薛一濤陳瑞雪高翔宇孫 德焦華琛

（1.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東 濟南 250000；2.山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250000）

·研究報告·

復心湯對大鼠原代心肌細胞IP3-Ca2+/CaMCaN通路的影響*

薛一濤1陳瑞雪2高翔宇2孫 德2焦華琛1

（1.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東 濟南 250000；2.山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250000）

目的 研究用復心湯含藥血清培養(yǎng)的大鼠原代心肌細胞中IP3-Ca2+/CaM-CaN通路的表達情況，并與纈沙坦干預后的心肌細胞模型進行比較，觀察復心湯對心肌細胞的干預效果，進一步探討復心湯抗心衰的作用靶點及機制，為臨床及科研提供一條新思路。方法 健康成年的雄性Wistar大鼠50只，隨機分為空白對照組、復心湯低劑量組、復心湯中劑量、復心湯高劑量組、西藥（纈沙坦）組，分別給予生理鹽水，低、中、高劑量復心湯及纈沙坦每天1次灌胃1周，末次灌胃后腹主動脈采血并分離血清，血清經(jīng)滅活、濾菌。含藥血清干預原代心肌細胞后分別采用Elisa、激光共聚焦成像技術(shù)、Western blot法檢測心肌中IP3、Ca2+、CaM及CaN的表達情況及或定量分析。結(jié)果 復心湯高劑量組及西藥組IP3表達量較空白組明顯降低，有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；復心湯中、高劑量及西藥組CaM、CaN表達量明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01或P＜0.05）；與西藥組相比，復心湯高劑量組IP3、CaM、CaN表達量差異無顯著統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；Ca2+熒光探針熒光強度由高到低依次是空白組，復心湯低、中、高劑量組，西藥組。表明高劑量復心湯治療心衰的效果與纈沙坦相當。結(jié)論 復心湯治療心衰可能與IP3-Ca2+/CaM-CaN通路有關(guān)。

復心湯 心衰 IP3 Ca2+CaM CaN

慢性充血性心力衰竭 （CHF）是各種心臟疾病導致心臟收縮和（或）舒張功能障礙，心排血量不足而引起的一組綜合征，是各種心臟病的嚴重階段，在人群中發(fā)病率較高［1］，心室重構(gòu)是其生理病理基礎(chǔ)［2］。本實驗依托于國家自然科學基金課題 “復心湯提取物干預心衰左室重構(gòu)的靶向治療研究”（項目編號：81273703），為該項目第2部分內(nèi)容，即復心湯含藥血清對原代乳鼠心肌細胞鈣離子及鈣調(diào)素依賴的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶通路的影響，通過測定心肌細胞中IP3-Ca2+/CaM-CaN通路的表達，并與纈沙坦干預后的心肌細胞模型進行比較，觀察復心湯對心肌細胞的干預效果，進一步探討復心湯抗心衰的作用靶點及機制，為臨床及科研提供一條新思路。

1 材料與方法

1.1 試藥與儀器 復心湯組成：制附子30 g，淫羊藿30 g，澤瀉20 g，葶藶子30 g，當歸15 g，黃柏15 g。由山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥劑科提供，配制批號：20150409，規(guī)格：250 mL/瓶。纈沙坦（規(guī)格80 mg×7片，北京諾華制藥股份有限公司，批號：H20040217）。α-Actin，山羊血清封閉液 （c-0005），IP3酶聯(lián)免疫試劑盒，F(xiàn)luo 4-AM，Pluronic F-127，CaM抗體，CaNA抗體，GAPDH抗體，山羊抗兔IgG，DAPI染液，RNA酶抑制劑，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，DMEM培養(yǎng)基，青鏈霉素混合液，D-Hank's液，胎牛血清，胰蛋白酶，Ⅱ型膠原蛋白酶等。

