)的模板。結(jié)果表明，0.01-0.1 mol/L之間的NaOH溶液制備的DNA模板均能成功擴(kuò)增，該方法制備的DNA模板不依賴特殊的反應(yīng)條件，多種品牌的PCR Mix均能成功進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。與傳統(tǒng)SDS提取法和試劑盒提取法獲得的DNA相比，PCR結(jié)果沒有明顯差異。此提取方法在小麥、高粱、水稻、玉米等作物上也取得了很好的實(shí)驗(yàn)效果。通過本方法制備的DNA模板，其PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物可直接用來測序分析。該方法使用儀器少，樣品消耗少，快速、簡便、成本低，沒有交叉污染，能夠在短時間內(nèi)處理大量樣品，因此能夠?qū)Υ罅康霓D(zhuǎn)基因煙草樣品進(jìn)行DNA的快速提取和鑒定。

煙草；DNA提取；堿裂解；PCR；轉(zhuǎn)基因檢測

煙草（Nicotiana tabacum）目前是國內(nèi)一種重要的經(jīng)濟(jì)作物。培育優(yōu)質(zhì)、低害、抗病抗逆、適產(chǎn)的煙草品種是目前煙草育種的主要目標(biāo)［1］。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的逐漸成熟，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成為煙草育種的重要方法［2］。近年來，隨著Crispr-Cas9技術(shù)的發(fā)展，在煙草基因組中定點(diǎn)突變一個或多個基因甚至是整個基因家族成為可能。該技術(shù)能夠?qū)δ繕?biāo)性狀進(jìn)行精確改良，通過篩選得到穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系，不僅能夠縮短作物的育種周期，還能夠解決傳統(tǒng)育種方法不易解決的問題，如有害性狀與優(yōu)良性狀的緊密連鎖不易打破分離［3］。這給煙草的轉(zhuǎn)基因育種帶來了新的機(jī)遇。

為了降低假陽性的存在，在抗性培養(yǎng)基上長出的轉(zhuǎn)基因苗還需進(jìn)行進(jìn)一步的檢驗(yàn)。目前，多采用簡便快捷，靈敏度高的PCR方法進(jìn)行這一檢測［4］。而要進(jìn)行PCR檢測則首先需對被檢測樣品進(jìn)行DNA提取。目前，在眾多植物種類中應(yīng)用最廣泛的提取DNA的方法是采用商業(yè)化的試劑盒或是基于CTAB/ SDS裂解后的酚：氯仿抽提法［5，6］或者是由此為基礎(chǔ)衍生而來的改良法。然而，這些方法都需要在液氮或是冷凍干燥條件下將樣品粉碎，緊接而來的是很多繁瑣的步驟進(jìn)行DNA的純化。這些方法不僅使用了很多有害試劑和昂貴的試劑儀器，并且使用的植物組織多，步驟繁瑣費(fèi)時，因此當(dāng)需要檢測的轉(zhuǎn)基因植株較多時，這些方法顯得不太適用。在植物領(lǐng)域也有一些快速提取DNA的方法報道［7-15］。然而，所有這些建立在堿液裂解基礎(chǔ)上的快速提取方法模板在進(jìn)行PCR之前都需要進(jìn)行加熱/煮沸或者加入中和液（TE或者Tris-HCl）進(jìn)行中和。這一些額外的步驟顯然會增加樣品之間的交叉污染，樣品多時也會耗費(fèi)大量時間。

隨著煙草基因組測序的完成和眾多煙草突變體庫的建立，突變體的篩選以及煙草轉(zhuǎn)基因的研究勢必迅速發(fā)展。而這些研究則需要提取大量煙草單株的基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增來篩選目的單株。因此，本實(shí)驗(yàn)以前人的研究結(jié)果為基礎(chǔ)，對NaOH堿裂解法提取煙草基因組進(jìn)行改進(jìn)，使其在進(jìn)行大量樣品的處理時更加簡便、有效，旨為轉(zhuǎn)基因煙草分子育種的實(shí)際應(yīng)用創(chuàng)造良好的條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 煙草轉(zhuǎn)基因植株采用的是通過Crispr-Cas9基因組編輯技術(shù)對煙草兩個木糖基轉(zhuǎn)移酶基因Ntab0067020和Ntab0104030進(jìn)行編輯的T0代植株，對照植株為非轉(zhuǎn)基因植株K326；該實(shí)驗(yàn)用到的甜高粱由本實(shí)驗(yàn)室保存；該實(shí)驗(yàn)用到的棉花、小麥、玉米和水稻材料由山東省農(nóng)科院棉花研究室提供。

