蔣華波, 夏梓元, 張瓊閣, 王超群, 鄭驕陽, 陸 斌*

1.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院, 生化藥學(xué)教研室, 上海 200433; 2.上海市長征醫(yī)院內(nèi)分泌科, 上海 200003

大腸埃希菌TG1電穿孔法轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化研究

蔣華波1, 夏梓元1, 張瓊閣2, 王超群2, 鄭驕陽2, 陸 斌1*

1.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院, 生化藥學(xué)教研室, 上海 200433; 2.上海市長征醫(yī)院內(nèi)分泌科, 上海 200003

為了確立穩(wěn)定的高效率電轉(zhuǎn)化方案，提高構(gòu)建文庫的庫容，分別對細(xì)菌培養(yǎng)溫度、生長狀態(tài)、電場強度、感受態(tài)細(xì)胞濃度和體積、外源基因的質(zhì)量、甘油/甘露醇緩沖液體積等條件進(jìn)行優(yōu)化，分析了各因素對轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果顯示：細(xì)菌培養(yǎng)溫度為16℃，細(xì)菌生長的OD600值為0.5，密度梯度離心洗滌法，感受態(tài)細(xì)胞濃度高于1×1011/mL，并設(shè)定電場強度14.25 kV/cm時進(jìn)行電穿孔，轉(zhuǎn)化效率最高，可達(dá)到9×109CFU/μg DNA。研究獲得的電轉(zhuǎn)化優(yōu)化條件為高庫容文庫的構(gòu)建提供了一個重要的途徑。

大腸埃希菌TG1;電穿孔轉(zhuǎn)化;轉(zhuǎn)化效率

基因文庫(genomie library)是將某一基因組片段化，并全部克隆后得到的重組子群體，構(gòu)建高度豐富的基因文庫大大增加了后續(xù)篩選的有效性及靶向性。該技術(shù)因具有易于體外篩選、獲得目的片段后方便進(jìn)行進(jìn)一步研究而廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域。在文庫構(gòu)建中，電穿孔技術(shù)由于具有極高的轉(zhuǎn)化效率而處于至關(guān)重要的地位。隨著電穿孔技術(shù)的不斷成熟，其在核酸疫苗的傳遞[1,2]、外源基因的轉(zhuǎn)染[3]、利用非熱效應(yīng)殺傷腫瘤細(xì)胞[4]、治療性蛋白和生長因子基因的導(dǎo)入、組織再生[5]以及基因敲除[6]等各個應(yīng)用領(lǐng)域中顯示著獨特的優(yōu)勢并有著廣泛的應(yīng)用。文庫篩選的成功與否在一定程度上取決于庫容的大小及多樣性，而電穿孔效率的高低和穩(wěn)定性是其重要的限制因素。

電轉(zhuǎn)化法的主要原理是通過瞬時電壓使細(xì)胞膜被極化，從而在細(xì)胞膜內(nèi)外產(chǎn)生局部電位差。當(dāng)超過閾值電位時，細(xì)胞膜可形成短暫開放的分子通道，使外源性物質(zhì)快速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。在一定范圍的脈沖持續(xù)時間和電場強度下，細(xì)胞的瞬時通透性是可逆的。獲得穩(wěn)定、高效的電轉(zhuǎn)化效率是構(gòu)建基因文庫的關(guān)鍵步驟，而電轉(zhuǎn)化效率又受到多種因素的影響，包括培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)溫度、電轉(zhuǎn)化條件等[7～9]。雖然有很多文獻(xiàn)報道能達(dá)到1010的轉(zhuǎn)化效率[10～12]，但在實際操作中較難實現(xiàn)。本研究對可能影響電轉(zhuǎn)化效率的多個因素進(jìn)行研究和優(yōu)化，結(jié)果表明通過感受態(tài)的制備和電轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化，電轉(zhuǎn)化效率最高達(dá)到9×109。本研究優(yōu)化的電轉(zhuǎn)化方案將為構(gòu)建高庫容的文庫提供重要保證。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.2 TG1感受態(tài)細(xì)胞的制備

