孫子晴，任玲，楊柯

針灸針具用含銅不銹鋼的抗菌行為研究

孫子晴，任玲，楊柯

中國科學(xué)院 金屬研究所，遼寧 沈陽110016

本文探討了304型含銅不銹鋼（304-Cu SS）的體外抗菌性能。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與普通304不銹鋼（304 SS）相比，304-Cu SS對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌均有良好的殺菌作用，并表現(xiàn)出明顯抑制細(xì)菌粘附和細(xì)菌生物膜形成的作用。植入動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，304-Cu SS植入新西蘭大白兔肌肉組織后，發(fā)揮了明顯的抗菌作用，材料表面細(xì)菌量，植入部位周圍組織病灶感染程度均明顯小于和輕于304 SS。因此，304-Cu SS作為針灸針具材料可以有效抑制細(xì)菌感染發(fā)生，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

含銅不銹鋼；抗菌；針灸針具；細(xì)菌生物膜；醫(yī)用金屬材料

引言

針灸是一種中國特有的治療疾病的手段，從古代沿用至今?；仡欋樉尼t(yī)學(xué)近百年的發(fā)展歷史，針灸工具從最原始的砭石、針砭逐漸演變成金針、銀針、馬嚼鐵針，現(xiàn)在臨床上以不銹鋼為制針材料者最常用[1-4]。針灸是一種侵入性治療手段，消毒措施不嚴(yán)格、治療環(huán)境不潔凈或患者自身免疫系統(tǒng)不完善等因素均會造成病菌傳播引發(fā)細(xì)菌感染的可能。除了醫(yī)院采用常規(guī)醫(yī)療器械消毒流程之外，如果能從針灸針具材料本身改進(jìn)來賦予其抗菌性能將會是降低上述感染發(fā)生的一個(gè)有效途徑。近年來發(fā)展的含銅抗菌不銹鋼為這實(shí)現(xiàn)這一新的途徑提供了可能，本文為此開展了含銅不銹鋼在體內(nèi)外的抗菌行為研究，以期為其作為針灸針具的應(yīng)用提供支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及動物

實(shí)驗(yàn)用菌種為革蘭氏陰性大腸桿菌ATCC25922（Escher ichia coli, E. coli）及革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌ATCC25923 （Staphylococcus aureus, S. aureus）由廣東省微生物菌種保藏中心提供。

1.2 體外實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抗菌性能實(shí)驗(yàn)

嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)抗菌實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行[5-9]，實(shí)驗(yàn)所用溶液為濃度為105cfu/mL的大腸桿菌及金黃色葡萄球菌懸液。將實(shí)驗(yàn)樣片與細(xì)菌菌液接觸24 h，適當(dāng)稀釋后進(jìn)行涂平板，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.2.2 細(xì)菌粘附實(shí)驗(yàn)

將與細(xì)菌共培養(yǎng)24 h后的實(shí)驗(yàn)材料經(jīng)無菌PBS清洗3次后，用2.5%戊二醛溶液于4℃條件下固定4 h，經(jīng)逐級脫水（40%～100%）干燥后，進(jìn)行掃描電鏡觀察。

1.2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察

動員各方面力量搞好村莊環(huán)境宣傳，把全體村民發(fā)動起來，讓他們都真正理解支持，是每個(gè)村民都能做到愛村、護(hù)村，并行動起來，投入到美麗村莊建設(shè)上來，形成合力勢頭和建設(shè)發(fā)展力。

將與細(xì)菌共培養(yǎng)24 h后的實(shí)驗(yàn)材料經(jīng)無菌PBS溶液清洗3次后滴加染色劑（syto9:PI=1:1），再用無菌生理鹽水清洗3次后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察[10-11]。

1.3 動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 手術(shù)操作

大白兔適應(yīng)飼養(yǎng)后，按照編號順序用10%水合氯醛（3～4 mL/kg)腹腔麻醉。將大白兔固定于手術(shù)臺上，正臥位，備皮，局部消毒。在兔背脊單側(cè)骨骼區(qū)距離脊柱2 cm處，手術(shù)刀切開長約2 cm的切口，顯露肌肉組織，再用止血鉗鈍性分離背部豎脊肌，形成袋狀。將表面附有細(xì)菌生物膜的實(shí)驗(yàn)片豎直插入肌肉中，每只兔子左側(cè)統(tǒng)一植入304-Cu SS樣片，右側(cè)統(tǒng)一植入304 SS樣片，并確保其不與脊柱骨組織接觸。術(shù)后分層縫合傷口，傷口外緣簡單消毒，不給予抗生素[12-13]。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)檢測

樣品植入白兔肌肉組織時(shí)間為7 d，術(shù)后每天進(jìn)行大體觀察，包括動物的飲食、活動、體重、肛溫及傷口愈合情況（紅腫、硬結(jié)分泌物、新生肉芽組織、組織張力等）。實(shí)驗(yàn)動物處死后，觀察植入材料與周圍組織的聯(lián)系，植入材料周圍組織是否有化膿、壞死等情況。取出材料后，觀察植入材料表面是否完整、有無腐蝕生銹、變色反應(yīng)等情況，并對樣品及植入部位周圍組織進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)及菌落計(jì)數(shù)[14-15]。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1 抗菌性能

