安改麗,李 旭,黃尚科,馮 璐,白 俊,趙新漢△

1.陜西省人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科(西安710068), 2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科(西安 710061)，3.陜西省腫瘤醫(yī)院內(nèi)一科(西安 710061)

△通訊作者

阿帕替尼聯(lián)合順鉑對食管癌ECA109細胞抑制作用及機制探討

安改麗1,2,李 旭3,黃尚科2,馮 璐2,白 俊1,趙新漢2△

1.陜西省人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科(西安710068), 2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科(西安 710061)，3.陜西省腫瘤醫(yī)院內(nèi)一科(西安 710061)

目的：探討阿帕替尼(Apatinib)聯(lián)合順鉑對食管癌細胞ECA109的抑制作用及其可能的分子機制。方法：對人食管癌細胞株ECA109,單獨或聯(lián)合給藥后采用MTT法測定細胞增殖,流式細胞儀測定細胞凋亡,Western blot觀察VEGF、AKT的表達情況。結(jié)果：Apatinib及順鉑單藥對食管癌細胞株ECA109細胞均有增殖抑制作用，且結(jié)果呈時間劑量依賴關(guān)系；與對照組相比,Apatinib聯(lián)合順鉑作用后有協(xié)同誘導(dǎo)凋亡作用,兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Western blot檢測顯示對照組與Apatinib單藥組,聯(lián)合用藥組與單藥組比較,AKT及VEGF表達均顯著下調(diào)(P<0.05),而順鉑單藥組與對照組相比較,AKT及VEGF表達下調(diào)不顯著。結(jié)論：Apatinib和順鉑聯(lián)合應(yīng)用能夠在體外協(xié)同抑制食管癌ECA109細胞增殖,促進其凋亡,其作用機制可能與下調(diào)AKT、VEGF有關(guān)。

食管癌是我國常見的惡性腫瘤，隨著手術(shù)、化療及放療技術(shù)的發(fā)展,食管癌的臨床治療有了很大的進展,但是其5年生存率仍低于20%[1]。在我國90%以上食管癌為鱗狀細胞癌,腺癌占5%左右,小細胞未分化癌少見。隨著近幾年分子腫瘤學(xué)的進展,分子靶向治療在多種腫瘤中顯示出較好療效,在食管癌治療中的應(yīng)用探索也越來越多。阿帕替尼(Apatinib)是一種新型的小分子酪氨酸激酶抑制劑,通過選擇性抑制血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR-2)的磷酸化來達到抗血管新生的目的[2]。在臨床前研究中,Apatinib在胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、肉瘤及非小細胞肺癌等多種移植瘤小鼠模型中均有明顯的抑瘤作用,且與奧沙利鉑、氟尿嘧啶、阿霉素及多西他賽聯(lián)合應(yīng)用在上述移植瘤鼠模型上有協(xié)同作用[3],根據(jù)其在晚期胃癌中的3期臨床研究結(jié)果,該藥已獲批用于晚期胃癌的治療。既往有文獻報道食管鱗癌細胞高表達VEGFR1-3[4],但目前將Apatinib用于食管癌治療研究的文獻很少。本研究擬將新型抗腫瘤血管生成藥物Apatinib與經(jīng)典化療藥物順鉑聯(lián)合應(yīng)用,觀察其對食管癌細胞株ECA109的抑制作用,并通過檢測血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、蛋白激酶B(AKT)水平推測其可能的作用機制,為靶向治療與化療聯(lián)合的生物化療模式提供體外實驗的理論依據(jù)。

材料及方法

1 材 料 人食管癌細胞株ECA109(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院環(huán)境與疾病相關(guān)基因教育部重點實驗室惠贈)；阿帕替尼(Apatinib)(江蘇恒瑞公司)；順鉑(山東齊魯制藥廠)，1640培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)；胎牛血清(以色列Biological Industries公司)；噻唑蘭(MTT)(美國Sigma公司)；Annexin V-APC/7-AAD雙染凋亡試劑盒(深圳晶美生物公司)；二甲基亞砜(DMSO)(美國Sigma公司)；細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；FACScan 流式細胞儀(美國BD公司)；anti-VEGF(Cell Signaling Technology)，anti-AKT(Cell Signaling Technology),鼠抗人β-actin單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；二抗羊抗鼠單克隆抗體 (美國Jackson公司),Genios 多功能酶標儀(美國TECAN公司)；Western blot電泳和轉(zhuǎn)膜裝置(美國BIO-RAD 公司)；Odyssey 雙色紅外熒光成像系統(tǒng)掃描儀(美國LI-COR公司產(chǎn)品)；倒置顯微鏡( DXM1200)(日本Nikon公司)。