取E.coli菌株TG1于無抗性的LB瓊脂平板上劃線，于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。次日挑取單個克隆于5 mL無抗性的LB液體培養(yǎng)基中，置37℃搖床中培養(yǎng)12～16 h至OD600值約為8時，取2 mL菌液加入200 mL的LB培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床中恒溫(10℃、16℃、25℃、37℃)搖菌16～24 h，搖床轉(zhuǎn)速為250 r/min。當(dāng)OD600值為0.3～0.8時，停止搖菌，冰浴20 min后用高速離心機2 000 g 4℃離心10 min后，棄去上清，用超純水吹勻后緩慢加入并分層于甘油/甘露醇緩沖液(1.5%甘露醇，20%甘油)中，用水平離心機1 000 g 4℃離心10 min后，重復(fù)一次上述洗滌步驟，棄上清液，收集感受態(tài)細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.3 電轉(zhuǎn)化

取感受態(tài)細(xì)胞，加入適量質(zhì)粒后置于冰上1 min，立即加入4℃預(yù)冷的0.2 cm電穿孔杯中，在預(yù)設(shè)條件下進(jìn)行電擊。電擊完成后立即加入1 mL 37℃預(yù)熱的SOC培養(yǎng)基，于37℃搖床中培養(yǎng)1 h，取適量菌液經(jīng)倍比稀釋后吸取100 μL鋪板于氨芐抗性的LB瓊脂平板中，37℃恒溫培養(yǎng)箱放置過夜，次日計算克隆數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)溫度對轉(zhuǎn)化效率的影響

電轉(zhuǎn)化效率很大程度上取決于細(xì)菌的生長狀態(tài)。盡管培養(yǎng)溫度對細(xì)菌的生存能力無明顯差異[13]，但是是影響細(xì)胞活力、細(xì)胞膜狀態(tài)的最重要因素之一。適宜的生長環(huán)境能保障細(xì)胞的最佳活力，因此首先對細(xì)胞適宜生長溫度的條件進(jìn)行摸索。如圖1、圖2所示，在37℃培養(yǎng)條件下，細(xì)菌很快(2～3 h)達(dá)到目標(biāo)OD值，轉(zhuǎn)化效率也較為穩(wěn)定，在25℃培養(yǎng)組，轉(zhuǎn)化效率最差。在16℃培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)時間較長(約17～24 h)，但轉(zhuǎn)化效率優(yōu)于其他實驗組(圖1)。在10℃培養(yǎng)條件下，生長時間過長(>36 h)，轉(zhuǎn)化效率遠(yuǎn)低于16℃培養(yǎng)組。

圖1 溫度對轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.1 Effect of temperature on electrotransformation efficiency.

圖2 不同溫度下細(xì)菌OD600值的變化對比Fig.2 Comparion of change on OD600 value under different temperture.

《組織學(xué)》是研究機體微細(xì)結(jié)構(gòu)及其相關(guān)功能的科學(xué)。得利于顯微鏡的出現(xiàn)，這門科學(xué)將解剖學(xué)中的宏觀（主要指系統(tǒng)和器官水平）結(jié)構(gòu)推向了微觀（主要指組織和細(xì)胞水平）。

2.2 生長狀態(tài)對轉(zhuǎn)化效率的影響

細(xì)菌的生長狀態(tài)會很大程度上影響到電轉(zhuǎn)化效率。采用16℃和37℃的培養(yǎng)條件下處于不同OD600值的細(xì)菌，進(jìn)行感受態(tài)細(xì)菌的制備并分析其在電轉(zhuǎn)化效率上的差異。結(jié)果如圖3所示，在16℃和37℃條件下，當(dāng)細(xì)胞生長狀態(tài)處于中期時轉(zhuǎn)化效率均較高。但是，在37℃條件下能維持較高轉(zhuǎn)化效率的OD600值范圍較窄，約0.4～0.5時最佳；在16℃條件下OD600值為0.4～0.7轉(zhuǎn)化效率均能達(dá)到較高水平。

圖3 生長狀態(tài)對轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.3 Effects of growth state on electrotransformation efficiency.

2.3 電場強度對轉(zhuǎn)化效率的影響

細(xì)菌對電場強度有一定的敏感性，當(dāng)電場強度達(dá)到一定閾值時，才能有效擊穿細(xì)胞，使核酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；而電場強度過高則會使大量細(xì)胞死亡。通過對大腸埃希菌TG1的電轉(zhuǎn)化最適場強的研究，發(fā)現(xiàn)在16℃生長環(huán)境中且在一定細(xì)胞濃度下，最適場強在14 k～14.5 kV/cm之間(圖4)。

2.4 感受態(tài)細(xì)胞濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響

感受態(tài)細(xì)胞濃度也是影響電轉(zhuǎn)化效率的因素之一。通過一定的條件下對感受態(tài)細(xì)胞的最適濃度進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞濃度與電轉(zhuǎn)化效率成正相關(guān)，1.2×1011～1.5×1011/mL濃度時可達(dá)較高的電轉(zhuǎn)化效率(圖5)。