實(shí)驗(yàn)材料與大腸桿菌及金黃色葡萄球菌進(jìn)行共培養(yǎng)的平板計(jì)數(shù)結(jié)果直觀地顯示出了304-Cu SS的抗菌性能，表明經(jīng)過24 h接觸培養(yǎng)后，304-Cu SS的抗菌能力均達(dá)到90%以上，見圖1a，直觀的菌落照片見圖1b。

圖1 304-Cu SS和304 SS分別與大腸桿菌和金黃色葡萄球菌液共培養(yǎng)后的抗菌結(jié)果

2.2 細(xì)菌粘附

實(shí)驗(yàn)材料與大腸桿菌及金黃色葡萄球菌液經(jīng)24 h表面接觸后，樣品表面的細(xì)菌粘附情況見圖2?？梢?04 SS表面粘附有大量的細(xì)菌，并且有形成生物膜的趨勢；而304-Cu SS表面上的細(xì)菌量非常少，沒有成膜的趨勢。因此，無論是大腸桿菌還是金黃色葡萄球菌，304-Cu SS均較304 SS均表現(xiàn)出良好的抑制細(xì)菌黏附及細(xì)菌生物膜形成的作用。

圖2 304 SS和304-Cu SS與大腸桿菌和金黃色葡萄球菌液接觸24 h后的掃描電鏡照片

2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察

激光共聚焦顯微鏡觀察能直觀表明材料與細(xì)菌經(jīng)接觸后，樣品表面的細(xì)菌存活情況，其中綠色代表活細(xì)菌，紅色代表死亡的細(xì)菌。304-Cu SS表面上兩種細(xì)菌的活細(xì)菌數(shù)量均明顯少于304 SS表面，說明304-Cu SS對以上兩種細(xì)菌的確具有強(qiáng)烈的殺菌能力，并能抑制細(xì)菌生物膜的形成（見圖3）。

圖3 304 SS和304-Cu SS與大腸桿菌和金黃色葡萄球菌液共培養(yǎng)后的激光共聚焦圖像

2.4 動物體內(nèi)的抗感染行為

將實(shí)驗(yàn)組與對照組的材料與105cfu/mL菌液濃度的金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)24 h，使其表面黏附細(xì)菌生物膜，模擬針灸針具被感染后扎入人體內(nèi)的感染模型。7天后取材發(fā)現(xiàn)，無論是材料表面細(xì)菌數(shù)量還是樣片周圍組織所含細(xì)菌量，植入的304-Cu SS 側(cè)均少于植入304 SS 側(cè)。大體觀察結(jié)果同樣可驗(yàn)證304-Cu SS具有明顯的抗菌效果（圖4），兔背部傷口見明顯差異，植入304-Cu SS的左側(cè)傷口無紅腫化膿現(xiàn)象，而植入304 SS右側(cè)傷口已明顯化膿感染無法愈合。圖5為切開后樣片植入部位組織解剖觀察，可見304 SS周圍組織出現(xiàn)化膿性感染，感染面積擴(kuò)散較大且形狀不規(guī)則，呈雞蛋糕狀潰爛，并有大量滲出液，感染深度達(dá)肌肉層；而304-Cu SS 周圍組織略有化膿性感染，感染面積明顯小于304 SS側(cè)，且感染深度較304 SS側(cè)淺，僅達(dá)筋膜層。

圖4 樣片植入7天后肉眼直觀觀察白兔背部表面愈合情況

圖5 樣片植入7天后的組織解剖照片

3 結(jié)論

針灸醫(yī)學(xué)療法作為我國傳統(tǒng)的醫(yī)學(xué)精髓不僅為我國也為世界做出巨大貢獻(xiàn)。在傳承祖國醫(yī)學(xué)療法的同時(shí)，還存在著一些不足，比如針灸器具消毒及使用方面的不完善。目前我國醫(yī)院內(nèi)和診所仍然將針灸針具反復(fù)消毒及使用[16]，不能專人專用，一旦針灸針具消毒不完善、暴露空氣中時(shí)間過長，或醫(yī)務(wù)工作者無菌操作觀念不強(qiáng)，都會造成院內(nèi)交叉感染，給患者帶來痛苦甚至增加新的健康隱患。

如果從材料本身出發(fā)，使其自身具備抑制細(xì)菌粘附和形成生物膜的能力，就會大大降低由于針灸針具消毒、使用不當(dāng)造成的細(xì)菌感染風(fēng)險(xiǎn)。304型含銅不銹鋼恰恰具備了這種特殊功能，其在保持普通304不銹鋼原有性能的基礎(chǔ)上，增添了抗菌性能，能夠有效抑制細(xì)菌粘附及生物膜形成，可以作為一種新型針灸針具材料應(yīng)用于醫(yī)療領(lǐng)域來降低患者遭受細(xì)菌侵襲的風(fēng)險(xiǎn)，從而有效減少患者感染的發(fā)生。

[1] 蘇敏,王瑩瑩,楊金生.論針灸科學(xué)發(fā)展的幾大飛躍[J].上海針灸雜志,2013,(1):69-72.

