葛重宇，龐 慧，李 楠，鄭 潔，何昌隆，楊 歡#，沈玉萍（1.無錫市第三人民醫(yī)院藥學部，江蘇無錫14000；.江蘇大學藥學院，江蘇鎮(zhèn)江 101；.鎮(zhèn)江市藥品檢驗所，江蘇鎮(zhèn)江 1050）

·藥品監(jiān)督·

18家企業(yè)阿膠中氨基酸的含量分析與比較研究Δ

葛重宇1＊，龐 慧2，李 楠3，鄭 潔2，何昌隆2，楊 歡2#，沈玉萍2（1.無錫市第三人民醫(yī)院藥學部，江蘇無錫214000；2.江蘇大學藥學院，江蘇鎮(zhèn)江 212013；3.鎮(zhèn)江市藥品檢驗所，江蘇鎮(zhèn)江 212050）

目的：為阿膠的質(zhì)量評價提供參考。方法：采用全自動氨基酸分析儀分別測定18家企業(yè)共18批次阿膠中17種氨基酸的含量，再對含量數(shù)據(jù)進行主成分分析和聚類分析，以了解各種氨基酸之間的聯(lián)系，并將相似的阿膠產(chǎn)品進行集合與分類。結果：除1批次阿膠外，其余17批次均含有17種目標氨基酸，包括蘇氨酸（Thr）、纈氨酸（Val）、甲硫氨酸（Met）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe）和賴氨酸（Lys）7種人體必需氨基酸，尤其以甘氨酸（Gly）和脯氨酸（Pro）的含量較高；氨基酸總含量介于66.1%～82.0%之間，相差較大。主成分分析提取得到4個主成分，累積貢獻率達到89.578%，并認為Pro、丙氨酸（Ala）、谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、Leu、Ile、Thr是市售阿膠的特征氨基酸。聚類分析得到表征3張市售阿膠樹系圖，歐式距離系數(shù)均在0～25之間變動。結論：市售阿膠中氨基酸總含量相差較大，且不同企業(yè)阿膠中各種氨基酸的含量也有一定差異。阿膠中蛋白質(zhì)成分主要為膠原蛋白，可以利用測定氨基酸含量來監(jiān)控阿膠質(zhì)量。

阿膠；氨基酸；主成分分析；聚類分析

膠類中藥應用歷史悠久，早在《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]中即載有阿膠、鹿角膠為上品。該類藥具有補血止血、滋陰潤燥等功效，尤以滋補強壯作用最為突出[2]。阿膠是馬科動物驢的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠[3]，由于其價格昂貴，市場上的偽品和混淆品較多，常用廉價的明膠、豬皮膠（新阿膠）、黃明膠、雜皮膠等仿冒正品阿膠[4]。

目前，國內(nèi)外對阿膠的研究較少，研究者通常采用理化方法對阿膠進行檢測，例如測定微量元素[5]和甘氨酸（Gly）等個別氨基酸[6-7]的含量，但尚不足以比較全面反映阿膠的內(nèi)在質(zhì)量以及作為阿膠的質(zhì)量評價手段。

本研究分析了18家企業(yè)各1批市售阿膠的氨基酸含量，并根據(jù)氨基酸含量差異進行統(tǒng)計學分析，包括主成分分析（PCA）和聚類分析（HCA）[8-9]，以期為阿膠的質(zhì)量評價提供參考。

1 材料

1.1 儀器

S-433D型氨基酸分析儀（德國Sykam公司）；AE240型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；RVC 2-18型真空離心濃縮儀（德國Christ公司）；NUII-40L型純水機（南京優(yōu)普環(huán)保設備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

氨基酸混合標準品[包括苯丙氨酸（Phe）、丙氨酸（Ala）、Gly、谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Cys）、甲硫氨酸（Met）、精氨酸（Arg）、酪氨酸（Tyr）、亮氨酸（Leu）、門冬氨酸（Asp）、脯氨酸（Pro）、絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）、纈氨酸（Val）、賴氨酸（Lys）、異亮氨酸（Ile）、組氨酸（His），中國食品藥品檢定研究院，批號：140624-200805]；甲醇、鹽酸、硼酸、氯化鋰、氫氧化鋰、辛酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、三水乙酸鈉、醋酸鉀、茚三酮、苯酚等試劑均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）；氮氣為高純氮氣；水為超純水。18批次市售阿膠商品置于陰暗處保存，詳細信息見表1。