2.5 感受態(tài)細(xì)胞體積對電轉(zhuǎn)化效率的影響

在文庫建立過程中電穿孔工作量巨大，如果每次均以小體積感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行電穿孔，達(dá)到一定的庫容需要增加電穿孔的次數(shù)。通過增加感受態(tài)細(xì)胞的體積，比較其電轉(zhuǎn)化效率的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在大體積(>200 μL)感受態(tài)細(xì)胞的電轉(zhuǎn)化效率略低于200 μL轉(zhuǎn)化組，提示建庫過程中可以通過增加感受態(tài)細(xì)胞的體積來減少電穿孔的次數(shù)(圖6)。

圖5 感受態(tài)細(xì)胞濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.5 Effects of competent cell concentration on electrotransformation efficiency.

2.6 外源基因的質(zhì)量對轉(zhuǎn)化效率的影響

在電穿孔實驗中，外源基因通過粘附作用聚集在細(xì)胞膜表面，在電擊條件下細(xì)胞膜孔道短暫的開放使外源基因快速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[14]。通過比較外源基因的不同數(shù)量對感受態(tài)細(xì)胞電轉(zhuǎn)化效率的影響，發(fā)現(xiàn)在相同感受態(tài)細(xì)胞體積下，不同數(shù)量的外源基因?qū)﹄娹D(zhuǎn)化效率無顯著差異(圖7)。

2.7 甘油甘露醇混合液對轉(zhuǎn)化效率的影響

在感受態(tài)細(xì)胞的制備過程中，洗滌細(xì)胞的目的是盡量去除離子成分，以免在電穿孔過程中擊穿感受態(tài)細(xì)胞導(dǎo)致死亡。利用甘油/甘露醇作為重懸感受態(tài)細(xì)胞的緩沖液，可能通過平衡細(xì)胞內(nèi)的高滲透壓，使細(xì)胞保持充盈狀態(tài)[15]。本研究比較了不同體積的甘油/甘露醇緩沖液對電轉(zhuǎn)化效率的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)加入20 mL甘油/甘露醇緩沖液后，電轉(zhuǎn)化效率為甘油組的9倍(圖8)，提示甘露醇在電穿孔感受態(tài)細(xì)胞的洗滌過程中通過發(fā)揮保護(hù)作用，顯著提高了電轉(zhuǎn)化效率。

圖6 感受態(tài)細(xì)胞體積對電轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.6 Effects of competent cell volume on electrotransformation efficiency.

圖7 外源基因質(zhì)量對轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.7 Effects of quality of exogenous gene on electrotransformation efficiency.

圖8 緩沖液對轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.8 Effects of buffer solution on electrotransformation efficiency.

根據(jù)目前研究報道發(fā)現(xiàn)，不同菌株電轉(zhuǎn)化條件不同，而同一菌株不同實驗室在相同操作流程得到的轉(zhuǎn)化效率也不統(tǒng)一，因此對上述影響因素進(jìn)行條件摸索之后得到最高轉(zhuǎn)化效率為9×109CFU/μg DNA，最佳條件為在16℃溫度下生長至OD600值為0.5時，通過密度梯度離心用20 mL甘油/甘露醇緩沖液進(jìn)行洗滌，感受態(tài)細(xì)胞濃度為1.5×1011/mL，并設(shè)定電場強度14.25 kV/cm。