2 方 法 ①細胞培養(yǎng)：對食管癌細胞ECA109采用含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng),在37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),待其貼壁生長至70%～80%時,用0.25%胰蛋白酶消化傳代。隨后取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)的實驗。②藥物稀釋方法：將Apatinib藥物用100% DMSO 溶解配置成母液,保存于-20 ℃條件下。實驗用時用1640培養(yǎng)基稀釋至目標濃度,使DMSO終濃度< 0.5 %,不影響細胞生長。③實驗分組：實驗分為空白對照組、Apatinib單藥組、順鉑單藥組、Apatinib+順鉑組。檢測細胞增殖抑制率時Apatinib單藥組濃度分別是2.5、5、10、20、40 μmol/L,順鉑單藥濃度分別是5、10、20、40、80 μg/ml。聯(lián)合處理組：以相應(yīng)的Apatinib濃度和順鉑濃度聯(lián)合應(yīng)用；流式細胞儀檢測細胞凋亡以及Western blot相關(guān)實驗時單藥Apatinib濃度為5 μmol/L，單藥順鉑濃度為4 μg/ml，聯(lián)合處理組為上述兩藥濃度對細胞進行聯(lián)合處理,空白對照組僅用1640培養(yǎng)基進行細胞處理。

3 檢測項目及方法 ①MTT法檢測細胞活性,并計算細胞抑制率：取對數(shù)生長期的人食管癌細胞株ECA109(5000個細胞/孔)接種于96孔板上,每孔加入100 μl細胞懸液,培養(yǎng)24 h后，傾去培養(yǎng)基，加入不同濃度的Apatinib和(或)順鉑，每組設(shè)6個復(fù)孔,每孔加100 μl。將與實驗組中含有最大濃度DMSO的培養(yǎng)液作為空白對照組,不含細胞的無血清培養(yǎng)基為調(diào)零孔,培養(yǎng)48 h后每孔加入MTT溶液(濃度為5 mg/ml)10 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng),小心吸去藥液及培養(yǎng)液,每孔中加入DMSO 150 μl,振蕩10 min以充分溶解結(jié)晶物。用酶標儀在490 nm處測定每孔的OD值。細胞抑制率(%)=(1-試驗孔平均OD值/對照孔平均OD值)×100%,根據(jù)上述結(jié)果繪制細胞生長抑制率曲線。所有實驗均重復(fù)3次。②流式細胞儀檢測細胞凋亡：取對數(shù)生長期的ECA109細胞,調(diào)整細胞濃度為2×105/ml，以2 ml/孔接種至6孔板內(nèi)，含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基孵育24 h后,實驗組分別加入相應(yīng)濃度的Apatinib、順鉑單藥及兩藥聯(lián)合,對照組不加任何藥物作為參考,每組設(shè)3個復(fù)孔,然后置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后,用不含EDTA的胰酶消化各處理組細胞并對細胞進行收集,用4 ℃預(yù)冷的PBS對細胞進行2次洗滌，離心后棄去上清,加入500 μl的Binding Buffer使懸浮細胞，后分別加入5 μl Annexin V-APC和5 μl的7-AAD染液,混勻室溫避光放置15 min后上流式細胞儀檢測,所有試驗均重復(fù)3次。③Western blot檢測細胞蛋白的表達：首先是細胞總蛋白的提取，取對數(shù)生長期的細胞,待細胞密度達到60%～70%,分別加入Apatinib、順鉑,以及Apatinib+順鉑處理48 h后,棄去細胞培養(yǎng)基,冰PBS洗2次,盡可能棄去PBS,加入配置好的適量RIPA蛋白裂解液于培養(yǎng)板中,冰上撫育60 min,刮取細胞并轉(zhuǎn)移至離心管中,4 ℃,10 000 r/min離心10 min,將上清(含有蛋白樣品)移入新的試管中,分裝蛋白樣品并于-80 ℃保存。在5%～10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上,每孔加入蛋白樣品10 μl進行電泳。同時裁取所需大小PVDF膜放于甲醇溶液中浸泡5 min后浸于轉(zhuǎn)移液中以備用，按照4層濾紙、PVDF膜、凝膠、4層濾紙的順序?qū)⑵浞胖迷谵D(zhuǎn)膜架上進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫封閉2 h，隨后用按照一定比例稀釋好的特異性一抗封閉PVDF膜，放于4 ℃過夜，第2天取出PVDF膜后用TBST溶液洗膜3次,10 min/次,洗膜完畢后用二抗(1∶5000)室溫封閉2 h，再用TBST洗膜3次,10 min/次,洗膜結(jié)束后,用干凈濾紙吸去PVDF膜上的TBST溶液,然后將膜放進準備好的干凈培養(yǎng)皿中,在膜表面均勻滴加ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色,然后將培養(yǎng)皿放入凝膠成像系統(tǒng)中成像,最后保存結(jié)果。上述實驗操作過程均需重復(fù)3次。