1.2 含藥血清的制備 1）含藥血清制備：將50只體質(zhì)量（200±20）g的雄性Wistar大鼠隨機分為空白組、復心湯低劑量組、復心湯中劑量組、復心湯高劑量組、西藥組，每組10只。實驗開始后取Wistar大鼠分別稱體質(zhì)量，參照《藥理實驗方法學》，人和大鼠間按體表面積折算的等效劑量比值（1∶0.018）計算，大鼠的藥物等效劑量為5.94 g/（kg·d）。分別給予低、中、高劑量復心湯及纈沙坦，每天1次灌胃1周，末次給藥2 h后水合氯醛麻醉大鼠，無菌條件下腹主動脈取血，取血后立即注入真空采血管，室溫靜置20 min后3000 r/min離心10 min，分離出的血清即為含藥血清。同組血清混合后，置于55℃水浴箱中滅活30 min，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，分裝，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?）空白血清制備：空白組灌服0.6 mL生理鹽水，每天1次灌胃1周，按照含藥血清制備方法，相同處理制備空白血清保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 原代心肌細胞的分離與純化 取出生1～3 d Wistar大鼠的乳鼠若干用于實驗，超凈臺下進行以下操作：乳鼠經(jīng)75%酒精消毒后使用眼科剪與眼科鑷開胸取出心臟，將心室部分剪下放入D-Hank′s液中沖洗3次左右。將心肌組織轉(zhuǎn)移至離心管中，將心室肌部分用眼科剪剪成1 mm3的組織塊，然后加入0.25%胰蛋白酶溶液及0.5%Ⅱ型膠原酶按1∶1比例混合3 mL加入已剪碎的心肌組織中，吸管吹打，置于CO2培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2，95%空氣）中消化5 min，棄去上層混懸液。再次加入消化酶3 mL消化5 min，收集上清液，并加入培養(yǎng)液終止消化。重復消化3次并收集上清液（若心肌組織未消化徹底，可增加消化次數(shù)，消化總時間應(yīng)盡可能小于30 min）。將細胞混懸液經(jīng)200目孔徑不銹鋼濾網(wǎng)過濾，離心機離心后，得到心肌細胞，接種于培養(yǎng)瓶中，然后置于CO2培養(yǎng)箱中，差速貼壁1 h。取差速貼壁后細胞懸液用臺盼藍染色計算細胞存活率為91%，倒置顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)后放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換培養(yǎng)液，每天觀察并記錄細胞狀態(tài)。

1.4 原代心肌細胞的純度鑒定 α-SA標記心肌肌動蛋白，心肌細胞α-SA抗原表達陽性，呈棕黃色，位于胞漿中，可見細胞核分裂象，表明心肌細胞增殖旺盛。而非心肌細胞呈陰性，計算心肌細胞純度為90%。見圖1。

圖1 心肌細胞形態(tài)學觀察

1.5 心肌細胞形態(tài)學觀察 倒置顯微鏡下觀察細胞：經(jīng)分離提取下來的心肌細胞呈圓形或橢圓形，2~4 h后細胞開始貼壁生長，培養(yǎng)24 h大部分心肌細胞已經(jīng)貼壁，少量心肌細胞出現(xiàn)微弱的搏動現(xiàn)象，其頻率和節(jié)律不同。培養(yǎng)48 h可見貼壁細胞伸出偽足，呈梭形、三角形或多角形，細胞成簇生長，折光性好，大部分細胞出現(xiàn)搏動現(xiàn)象，搏動頻率在每分鐘20~100次不等。72 h后多個相鄰細胞搏動出現(xiàn)同步化，以每分鐘40~60次多見。見圖1。第7~10天觀察有的細胞搏動頻率可達每分鐘120次，細胞緊密接觸，連成一片。同一個細胞團可能有多個搏動中心，成團心肌細胞的搏動較單個細胞搏動規(guī)則。待細胞培養(yǎng)至狀態(tài)良好時，用含有15%含藥血清的培養(yǎng)液進行換液，干預時間為24 h。

1.6 ELisa法檢測IP3的表達 根據(jù)Elisa試劑盒說明書，分別進行配液備用，加樣，加酶標抗體，加底物液顯色，終止反應(yīng)，最后進行檢測。

1.7 激光共聚焦技術(shù)檢測心肌細胞內(nèi)Ca2+的表達心肌細胞預先接種在六孔板中，每孔放有細胞爬片，細胞培養(yǎng)至第4天用含藥血清干預，24 h后進行如下操作：1）Fluo4-AM工作液的配制：用91.2 μL DMSO溶解100 μg Fluo4-AM粉末配制成1 mmol/L的母液，13 mL PBS液稀釋65 μL母液配制成5 μmol/L工作液。為加強Fluo4-AM進入細胞的效果，再加入13 μL 20% Pluronic F127至其終濃度為0.02%（工作液即配即用，4℃避光保存）；2）取出六孔板，將培養(yǎng)液棄去，然后用PBS液洗滌細胞3次；3）加入Fluo4-AM工作液覆蓋細胞，37℃避光孵育30 min；4）PBS洗滌細胞3次后加入PBS溶液覆蓋細胞，再次孵育20 min，以確保AM體在細胞內(nèi)完全去酯化作用。5）加入DAPI溶液以覆蓋細胞為準，37℃避光孵育10 min，PBS溶液洗滌1次。取出細胞爬片，封片并上機檢測。激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為488 nm和526 nm。