1.1.2 主要試劑與儀器 1 mol/L，0.5 mol/L，0.25 mol/L，0.1 mol/L，0.05 mol/L，0.01 mol/L和 0.001 mol/L的NaOH溶液；SDS提取方法參考Edwards（1991）［5］，所用到SDS，Tris等試劑均從青島塞恩斯試劑公司訂購；DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；2×Taq PCR Mix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司（2×EasyTaq PCR SuperMix+dye，AS111）、青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司（2×TSINGKE Master Mix，TSE004）、Thermo Scientific公司（2×DreamTaq Green PCR Master Mix，K1081）和青島生物科技MDBio公司（2×PCR Master Mix，P002）；PCR 擴(kuò)增儀T100 Thermocycle（Bio-Rad）；自動磨樣機(jī)（Qiagen TissueLyser II）等實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器。

1.2 方法

1.2.1 模板制備 一個直徑0.25 mm的鋼珠和250 μL 提取液事先加入2 mL的離心管中，然后取大約10 mm2的植物葉片組織放入。在磨樣機(jī)上以23 Hz頻率磨樣2 min，1 μL上清即可直接作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.2.2 引物設(shè)計 本實(shí)驗(yàn)所用到的引物均用在線設(shè)計網(wǎng)站Oligo Calc（http://biotools.nubic.northwestern. edu/OligoCalc.html）進(jìn)行設(shè)計，引物名稱和序列見表1。引物均在青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.3 PCR體系和擴(kuò)增程序 PCR擴(kuò)增體系采用20 μL反應(yīng)體系，包括2× PCR Mix 10 μL，前引物和后引物各 6 pmol，DNA模板1 μL，用ddH2O補(bǔ)齊體積。PCR擴(kuò)增程序如下：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，36個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。取6 μL PCR 產(chǎn)物在150 V電壓，1.5%瓊脂糖凝膠中電泳15 min檢測擴(kuò)增情況。凝膠用EB進(jìn)行染色，凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

表1 本研究所用到的引物

1.2.4 NaOH溶液濃度篩選 本實(shí)驗(yàn)不經(jīng)加熱煮沸及中和等步驟，采用上清直接作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，因此需對堿提取液的濃度進(jìn)行篩選。取煙草品種K326的葉片放入不同濃度梯度的NaOH提取液中（0.001-1 mol/L共7個濃度梯度），用磨樣機(jī)打碎，取1 μL上清液作為模板，用引物Ntab0067020-SF/ Ntab0067020-SR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選合適的NaOH濃度。

1.2.5 適宜NaOH濃度提取液在不同品牌PCR Mix中的擴(kuò)增穩(wěn)定性 將煙草品種K326的葉片在適宜NaOH濃度提取液中磨碎，取1 μL上清液作為模板，使用購自上述（1.1.2）4家公司的PCR Mix用引物Ntab0067020-SF/Ntab0067020-SR和 Ntab0104030-SF/Ntab0104030-SR進(jìn)行擴(kuò)增，檢驗(yàn)篩選到的適宜NaOH濃度提取液在不同品牌PCR Mix中的擴(kuò)增穩(wěn)定性。

1.2.6 本實(shí)驗(yàn)方法與傳統(tǒng)方法擴(kuò)增結(jié)果的比較 煙草品種K326葉片分別用SDS和本實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行DNA提取，各取1 μL DNA溶液作為模板，用引物Ntab0067020-SF/Ntab0067020-SR和 Ntab0104030-SF/Ntab0104030-SR及另外兩個半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基 因Ntab0733630和Ntab0774310的 特 異 引 物Ntab0733630-SF/Ntab0733630-SR和 Ntab0774310-SF/Ntab0774310-SR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)行結(jié)果比較。