表1 18家企業(yè)18批次市售阿膠商品信息Tab 1 Information of 18 batches of commercial Ejiao products from 18 manufacturers

2 方法

2.1 溶液的配制

緩沖液A（pH 2.90）、B（pH 4.20）、C（pH 8.00）與再生液、樣品稀釋液（pH 2.20）按表2方法配制，最后均用超純水定容至1.0 L。緩沖液A用0.45 μm有機膜過濾，緩沖液B、C和再生液、樣品稀釋液均用0.45 μm水系濾膜過濾，續(xù)濾液于4℃保存。

鈉鉀緩沖液的配制[pH為（5.51±0.03）]：精密稱取272.0 g三水醋酸鈉和196.0 g醋酸鉀，加入少量超純水溶解，之后緩慢加入200 mL乙酸，直至醋酸鈉完全溶解，冷卻至室溫，最后用超純水定容至1.0 L。溶液用0.45 μm水系濾膜過濾，續(xù)濾液于密封玻璃瓶中室溫保存。

2.2 氨基酸測定方法與分析條件

將各批次阿膠樣品粉碎后過60目篩，精密稱取30.0 mg粉末，放入安瓿瓶中，加入5 mL的6 mol/L鹽酸溶液，充入高純氮氣并迅速用噴燈封口，然后置于110℃恒溫干燥箱內(nèi)，水解24 h。取出，冷卻至室溫，打開封口，將水解液過濾至25 mL量瓶中，用超純水沖洗安瓿瓶，合并濾液，定容至刻度。精密吸取0.5 mL濾液于離心管內(nèi)，以真空離心濃縮儀去除溶劑，溫度60℃，重復蒸干1～2次。加入1.0 mL樣品稀釋液復溶，震蕩混勻，用0.22 μm水系微孔濾膜過濾后，供上機測定使用。氨基酸混合標準品溶液按照中國食品藥品檢定研究院出具的國家藥品標準物質(zhì)使用說明書的要求進行配制。設定氨基酸參數(shù)，以茚三酮柱后衍生-氨基酸分析儀法測定阿膠中17種氨基酸含量，選用440 nm波長檢測Pro，選用570 nm波長測定Gly等其余16種氨基酸。

表2 各緩沖液配制方法Tab 2 Buffer preparation method

2.3 數(shù)據(jù)分析

2.3.1 原始數(shù)據(jù)標準化 由于測得的各種氨基酸含量的差異很大，故選用Z得分方法[10]進行數(shù)據(jù)標準化處理，經(jīng)過標準化處理的變量權重相同、均值都為0、方差均為1，然后采用SPSS 16.0分析軟件對標準化數(shù)據(jù)進行PCA和HCA。

2.3.2 PCA PCA是根據(jù)變量變換的思想，用少數(shù)相互獨立的新的綜合變量來描述各變量之間的關系，從而達到簡化數(shù)據(jù)的目的。本研究以氨基酸含量為指標，對18批市售阿膠中17種氨基酸進行了PCA。以原始數(shù)據(jù)相關系數(shù)矩陣、方差貢獻率及累積方差貢獻率為依據(jù)，對主成分進行選擇[11]，可以更為簡便地觀察阿膠中各種氨基酸之間的聯(lián)系。

2.3.3 HCA HCA是統(tǒng)計學中研究“物以類聚”的一種有效方法，能將一批樣品數(shù)據(jù)按照其性質(zhì)上的親密程度將相似性個體自動集合，并進行分類。本研究主要對18批市售阿膠進行系統(tǒng)聚類分析，采用Ward法，聚類距離采用歐式距離方法，將相似的阿膠進行集合與分類。

3 結果

3.1 氨基酸含量

氨基酸混合標準品色譜圖如圖1所示。

由圖1可見，在檢測波長570 nm和440 nm下，分析時間60 min內(nèi)，各種氨基酸能夠較好地分離。此后，采用全自動氨基酸分析儀分別測定18個廠家18批次市售阿膠中17種氨基酸的含量，測定結果見表3，阿膠樣品的分析圖譜見圖2。