1.8 Western blot法檢測心肌細胞中CaM、CaN蛋白的表達 取出標本，加入RIPA蛋白裂解液后冰浴混勻，冰浴靜置30 min。離心：12000 g，30 min。蛋白離心結(jié)束后，計算蛋白濃度，轉(zhuǎn)膜（17 kD轉(zhuǎn)膜60 min，62 kD轉(zhuǎn)膜90 min）。先后加入一抗、二抗，分別孵育，并用PBST洗滌。分析各條帶灰度值以GAPDH為內(nèi)參照，計算目的蛋白與同步GAPDH灰度值比值作為相對表達量。

1.9 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS17.0軟件處理及分析。數(shù)值資料以（）表示，組間比較釆用t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 Elisa法檢測IP3的表達量 見表1。與空白組相比，復心湯低、中、高劑量組及西藥組IP3表達量明顯降低，有顯著統(tǒng)計學差異（P＜0.01）；與復心湯低劑量組相比，高劑量組及西藥組IP3表達量明顯降低，有顯著統(tǒng)計學差異（P＜0.01），而中劑量組無明顯差異（P＞0.05），無統(tǒng)計學意義；與復心湯中劑量組相比，高劑量組及西藥組IP3表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；與復心湯高劑量組相比，西藥組IP3表達量降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 各組IP3表達量及心肌細胞CaM、CaN灰度值比較（）

表1 各組IP3表達量及心肌細胞CaM、CaN灰度值比較（）

IP3 CaM/GAPDH 46.06±4.15 1.595±0.015 14.20±6.03 1.548±0.018 36.57±14.14 1.215±0.105西藥組組別 CaN/GAPDH復心湯低劑量組 1.019±0.007復心湯中劑量組 0.939±0.001復心湯高劑量組 0.778±0.257 7.47±1.17 1.110±0.002空白組 271.25±95.62 1.589±0.008 1.020±0.005 0.553±0.005

2.2 激光共聚焦成像技術(shù)檢測Ca2+的表達 如圖2所示，左側(cè)綠色熒光由鈣離子熒光指示劑所激發(fā)，中間藍色熒光為細胞核染劑所激發(fā)，右側(cè)為綠色熒光與藍色熒光疊加。圖3分別為空白組，復心湯低、中、高劑量組及西藥組負載熒光指示劑和細胞核染劑后檢測到的圖像，可見各組綠色熒光強度逐漸減弱。

圖2 空白組（400倍）

圖3 各負載熒光指示劑和細胞核染劑后Ca2+的表達（200倍）

2.3 Western blot法測乳鼠心肌細胞CaM、CaN蛋白表達情況 與空白組相比，復心湯低劑量組與復心湯中劑量組CaM表達量均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），復心湯高劑量組與西藥組CaM表達量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；與復心湯低劑量組相比，復心湯中劑量組CaM表達量減少，無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），復心湯高劑量組與西藥組CaM表達量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；與中劑量組相比，復心湯高劑量組與西藥組CaM表達量明顯減少，有統(tǒng)計學差異（P＜0.05或P＜0.01）；與高劑量組相比，西藥組CaM表達量減少，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1，圖4。與空白組相比，復心湯低劑量組CaN表達量減少，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），中、高劑量組及西藥組CaN表達量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與復心湯低劑量組相比，復心湯高劑量組CaN表達量減少，差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05），復心湯中劑量組與西藥組CaN表達量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與復心湯中劑量組相比，高劑量組CaN表達量減少，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），西藥組CaN表達量明顯減少，有顯著統(tǒng)計學差異 （P＜0.01）；與復心湯高劑量組相比，西藥組CaN表達量減少，無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