1.2.7 本實(shí)驗(yàn)方法在鑒定煙草轉(zhuǎn)基因植株上的應(yīng)用 通過Crispr-Cas9技術(shù)編輯的兩個煙草木糖基轉(zhuǎn)移酶基因Ntab0067020和Ntab0104030的陽性植株已通過PCR產(chǎn)物連接TA克隆載體，對單菌落進(jìn)行挑菌測序得到驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)采用兩個基因的特異引物Ntab0067020-SF/Ntab0067020-SR和Ntab0104030-SF/Ntab0104030-SR，采用NaOH提取法獲得模板對可能存在的編輯區(qū)段擴(kuò)增進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的DNA片段進(jìn)行回收純化，直接測序，進(jìn)行結(jié)果比對，驗(yàn)證該方法在煙草轉(zhuǎn)基因植株鑒定工作中的適用性。

1.2.8 本實(shí)驗(yàn)方法對其他作物進(jìn)行PCR擴(kuò)增 小麥、甜高粱、煙草、棉花、水稻和玉米分別用試劑盒和本實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行DNA提取，用各自的ACTIN基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析比較，驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)方法在其他作物上應(yīng)用的可能性。所用引物，見表1。

2 結(jié)果

2.1 適宜NaOH提取液濃度篩選

如圖1所示，0.01 mol/L-0.1 mol/L之間的NaOH溶液制備的DNA模板均能擴(kuò)增出條帶，說明NaOH溶液粗提物可以直接作為PCR反應(yīng)的模板。0.001 mol/L的NaOH溶液提取的模板雖然也能擴(kuò)增出條帶，但條帶亮度較弱，而高于0.25 mol/L（包含0.25 mol/L）的NaOH溶液制備的DNA模板則不能擴(kuò)增出條帶。從擴(kuò)增效果和節(jié)約試劑的角度考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇0.01 mol/L 的NaOH溶液作為提取液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 不同品牌PCR Mix擴(kuò)增結(jié)果

如圖2所示，本實(shí)驗(yàn)室及所內(nèi)其他實(shí)驗(yàn)室常用的4種不同品牌PCR Mix對0.01 mol/L NaOH濃度制備的K326模板用引物Ntab0067020-SF/Ntab00670-20-S和Ntab0104030-SF/Ntab0104030-SR進(jìn)行擴(kuò)增，4種PCR Mix均能擴(kuò)增出明亮單一的條帶，擴(kuò)增結(jié)果之間沒有明顯的差異。

圖1 不同濃度NaOH溶液提取模板PCR結(jié)果電泳圖

圖2 NaOH提取法在不同品牌PCR Mix中擴(kuò)增反應(yīng)穩(wěn)定性電泳圖

2.3 不同DNA提取方法擴(kuò)增結(jié)果比較

對用傳統(tǒng)SDS方法提取的DNA作為模板和NaOH法提取的DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果進(jìn)行比較。如圖3所示，4個糖基轉(zhuǎn)移酶基因特異引物 Ntab0733630-SF/Ntab0733630-SR、Ntab0774310-SF/Ntab0774310-SR、Ntab0067020-SF/Ntab0067020-SR和Ntab0104030-SF/Ntab0104030-SR在SDS法和NaOH法提取的DNA模板上進(jìn)行擴(kuò)增均能擴(kuò)增出條帶清晰，明亮的條帶。兩種方法制備的模板PCR擴(kuò)增結(jié)果沒有顯著差異。