圖1 氨基酸混合標準品的色譜圖Fig 1 Chromatograms of amino acid standard mixture

由表3可見，在已測定的氨基酸中，Gly和Pro在阿膠中含量較高，Ala、Arg和Asp次之，而Cys的含量最低。樣品中Gly的含量，尤其是Pro的含量較高，進一步證明阿膠中蛋白質(zhì)類化學成分主要由膠原蛋白構成。除桃源阿膠外，其余17批次均含有17種目標氨基酸，包括Thr、Val、Met、Ile、Leu、Phe和Lys 7種人體必需氨基酸，氨基酸總含量介于66.1%～82.0%之間。阿膠是一種營養(yǎng)價值很高的補益類中藥，本研究發(fā)現(xiàn)不同企業(yè)所生產(chǎn)的阿膠中氨基酸種類和含量均較為豐富。

3.2 PCA結果

采用相關系數(shù)矩陣直觀檢驗，根據(jù)相關系數(shù)矩陣中相關系數(shù)的大小所反映出變量之間的線性相關程度來進行適用性檢驗。由分析軟件計算相關系數(shù)矩陣可知，氨基酸含量之間既存在正相關也存在負相關，并且多數(shù)氨基酸含量間的相關系數(shù)的絕對值大于0.3，表明氨基酸含量之間有較強的相關性[11]。

表3 18家企業(yè)18批次阿膠中17種氨基酸的含量測定結果Tab 3 Contents of 17 amino acids in 18 batches of commercial Ejiao products from 18 manufacturers

以氨基酸含量為分析指標，對18批市售阿膠中17種氨基酸進行了PCA，計算出主成分特征值、貢獻率和累積貢獻率；依據(jù)累積貢獻率大于85%的原則，選取了4個主成分，使得累積貢獻率達到89.578%。18個廠家18批次阿膠中17種氨基酸主成分的全部方差解釋結果見表4。

如表4所示，第一主成分特征值為10.885，貢獻率為64.030%，即反映了18批市售阿膠中17種氨基酸含量全部性狀的64.030%的信息；第二主成分特征值為2.076，反映了全部性狀的12.213%的信息；主成分三的特征值為1.393，解釋了總變異的8.192%；主成分四的特征值為0.874，解釋了總變異的5.144%。以上表明，前4個主成分可較為全面地反映阿膠中17種氨基酸的綜合性狀。

在成分矩陣中，給出了主成分載荷矩陣，每一列載荷值都顯示了各變量與有關主成分的相關系數(shù)。18個廠家18批次阿膠中17種氨基酸PCA中的成分矩陣結果見表5。

從表4和表5可以看出，總方差50%以上的貢獻率來自第一主成分，而第一主成分的主要指標變量是含量較高的Pro、Ala、Glu與含量相對較低的Asp、Leu、Ile、Thr。因為這些氨基酸與第一主成分高度正相關，所以認為Pro、Ala、Glu、Asp、Leu、Ile、Thr是市售阿膠的特征氨基酸。

3.3 HCA結果

對18家企業(yè)生產(chǎn)的阿膠產(chǎn)品進行聚類，得到聚類樹系，見圖3。

圖2 阿膠樣品的色譜圖（東阿阿膠，批號：110223）Fig 2 Chromatogram of Ejiao sample（Dong’e Ejiao，B/N：110223）

表4 18家企業(yè)18批次阿膠中17種氨基酸主成分的全部方差解釋結果Tab 4 Total variance explanation of 17 amino acids principal components in 18 batches of commercial Ejiao products from 18 manufacturers

以水平放置的樹形結構的聚類分析形圖呈現(xiàn)了聚類分析中每一次類合并的情況。取18批市售阿膠的平均圖譜，基于歐式距離對所得的數(shù)據(jù)進行分析，得到表征3張市售阿膠樹系圖，歐式距離系數(shù)均在0～25之間變動。結果如圖3所示，供試品可大致劃分為3個表征群。由此可見，雖然這些阿膠的產(chǎn)地均為山東，但是不同廠家的產(chǎn)品質(zhì)量仍然存在一定差異。