結(jié) 果

1 MTT結(jié)果 見圖1。MTT法檢測不同濃度Apatinib、順鉑及Apatinib聯(lián)合順鉑對ECA109細胞增殖的抑制作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度的Apatinib及順鉑作用于ECA109細胞后對細胞生長均有不同程度的抑制作用,聯(lián)合用藥后抑制作用增強,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。無論單藥或者聯(lián)合用藥,抑制率均呈現(xiàn)劑量依賴性。

圖1 Apatinib、順鉑單藥及聯(lián)合處理組作用48 h后對ECA109細胞株的生長抑制作用

2 流式細胞儀測定細胞凋亡 見圖2，表1。ECA109細胞分別經(jīng)對照組,Apatinib單藥組,順鉑單藥組,Apatinib+順鉑聯(lián)合組處理48 h后,采用Annexin V-APC/7-AAD法經(jīng)流式細胞儀測定細胞凋亡。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：對照組、Apatinib單藥組、順鉑單藥組及兩藥聯(lián)合組細胞凋亡率分別為：7.93%、11.06%、24.07 %、38.72%；將單藥處理組、聯(lián)合處理組分別與對照組之間進行兩兩比較，其細胞凋亡率均有升高，并且分析結(jié)果提示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 不同處理組VEGF、AKT的表達情況 見表2。不同藥物組對ECA109細胞株作用48 h后其VEGF、AKT均有表達，其中兩藥聯(lián)合組及Apatinib單藥組與空白對照組相比,其VEGF、AKT蛋白表達下降(P<0.05),聯(lián)合組較單藥組表達下降(P<0.05),順鉑單藥組與空白對照組比較,VEGF、AKT表達下降不明顯(P>0.05)。

表1 Apatinib、順鉑單藥及聯(lián)合對ECA109細胞凋亡率的影響

A.對照組；B.Apatinib組；C.順鉑組；D.Apatinib+順鉑組

圖2 Apatinib、順鉑單藥及聯(lián)合對ECA109細胞凋亡作用比較

注：與空白對照組比較,*P<0.05；與Apatinib、順鉑組比較, △P<0.05

討 論

根據(jù)藥物作用于腫瘤細胞通路的不同，現(xiàn)在常用的靶向治療藥物分為以下幾種：EGFR抑制劑、VEGF抑制劑、HER2抑制劑、c-MET抑制劑、COX-2抑制劑、PI3K/AKT/mTOR抑制劑和其他通路藥物。從臨床研究的數(shù)據(jù)來看，上述藥物多數(shù)應(yīng)用于食管癌后療效并不顯著，且這些數(shù)據(jù)大多來源于西方人群的食管腺癌或食管胃結(jié)合部癌，缺少來自以鱗癌為主要病理特征的中國人群的數(shù)據(jù)支持。腫瘤抗血管生成靶向治療已成為目前抗腫瘤靶向治療的研究熱點，VEGF-VEGFR介導(dǎo)的血管生成在食管癌發(fā)展中起到了重要的作用。越來越多的數(shù)據(jù)提示食管癌中VEGF-VEGFR表達與預(yù)后的相關(guān)性[5-6]，在一項研究中發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌細胞胞漿中VEGFR1的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，和預(yù)后無關(guān)；胞漿VEGFR2表達與臨床病理特征及預(yù)后不相關(guān)，而與腫瘤血管密度及淋巴結(jié)播散有關(guān)，這揭示了VEGFR及其配體作用后與腫瘤進展的相關(guān)性[7]。