圖3 SDS方法與NaOH提取法擴(kuò)增結(jié)果對比電泳圖

2.4 本實(shí)驗(yàn)方法在鑒定煙草轉(zhuǎn)基因植株上的應(yīng)用

本實(shí)驗(yàn)對實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)確認(rèn)的兩個通過Crispr-Cas9技術(shù)編輯的煙草木糖基轉(zhuǎn)移酶基因Ntab0067020和Ntab0104030的陽性植株在編輯位點(diǎn)附近設(shè)計了兩個基因的特異引物Ntab0067020-SF/Ntab0067020-SR和Ntab0104030-SF/Ntab0104030-SR，采用NaOH提取法獲得模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序驗(yàn)證。如圖4-A、4-B所示，引物Ntab0067020-SF/Ntab0067020-SR和Ntab0104030-SF/Ntab0104030-SR在對照和轉(zhuǎn)基因植株上均能擴(kuò)增出明亮單一的條帶。對PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行測序，測序結(jié)果如圖4-C、4-D所示，以A1、A3、A7、A8和B1、B3、B7和B8植株的測序結(jié)果為例，A3和B3植株為已知轉(zhuǎn)入Crispr-Cas9載體但未能在基因組上成功編輯的植株，基因特異引物擴(kuò)增測序結(jié)果分別與對照A1和B1一致；而A7、A8和B7、B8是在基因組上成功編輯的植株，可以看到在這4株植株上擴(kuò)增的片段在各自的靶位點(diǎn)上都進(jìn)行了編輯，存在堿基的插入/缺失，這與我們之前的鑒定結(jié)果一致。說明本實(shí)驗(yàn)方法提取的DNA模板可以用來對通過Crispr-Cas9技術(shù)編輯的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行陽性苗的鑒定。

2.5 本實(shí)驗(yàn)方法在其他作物上的應(yīng)用

如圖5所示，對小麥、高粱、煙草、棉花、水稻及玉米等作物的幼葉用試劑盒及NaOH兩種方法制備的模板進(jìn)行ACTIN基因的擴(kuò)增。結(jié)果表明，通過試劑盒方法制備的模板能在5種作物上擴(kuò)出條帶，而通過NaOH方法制備的模板在棉花中的擴(kuò)增失敗，但在其他4種作物上均能夠擴(kuò)增出條帶，且與試劑盒擴(kuò)增的效果基本一致，在煙草和水稻中甚至能擴(kuò)增出長達(dá)1.5 kb的片段。

圖4 NaOH提取法在煙草轉(zhuǎn)基因植株鑒定中的應(yīng)用

圖5 NaOH提取法在其他作物上擴(kuò)增結(jié)果電泳圖

3 討論

本研究的主要目的是對堿裂解提取植物基因組的方法進(jìn)行改進(jìn)，并應(yīng)用到煙草中以適用于大量轉(zhuǎn)基因煙草陽性株的鑒定工作，節(jié)約時間成本。本研究所改進(jìn)的DNA提取方法使用儀器少，樣品消耗少，簡單，快速，成本低。粗提上清液可以直接用來作為PCR反應(yīng)的模板，能夠有效的對煙草轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行鑒定。利用此方法進(jìn)行DNA模板制備，一個工作人員在1 h之內(nèi)就可以提取至少600個樣品，提高了工作效率。另外，此方法只利用大約10 mm2的植物材料就可以提取足夠200次PCR反應(yīng)的模板溶液，大大減少了對植物材料的浪費(fèi)。因此，篩選可以在植株生長的早期進(jìn)行，加速實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。

堿裂解法快速提取基因組DNA的方法在擬南芥、大麥、大豆、甘蔗、水稻、玉米等植物中已經(jīng)有文獻(xiàn)報道［7，10，12-17］。與這些已經(jīng)報道的方法相比，本方法最大的改進(jìn)是上清液不經(jīng)加熱或中和就可以直接用來作為模板，這樣盡最大的可能節(jié)省了時間降低了費(fèi)用并且還能有效的避免不同樣品之間的交叉污染。0.01 mol/L NaOH的pH值大約在12.93［9］，我們通過對市面上4家不同公司的PCR Mix產(chǎn)品進(jìn)行PCR擴(kuò)增的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)（圖2）表明，1 μL 0.01 mol/L NaOH提取液不會對20 μL的PCR反應(yīng)體系造成影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果依然穩(wěn)定、可靠。但是我們注意到高于0.25 mol/L（包含0.25 mol/L）NaOH溶液制備的模板直接用來進(jìn)行PCR擴(kuò)增時失?。▓D1），這可能是由于高濃度的NaOH溶液超出了PCR Mix中Tris-HCl緩沖液的緩沖能力，造成PCR結(jié)果失敗。