圖4 各組CaM、CaN蛋白電泳圖

3 討 論

復心湯方中附子為君藥，其性浮而不沉，其用走而不息，上溫心陽以通脈，中暖脾胃以健運，下補命門而救陽虛。陽氣不足，水運不化，膀胱氣化失常，附子溫腎陽以逐寒氣，化水濕；淫羊藿、葶藶子為臣，淫羊藿補腎陽，強筋骨，祛風濕，本證型心腎陽虛型，腎陽虛可損及腎陰，淫羊藿與附子配伍，可增強附子溫補腎陽之功效。葶藶子瀉肺降氣，祛痰平喘，利水消腫，配伍附子溫化痰飲，滌痰定喘。澤瀉、當歸、黃柏為佐使?？v觀全方，附子、淫羊藿溫陽補腎，心腎陽氣旺盛，心氣鼓動有力，則痰飲瘀血得以溫化，葶藶子、澤瀉利水消腫平喘，四藥合用，兩補兩瀉，以補助瀉，加之當歸補血活血，黃柏燥濕以健脾，使瘀血去，痰飲化，水濕利。

IP3受體是肌漿網(wǎng)上的一種通道蛋白，與IP3結(jié)合后其化學構(gòu)象改變，使Ca2+通道開放，Ca2+被釋放入胞漿中，進而開啟細胞內(nèi)鈣信號系統(tǒng)。研究表明［13］，心肌細胞發(fā)生肥大的一個重要原因是細胞內(nèi)Ca2+濃度升高。當Ca2+升高時（如收縮期），CaM與Ca2+結(jié)合，使得CaM的空間構(gòu)象發(fā)生改變而具有活性，從而激活某些酶類和調(diào)節(jié)通道的功能。CaN活性是目前發(fā)現(xiàn)的唯一受Ca2+/CaM調(diào)節(jié)的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶，在心臟中表達較高［14］，Ca2+與CnN結(jié)合使之具有磷酸酶活性，激活下游傳導系統(tǒng)，對心臟中心鈉素、腦鈉素、α-肌球蛋白重鏈等基因的特異性表達起調(diào)節(jié)作用［15］，導致心肌細胞肥大，基因表達及蛋白合成增多，最終發(fā)生病理性重構(gòu)。

本實驗采用含藥血清干預大鼠原代心肌細胞的方法，觀察心肌細胞IP3-Ca2+/CaM-CaN通路的表達。復心湯高劑量組及西藥組IP3表達量明顯降低，有顯著統(tǒng)計學意義 （P＜0.01）；復心湯中、高劑量及西藥組CaM、CaN表達量明顯降低，有統(tǒng)計學差異（P＜0.01或P＜0.05）；與西藥組相比，復心湯高劑量組IP3、CaM、CaN表達量無顯著統(tǒng)計學差異 （P＞0.05）；Ca2+熒光探針熒光強度由高到低依次是空白組，復心湯低、中、高劑量組，西藥組。表明高劑量的復心湯治療心衰的效果與纈沙坦相當。綜上，復心湯治療心衰與IP3-Ca2+/ CaM-CaN通路有關(guān)。

近些年西醫(yī)治療慢性心力衰竭的藥物沒有明顯進展，心衰的高住院率、高死亡率一直是困擾整個社會的難題。中醫(yī)藥對心衰的研究越來越多，而且取得了不錯的成績。本課題通過研究驗方復心湯對心衰通路的影響，研究復心湯的作用機制，為復心湯在臨床上的應(yīng)用提供更加有力的證據(jù)。為研制出進一步降低心衰住院率、死亡率的藥物堅定了基礎(chǔ)，從而為廣大心衰患者帶來福音，同時也對挖掘中醫(yī)藥寶庫，促進中醫(yī)藥的現(xiàn)代化研究貢獻一份力量。

［1］ 中華醫(yī)學會心血管病學分會，中華心血管病雜志編輯委員會.慢性心力衰竭診斷治療指南［J］.中華心血管雜志，2007，12（35）：1076-1095.

［2］ 戴閨柱.慢性心力衰竭治療的現(xiàn)代概念［J］.中華心血管病雜志，2000，2（1）：75-78.

［3］ Clapham DE，Sneyd J.Intracellular calcium waves［J］.Adv Second Messenger Phosphoprotein Res，1995，30：1-24.

［4］ Honda Z，Nakamura M，Miki I，et al.Cloning by functional expression of platelet activating factor receptor from guineapig lung［J］.Nature，1991，349（6307）：342-346.

［5］ 古雅麗，石四箴.細胞內(nèi)離子分析［J］.同濟大學學報：醫(yī)學版，2001，22（6）：54-56.