Apatinib是一種新型的小分子酪氨酸激酶抑制劑，通過選擇性地抑制血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR-2)磷酸化而產(chǎn)生抑制腫瘤血管新生的作用[7]。因其在晚期胃癌臨床試驗中的良好效果，2014年已被國家食品藥品監(jiān)督管理局批準為晚期胃癌及胃食管結(jié)合部腺癌的適應(yīng)證，而且在肝癌、非小細胞肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌中的臨床試驗正在進展中。本研究將新型抗血管生成藥物Apatinib與傳統(tǒng)化療藥物順鉑聯(lián)合應(yīng)用，經(jīng)體外實驗證實兩藥聯(lián)合可以增強對食管癌ECA109細胞株的生長抑制作用，且呈現(xiàn)濃度依賴性，并且兩藥聯(lián)合后細胞凋亡率升高，較單藥組及對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。這與該藥在其他實體瘤動物模型中結(jié)果一致。同時我們采用Western blot法檢測了不同藥物處理后ECA109細胞中VEGF蛋白的表達情況，提示Apatinib單藥、順鉑單藥及兩藥聯(lián)合組與空白對照組比較，其VEGF蛋白表達均有降低，兩藥聯(lián)合及Apatinib單藥組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。本研究聯(lián)合用藥取得了更好的抑制腫瘤生長并促進腫瘤細胞凋亡作用，研究結(jié)果支持了生物化療模式這一腫瘤治療新模式的適用性，聯(lián)合治療所需藥物劑量較單藥組明顯降低，因而可能減少藥物的毒副作用，提高耐受性。同時提示Apatinib可能通過下調(diào)VEGF的表達發(fā)揮抗癌作用。

順鉑是細胞周期非特異性化療藥物，其最主要的作用機制是誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/AKT是抵抗細胞凋亡的重要因子，細胞過度表達PI3K/AKT可以抑制腫瘤細胞凋亡。文獻報道，PI3K/AKT的表達與癌細胞對順鉑的耐藥有關(guān)[8]，用LY294002抑制PI3K活性后，可明顯增加順鉑對耐順鉑人鱗狀細胞癌UM-SCC-23細胞的促凋亡作用。研究提示在肺腺癌細胞A549中檢測到AKT1過表達，這明顯減弱了A549細胞對順鉑的化療敏感性。順鉑可以通過耦合到細胞DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，引起DNA損傷，從而激活PI3K/AKT通路，引起細胞凋亡的抑制，由此降低化療效果[9]。文獻報道食管鱗癌細胞高表達PI3K/AKT,且其高蛋白水平與細胞分化程度低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理因素相關(guān)。本研究通過Western blot法檢測食管癌細胞株ECA109經(jīng)不同藥物處理后AKT蛋白表達情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與空白對照組相比,順鉑單藥組、Apatinib單藥組及兩藥聯(lián)合處理組中AKT表達均有降低，Apatinib單藥組、聯(lián)合處理組與空白對照組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,提示Apatinib與順鉑聯(lián)合用藥后增強細胞凋亡率的結(jié)果與其可以逆轉(zhuǎn)AKT介導(dǎo)的順鉑耐藥可能有關(guān)。

綜上所述,本研究結(jié)果表明, Apatinib作為一種安全有效的抗腫瘤血管生成藥物，對食管癌細胞株ECA109顯示出良好的細胞生長抑制、促凋亡作用,且與順鉑聯(lián)用有協(xié)同抑制作用,其發(fā)揮作用機制可能與下調(diào)VEGF、AKT表達有關(guān),這為Apatinib應(yīng)用于食管癌的臨床研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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(收稿：2016-06-13)

食管腫瘤 分子靶向治療 順鉑 細胞凋亡 蛋白激酶類 血管內(nèi)皮生長因子 @阿帕替尼

R735.1

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.02.004