雖然傳統(tǒng)的SDS提取法和試劑盒提取的DNA量多質(zhì)優(yōu)，但是PCR技術(shù)對DNA質(zhì)量的要求并不高，只需要一點(diǎn)模板的存在就可以成功擴(kuò)增［7］。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了此方法提取的DNA在煙草及其他作物，如小麥、高粱、玉米中能夠穩(wěn)定的擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠、穩(wěn)定，在煙草和水稻中甚至能擴(kuò)增出長達(dá)1.5 kb的片段（圖3，圖5），并且在煙草中擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物可以直接用來進(jìn)行測序分析（圖4）。因此，此方法可以在這些作物中得到廣泛的應(yīng)用。但是用此方法制備的模板卻不能在棉花中成功擴(kuò)增。Xin等［16］在快速法（有堿提取液煮沸中和的步驟）提取擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中也得到了類似的結(jié)果，煙草和高粱組織制備模板后在PCR混合體系中加與不加雜質(zhì)抑制劑BSA和PVP都能擴(kuò)增出條帶，但是棉花組織卻必須加入BSA和PVP才能夠成功擴(kuò)增。Burr等［18］報道超過1 mm2的植物材料進(jìn)行粗提時，其中的葉綠素等雜質(zhì)會抑制PCR反應(yīng)，或許棉花葉片組織中的一些物質(zhì)能夠抑制Taq DNA聚合酶的活性，從而影響擴(kuò)增效果。綜上所述，本研究改進(jìn)的煙草基因組DNA堿提取方法不僅能夠?qū)D(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行檢測，對在其他作物上的應(yīng)用也具有借鑒意義。

4 結(jié)論

本研究改進(jìn)的NaOH法制備PCR擴(kuò)增模板不需要液氮、不需要昂貴的儀器、無需離心、無需更換離心管、沒有加熱煮沸中和等步驟，粗提物可直接用作PCR反應(yīng)的模板。進(jìn)行大量樣品DNA模板制備時能夠在最大程度上節(jié)省時間和實(shí)驗(yàn)花費(fèi)并減少樣品之間的交叉污染。此方法用來檢測轉(zhuǎn)基因煙草陽性株，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確，穩(wěn)定，重復(fù)性好。此外，此方法的所有步驟都在室溫操作并且10 mm2的葉子制備的DNA模板就足夠200余次PCR反應(yīng)使用，可減少對樣品的浪費(fèi)并在植株生長早期即可進(jìn)行檢測，加速實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。此改進(jìn)方法提取的煙草基因組DNA能夠用于對轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行陽性植株鑒定。

［1］尚志強(qiáng). 中國煙草育種進(jìn)展及發(fā)展對策［J］. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技, 2010（5）：1-3.

［2］李彥平, 丁燕芳, 煥孫, 等. 我國煙草育種現(xiàn)狀及思考［J］. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010（9）：148-156.

［3］李君, 張毅, 陳坤玲, 等. CRISPR/Cas 系統(tǒng)：RNA 靶向的基因組定向編輯新技術(shù)［J］. 遺傳, 2013, 35（11）：1265-1273.

［4］郭斌, 祁洋, 尉亞輝. 轉(zhuǎn)基因植物檢測技術(shù)的研究進(jìn)展［J］.中國生物工程雜志, 2010（2）：120-126.

［5］Edwards K, Johnstone C, Thompson C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis［J］. Nucleic Acids Research, 1991, 19（6）：1349.

［6］Murray MG, Thompson WF. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA［J］. Nucleic Acids Res, 1980, 8（19）：4321-4325.

［7］Wang H, Qi M, Cutler AJ. A simple method of preparing plant samples for PCR［J］. Nucleic Acids Research, 1993, 21（17）：4153.