［6］ Hongo K，White E，Gannier F，et al.Effect of stretch on contraction and the transient ferret ventricular muscles during hypoxia and acidosis［J］.Am J Physiol，1995，269∶C690-697.

［7］ Bers DM，Guo T.Calcium signaling in cardiac ventricular myocytes［J］.Ann N Y Acad Sci，2005，1047：86-98.

［8］ Maier LS，Bers DM.Calcium，calmodulin，and calciumcalmodulin kinaseⅡ：heartbeat to heartbeat and beyond［J］. J Mol Cell.

［9］ Schulz RA，Yutzey KE.Calcineurin signaling and NFAT activation in cardiovascular and skeletal muscle development［J］. Dev Bio，2004（1）：1-16.

［10］Xiaomei S，Juyan Z，Bei C.Construction of rat calcineurin A-cDNArecombinantadenovirus vector and its identification［J］. J Huazhong University Sci Technol，2006，26（1）：9-12.

［11］Karatas A，Hegner B，deWindt LJ，et al.Deoxycorticosterone acetate-saltmice exhibit blood pressure-independent sexual dimorphism［J］.Hypertension，2008，51：1177-1183.

［12］Shiroshita-Takeshita A，Brundel BJ，Lavoie J，et al.Prenisone prevents atrial fibrillation promotion by atrial tachycardia remodeling in dogs［J］.Cardiovasc Res，2006，69（4）：865.

［13］Hongo K，White E，Gannier F，et al.Effect of stretch on contraction and the transient ferret ventricular muscles during hypoxia and acidosis［J］.Am J Physiol，1995，269∶690-697.

［14］Schulz RA，Yutzey KE.Calcineurin signaling and NFAT activation in cardiovascular and skeletal muscle development［J］. Dev Bio，2004（1）：1-16.

［15］Shiroshita-Takeshita A，Brundel BJ，Lavoie J，et al.Prenisone prevents atrial fibrillation promotion by atrial tachycardia remodeling in dogs［J］.Cardiovasc Res，2006，69（4）：865.

Effects of Fuxin Decotion on the Expression of IP3-Ca2+/CaM-CaN Pathway in the Generation of Rat Myocardial Cells

XUE Yitao，CHEN Ruixue，GAO Xiangyu，et al.
Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Shandong，Jinan 250000，China

Objective：To study Fuxin Decotion medcated serum on the expression of IP3-Ca2+/CaM-CaN pathway in the generation of rat myocardial cells，and to study the action mechanism of Fuxin Decotion on the effect of cardiac muscle in heart failure.Methods：50 healthy adult male Wistar rats were randomly divided into blank control group，F(xiàn)uxin Decotion low-dose group，F(xiàn)uxin Decotion middle-dose group，F(xiàn)uxin Decotion high-dose group，valsartan group.Each group was lavaged by saline，F(xiàn)uxin Decotion low，medium and high dose，and valsartan，every day last a week.At the end of the lavage，collect abdominal aortic blood and separate the serum.The serum was inactivated and filtered from bacteria.The original generation of myocardial cell was intervented by medicated serum in detection of myocardial IP3，Ca2+，CaM，and CaN expression and quantitative analysis respectively by Elisa，laser confocal imaging technology，Western blot method.Results：IP3 expression of Fuxin Decotion high-dose group and valsartan group was obviously lower and it had a significant statistical significance（P＜0.01）；CaM，CaN positive expression area of Fuxin Decotion middle-dose group，F(xiàn)uxin Decotion high-dose group and valsartan group was obviously lower and it had a statistical significance（P＜0.01 or P＜0.05）；Compared with the valsartan group，IP3，CaM and CaN positive expression area of Fuxin Decotion high-dose group have no statistically significant differences（P＞0.05）；The fluorescence intensity of Ca2+fluorescent probe from high to low in turn is the blank group，F(xiàn)uxin Decotion low-dose group，F(xiàn)uxin Decotion middle-dose group，F(xiàn)uxin Decotion high-dose group，valsartan group.It Shows that “Fuxin Decotion”high-dose group has the effect of valsartan treatment of heart failure.Conclusion：Fuxin Decotion in treating heart failure is related to IP3-Ca2+/CaM-CaN pathway.

Fuxin Decotion；Heart failure；IP3；Ca2+；CaM；CaN

R285.5

A

1004-745X（2017）01-0001-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.01.001

2016-02-19）

國家自然科學基金項目（81273703）