4 討論

4.1 膠原蛋白

阿膠是富含蛋白質(zhì)的補益類中藥，可以利用氨基酸含量測定監(jiān)控阿膠質(zhì)量。本研究測定了阿膠中17種氨基酸，發(fā)現(xiàn)其氨基酸種類和含量較為豐富，尤其是Gly和Pro的含量較高，表明阿膠中蛋白質(zhì)類化學成分主要由膠原蛋白構成。

表5 18家企業(yè)18批次阿膠中17種氨基酸PCA中的成分矩陣結果Tab 5 Component matrix of principal component analysis of 17 amino acids in 18 batches of commercial Ejiao products from 18 manufacturers

圖3 18家企業(yè)阿膠產(chǎn)品的聚類樹系圖Fig 3 Clustering tree of commercial Ejiao products from 18 manufacturers

4.2 特征氨基酸

PCA表明，Pro、Ala、Glu、Asp、Leu、Ile、Thr是市售阿膠的特征氨基酸。此外，市售阿膠中總氨基酸含量相差較大，可能是由于各廠家的制備工藝存在一定的差異所致，參考2015年版《中國藥典》（一部）[3]中阿膠的制法，其中驢皮原料、料液比、煎煮時間、濃縮方法（減壓濃縮、常壓濃縮）[12]、輔料的比例未統(tǒng)一規(guī)定是造成這一差異的主要因素。

4.3 研究不足之處

本研究只選取了18家企業(yè)的市售阿膠進行氨基酸的含量測定，而同一企業(yè)的不同批次產(chǎn)品可能存在一定差異，因此在下一步研究中，將擴大樣本測定范圍，以加強研究的系統(tǒng)性和深入性，使研究結果更具有實用價值。此外，本研究以臨床常用膠類中藥之一阿膠為分析對象，而龜甲膠、鹿角膠、鱉甲膠、黃明膠、新阿膠等膠類中藥的氨基酸組成是否與阿膠有所區(qū)別也尚待研究。

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Content Analysis and Comparative Study of Amino Acids in Ejiao from 18 Manufacturers

GE Chongyu1，PANG Hui2，LI Nan3，ZHENG Jie2，HE Changlong2，YANG Huan2，SHEN Yuping2（1.Dept.of Pharmacy，Wuxi Third People’s Hospital，Jiangsu Wuxi 214000，China；2.School of Pharmacy，Jiangsu University，Jiangsu Zhenjiang 212013，China；3.Zhenjiang Institute for Drug Control，Jiangsu Zhenjiang 212050，China）

OBJECTIVE：To provide reference for quality evaluation of Ejiao.METHODS：The contents of 17 amino acids in 18 batches of Ejiao from 18 manufacturers were analyzed by automatic amino acid analyzer；the content data was processed by principal component analysis（PCA）and hierarchical clustering analysis（HCA），in order to understand the relationship among these amino acids and categorize the Ejiao products.RESULTS：Except for a batch of Ejiao，the other 17 batches contained 17 various amino acids，including 7 necessary amino acids（Thr，Val，Met，Ile，Leu，Phe and Lys）for human being，especially the contents of Gly and Pro were higher.The total content of amino acids was arranged from 66.1%to 82.0%，showing great difference.Four main components were extracted by PCA，the cumulative contribution of which was 89.578%，and accordingly it may be considered that Pro，Ala，Glu，Asp，Leu，Ile and Thr were characteristic amino acids of Ejiao products.In hierarchical clustering analysis，3 tree figures of commercial Ejiao product were achieved and Euclidean distance was varied among 0-25.CONCLUSIONS：There is great difference in total control of amino acid in commercial Ejiao product；Ejiao products from various manufacturers differ in their amino acid contents.Ejiao is rich in collagen，and therefore，using amino acid determination would be helpful to monitor its quality.

Ejiao；Amino acids；Principal component analysis；Hierarchical clustering analysis

R282

A

1001-0408（2017）01-0122-05

2016-04-26

2016-08-16）

（編輯：余慶華）

國家自然科學基金資助項目（No.81303174）；江蘇省科技項目（No.BK20150463）；中國博士后科學基金面上資助項目（No.2016M590425）；江蘇大學大學生科研立項項目（No.14A457）

＊主管藥師。研究方向：中藥分析。E-mail：56057702@qq.com

#通信作者：副教授。研究方向：中藥分析。E-mail：yanghuan-1980@ujs.edu.cn

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.01.32