［8］Paris M, Carter M. Cereal DNA：a rapid high-throughput extraction method for marker assisted selection［J］. Plant Molecular Biology Reporter, 2000, 18（4）：357-360.

［9］Shi SR, Datar R, Liu C, et al. DNA extraction from archival formalinfixed, paraffin-embedded tissues：heat-induced retrieval in alkaline solution［J］. Histochemistry and cell Biology, 2004, 122（3）：211-218.

［10］von Post R, von Post L, Dayteg C, et al. A high-throughput DNA extraction method for barley seed［J］. Euphytica, 2003, 130（2）：255-260.

［11］Collard B, Das A, Virk P, et al. Evaluation of ‘quick and dirty’DNA extraction methods for marker-assisted selection inrice（Oryza sativa L.）［J］. Plant Breeding, 2007, 126（1）：47-50.

［12］程文, 夏正俊, 馮獻(xiàn)忠, 等. 一種快速、無損大豆種子DNA提取方法的建立和應(yīng)用［J］. 植物學(xué)報, 2016（1）：68-73.

［13］崔學(xué)強(qiáng), 張樹珍, 馮翠蓮. 一種簡易的甘蔗葉組織PCR模板制備方法［J］. 生物技術(shù)通報, 2016（3）：58-62.

［14］ 桑賢春, 何光華, 張毅, 等. 水稻PCR擴(kuò)增模板的快速制備［J］.遺傳, 2003（6）：705-707.

［15］吳明生, 云曉敏, 宋歌, 等. 轉(zhuǎn)基因玉米種子快速篩查方法研究與應(yīng)用［J］. 生物技術(shù)通報, 2013（1）：102-106.

［16］Xin Z, Velten JP, Oliver MJ, et al. High-throughput DNA extraction method suitable for PCR［J］. Biotechniques, 2003, 34（4）：820-827.

［17］Karakousis A, Langridge P. A high-throughput plant DNA extraction method for marker analysis［J］. Plant Molecular Biology Reporter, 2003, 21（1）：95-95.

［18］Burr K, Harper R, Linacre A. One-step isolation of plant DNA suitable for PCR amplification［J］. Plant Molecular Biology Reporter, 2001, 19（4）：367-371.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Improvement of Alkaline Lysis Method for DNA Extraction from Tobacco

XU Zong-chang1，2WANG Meng1，2KONG Ying-zhen1
（1. Key Laboratory of Tobacco Genetic Improvement and Biotechnology，Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Science，Qingdao 266101；2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Science，Beijing 100081）

To expeditiously extract DNA templates from a large number of transgenic tobacco samples，the alkaline lysis method of extracting DNA from tobacco was improved in this study. Solution of 0.01 mol/L NaOH was used as the extraction buffer and the supernatant could be directly used as a template for PCR reaction，after crushing transgenic tobacco leaf tissues without heating/boiling and neutralizing procedures. The results showed that DNA template produced by NaOH solution of 0.01-0.1 mol/L was amplified successfully. The DNA template produced by the improved method did not rely on particular reaction condition，a variety of types of PCR Mix buffer all amplified successfully. Compared with the traditional SDS extraction method or commercial kits method，PCR results showed no significant differences. In addition，the improved method presented promising results while it was applied to other crops such as wheat，sorghum，rice and maize. The PCR products amplified from the DNA template by the improved method was able to be directly used for sequencing analysis. In conclusion，the improved method is in need of fewer instruments and less sample consumption，rapid，simple，low cost，no cross-contamination，and very efficient to handle a large number of samples，thus，it may rapidly extract and identify the DNA from a large number of transgenic tobacco samples.

tobacco；DNA extraction；alkaline lysis；PCR；transgenic detection

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.009

2016-09-18

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31470291，31670302），國家科技支撐計劃項(xiàng)目（2015BAD15B03-05），中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年英才計劃

徐宗昌，男，博士研究生，研究方向：作物遺傳育種；E-mail：xuzc1110@163.com

孔英珍，女，博士，研究員，研究方向：細(xì)胞壁多糖合成；E-mail：kongyingzhen@caas.cn