[2] 魏慧.針灸學(xué)科新世紀(jì)醫(yī)學(xué)模式與發(fā)展新思路[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2008,4(4):5-8.

[3] 陳國生.論提高針灸療效的幾個(gè)重要問題[J].中外健康文摘:臨床醫(yī)師,2008,(6):148-149.

[4] 王廣軍.針灸學(xué)的幾個(gè)基本科學(xué)問題討論[J].中國針灸,2016,(10): 1101-1103.

[5] Qin H,Cao H,Zhao Y,et al.In vitro and in vivo anti-biofilm effects of silver nanoparticles immobilized on titanium[J].Biomaterials, 2014,35:9114-9125.

[6] Unosson E,Morgenstern M,Engqvist H,et al.In vitro antibacterial properties and UV induced response from Staphylococcus epidermidis on Ag/Ti oxide thin films[J].J Mater Sci:Mater Med,2016,27(3):1-8.

[7] Qin H,Cao H,Zhao Y,et al.Antimicrobial and Osteogenic Properties of Silver-Ion-Implanted Stainless Steel[J].ACS Appl Mater Interfaces,2015,7(20):1.

[8] Ni HW,Zhang HS,Chen RS,et al.Antibacterial properties and corrosion resistance of AISI420 stainless steel simplanted by silverand copperions[J].Int J Min Met Mater,2012,19(4):322-327.

[9] Takaisikikuni NB,Schilcher H.Electron microscopic and microcalorimetric investigations of the possible mechanism of the antibacterial action of a defined propolis provenance[J].Planta Med,1994,60(3):222-227.

[10] 楊聯(lián)軍,榮子杰,張贊杰,等.載ADM-PLGA納米微球的ADMPLGA-NHAC制備及其對人骨肉瘤MG63細(xì)胞的抑制作用[J].中國臨床解剖學(xué)雜志,2014,32(5):585-589.

[11] 楊聯(lián)軍,朱立新,包和婧,等.載阿霉素PLGA納米微球的制備及其對人骨肉瘤MG63細(xì)胞的抑制作用[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2014, (4):528-531.

本文編輯 蘇欣

[12] 丁元圣,趙王月,張宏偉,等.新型含Cu抗菌鈦合金體內(nèi)抗菌性的初步研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2015,38(3):52-53.

[13] 于曉明,譚麗麗,萬鵬,等.醫(yī)用鎂及鎂合金研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)療設(shè)備,2015,30(9):1-5.

[14] Shirai T,Shimizu T,Ohtani K,et al.Antibacterial iodine-supported titanium implants[J].Acta Biomater,2011,7(4):1928-1933.

[15] 李軍雷,譚麗麗,楊柯.擠壓態(tài)Mg-Zn-Nd醫(yī)用鎂合金的組織與性能研究[J].中國醫(yī)療設(shè)備,2015,30(9):6-11.

[16] 王亞文,閆圣秀.試論針刺無菌操作[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2003,12(7):740-741.

Study on Antibacterial Performance of Copper-bearing Stainless Steel Used for Acupuncture Needles

SUN Zi-qing, REN Ling, YANG Ke
Institute of Metal Research, Chinese Academy of Sciences, Shenyang Liaoning 110016, China

This article studied the antibacterial performance of a novel antimicrobial Cu-bearing Stainless Steel (304-Cu SS) through both in vitro and in vivo tests, which is expected to be applied in the field of medical acupuncture needles. The in vitro results showed that 304-Cu SS had better antimicrobial ability compared with 304 SS as the former had good bacterial effect in both escherichia coli and staphylococcus aureus. Meanwhile, 304-Cu SS could obviously inhibit the bacterial adhesion and the formation of bacterial biofilm. The animal test further proved that 304-Cu SS showed a great antiinfectious effect after implanted in muscle tissue of the New Zealand white rabbit. 304 Cu SS showed less number of bacteria on its surface as well as much lower infectious degree of tissue lesions around the implanting position in comparison with 304 SS. Thus 304-Cu SS has much potential to be used as an acupuncture needle material to reduce risk of patients from bacterial attack, and effectively restrain the bacterial infection caused by acupuncture needles.

copper-bearing stainless steel; antibacterial; acupuncture needles; bacterial biofilm; medical metal materials

TG174.2；TG14

A

10.3969/j.issn.1674-1633.2017.01.002

1674-1633(2017)01-0007-03

2016-11-03

國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（51631009）；國際自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（51371168）。

楊柯，研究員，博士生導(dǎo)師，研究領(lǐng)域包括新型醫(yī)用金屬材料、先進(jìn)鋼鐵材料、儲氫合金等。

通訊作者郵箱：kyang@imr.ac.cn