3 討論

電穿孔方法作為一種高效的轉(zhuǎn)化方法，目前廣泛應(yīng)用于外源基因轉(zhuǎn)染等多個領(lǐng)域[3～6]。但在實際操作中，電穿孔的轉(zhuǎn)化效率受到操作人員、電轉(zhuǎn)化條件等多個因素的影響存在很大的差異，如細(xì)胞培養(yǎng)溫度、生長狀態(tài)、外源基因濃度、洗滌緩沖液成分、儀器、場強等，因此有必要對電轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化進(jìn)行探索。本研究發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌TG1在37℃條件生長時，對數(shù)生長期在OD600值為0.4～0.5之間有較高的電轉(zhuǎn)化效率，而在16℃低溫環(huán)境下，OD600值為0.4～0.7之間有較高的電轉(zhuǎn)化效率。本研究還發(fā)現(xiàn)外源基因的數(shù)量和感受態(tài)細(xì)胞的體積對轉(zhuǎn)化效率并無較大影響，而感受態(tài)細(xì)胞的濃度越高，電轉(zhuǎn)化效率越高，一般需要在1×1011/mL以上時才能保證較高的轉(zhuǎn)化效率。因此可以通過一定程度上增加外源基因的數(shù)量、感受態(tài)細(xì)胞的濃度和體積，獲得較高的電轉(zhuǎn)化效率，減少電轉(zhuǎn)化次數(shù)。在電轉(zhuǎn)化條件上，場強在14 k～14.5 kV/cm時轉(zhuǎn)化效率較高。最后，本研究通過調(diào)整洗滌緩沖液及其體積，發(fā)現(xiàn)大體積的甘油/甘露醇緩沖液對細(xì)胞進(jìn)行洗滌可大大提高電轉(zhuǎn)化效率。優(yōu)化后的電轉(zhuǎn)化條件可使電轉(zhuǎn)化效率穩(wěn)定在3×109CFU/μg DNA以上，最高可達(dá)9×109CFU/μg DNA，為后續(xù)構(gòu)建高容量文庫打下堅實的基礎(chǔ)。

另外在電穿孔方面還有很多報道可以提高電轉(zhuǎn)化效率。比如有研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中Mg2+的缺乏也能使轉(zhuǎn)化效率提高[16]，高滲透壓培養(yǎng)基能提高感受態(tài)細(xì)胞在電穿后的存活率，對電轉(zhuǎn)化效率也有較大影響。此外在細(xì)菌生長過程中加入海藻糖能增加細(xì)胞膜的結(jié)合能力以及增強膜流動性，在感受態(tài)細(xì)胞洗滌過程中緩沖液內(nèi)加入HEPES優(yōu)于EDTA[17]，電擊后立即于46℃熱擊6 min能提高轉(zhuǎn)化效率[18]。由于電穿孔后細(xì)胞會形成孔道，并且在30 min內(nèi)處于開放狀態(tài)，使細(xì)胞內(nèi)成分流出胞內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，因此在用于感受態(tài)細(xì)胞電擊后復(fù)蘇的SOC培養(yǎng)基中加入表面活化劑，可使細(xì)胞表面孔道關(guān)閉以避免細(xì)胞死亡，能大大增加轉(zhuǎn)化效率[19, 20]。同時電擊后的復(fù)蘇時間也會影響電轉(zhuǎn)化效率[21]。其他因素，如質(zhì)粒的大小、質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)、水和洗滌緩沖液的純凈度、離心條件等均能影響電轉(zhuǎn)化效率[22～24]?；诒狙芯恳褍?yōu)化的電轉(zhuǎn)化條件，再部分疊加上述已報道的實驗條件，可獲得更高的電轉(zhuǎn)化效率。

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Optimization of Electroporation Conditions forEscherichiacoliStrain TG1

JIANG Huabo1, XIA Ziyuan1, ZHANG Qiongge2, WANG Chaoqun2, ZHENG Jiaoyang2, LU Bin1*

1.DepartmentofBiochemicalPharmacy,SchoolofPharmacy,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China; 2.DepartmentofEndocrinology,ChangzhengHospital,Shanghai200003,China

To build up a stable protocol of electroporation transformation method with high efficiency and improve storage capacity of genomie library, we investigated the factors affecting the transformation efficiency, including culture temperature, growth state, voltage, the density and volume of competent cells, the amount of the exogenous gene and the volume of glycerol/mannitol buffer solution, which may contribute to construct highly diverse library. Results showed that when cells growing under 16℃ and harvested in mid-exponential phase (OD600of 0.5), using glycerol/mannitol density gradient centrifugation techniques and adjusting the cell density up to 1×1011/mL, the electroporation voltage of 14.25 kV/cm, the highest transformation efficiency could reach to 9×109CFU/μg DNA. The results showed that the optimal conditions for electroporation transformation would provide an important access for high-complexity library construction.

EscherichiacoliTG1; electroporation; transformation efficiency

2016-11-12; 接受日期：2016-11-23

國家自然科學(xué)基金項目(81472283；81270890)資助。

蔣華波，碩士研究生，研究方向為抗腫瘤抗體的制備和功能研究。E-mail：huabojiang@hotmail.com。*通信作者：陸斌，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向為腫瘤靶向抗體類藥物的發(fā)現(xiàn)及功能研究。E-mail：binlu@smmu.edu.cn

10.3969/j.issn.2095-2341.2017.01.12