樊秦,李彥忠

(1.草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

苜蓿莖點(diǎn)霉對(duì)紫花苜蓿光合生理的影響

樊秦1,2,李彥忠1,3*

(1.草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

苜蓿莖點(diǎn)霉侵染紫花苜蓿后嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和質(zhì)量。本研究采用植物生長(zhǎng)室盆栽法，利用光合作用測(cè)量系統(tǒng)研究苜蓿莖點(diǎn)霉對(duì)紫花苜蓿葉片光合生理的影響。結(jié)果表明, 除侵染第27天外，苜蓿莖點(diǎn)霉使紫花苜蓿葉片凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)和蒸騰速率(Tr)降低，對(duì)胞間二氧化碳濃度(Ci)在侵染前期影響不大。在侵染至23 d，紫花苜蓿葉片光化學(xué)量子效率(Fv/Fm)、PSⅡ反應(yīng)中心激發(fā)能捕獲效率(Fv′/Fm′)、PSⅡ反應(yīng)中心電荷分離實(shí)際量子效率(ΦPSⅡ)、電子傳遞速率(ETR)、光化學(xué)猝滅系數(shù)(qP)和非光化學(xué)淬滅系數(shù)(qN)顯著降低。光補(bǔ)償點(diǎn) (LCP)、CO2補(bǔ)償點(diǎn)(CCP)和羧化效率(CE)降低。表明苜蓿莖點(diǎn)霉通過(guò)降低紫花苜蓿葉片中光合電子傳遞率捕獲效率、非光化學(xué)猝滅系數(shù)(qN)和羧化效率(CE)，而產(chǎn)生光抑制，使CO2的同化作用降低，影響紫花苜蓿的生長(zhǎng)發(fā)育。

紫花苜蓿；苜蓿莖點(diǎn)霉；葉綠素?zé)晒猓还夂享憫?yīng)曲線；CO2響應(yīng)曲線

紫花苜蓿(Medicagosativa)，豆科苜蓿屬植物，是世界種植面積最大的牧草，也是我國(guó)分布最廣的牧草。隨著苜蓿種植面積的擴(kuò)大, 其病害也日益趨于嚴(yán)重。在紫花苜蓿葉部及莖部病害中，春季黑莖病是紫花苜蓿產(chǎn)量、種子產(chǎn)量和品質(zhì)變劣下降的主要因素。紫花苜蓿春季黑莖病, 又稱葉斑病或輪紋病，其病原菌為Phomamedicaginis(苜蓿莖點(diǎn)霉)， 在美國(guó)溫帶地區(qū)、加拿大、澳大利亞、歐洲一些國(guó)家和南美洲都有報(bào)道，在我國(guó)吉林、甘肅、內(nèi)蒙古、河北、陜西和黑龍江也有報(bào)道[1-3]。這種病原最嚴(yán)重危害是對(duì)植株地上部分的危害，使葉變黃，脫落，病枝條上部?？菸劳觯o基腐，花序枯死，使苜蓿產(chǎn)量減少50%，同時(shí)也會(huì)影響種子產(chǎn)量，使種子不飽滿，皺縮。此外由于苜蓿莖點(diǎn)霉可造成根冠和根腐，它可減少牧草密度和可持續(xù)使用[4-6]。植物—病原菌互作是植物病理生理學(xué)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一，光合性能的強(qiáng)弱直接關(guān)系到植物抗病性[7],有些植物感病后會(huì)導(dǎo)致光合作用下降[8-14]，但小麥(Triticumaestivum)葉銹病會(huì)使小麥光合速率提高并誘導(dǎo)蔗糖在病葉中積累[15]。因此，病原菌對(duì)光合作用的影響與其寄主有關(guān)。有研究表明苜蓿莖點(diǎn)霉可損害紫花苜蓿葉片光合系統(tǒng)Ⅱ[16]，但對(duì)其光合生理指標(biāo)的變化未進(jìn)行系統(tǒng)研究。然而植物光合生理的變化是其生長(zhǎng)發(fā)育抵抗生物脅迫的基礎(chǔ)。因此研究苜蓿莖點(diǎn)霉如何影響紫花苜蓿光合生理反應(yīng)具有重要意義。本試驗(yàn)以苜蓿莖點(diǎn)霉在不同時(shí)間侵染紫花苜蓿與對(duì)照相比，觀察苜蓿莖點(diǎn)霉對(duì)紫花苜蓿葉片光合特性的影響，以期為紫花苜蓿的選育、栽培、推廣和管理提供光合生理生態(tài)方面的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試品種 供試紫花苜蓿品種德寶由北京正道生態(tài)科技有限公司提供。

1.1.2 供試菌株 苜蓿莖點(diǎn)霉經(jīng)分離純化，并由蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院李彥忠教授鑒定所得(KP207577)。將莖點(diǎn)霉菌株在 PDA 平板上 25 ℃培養(yǎng) 30 d，待充分產(chǎn)孢后，加無(wú)菌水，經(jīng) 4 層無(wú)菌紗布過(guò)濾，除去菌絲體，配成孢子懸浮液(濃度為1.0×106個(gè)/mL) 備用。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及取樣

以德寶紫花苜蓿為材料在甘肅中醫(yī)藥大學(xué)植物生長(zhǎng)室進(jìn)行盆栽。2015年3月6日播種于直徑為9 cm的花盆中，按照完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)將處理組和對(duì)照組各5盆，每盆播種6粒(苗)，擺放在植物培養(yǎng)箱室中種植(15～25 ℃，14 h自然光照)。2015年6月25日試驗(yàn)組用噴霧器進(jìn)行病原菌噴霧接種，每盆植株以葉片正反面充分濕潤(rùn)為宜，并避光保濕，對(duì)照組噴滅菌水同樣處理。第4天恢復(fù)光照，每2 d澆水一次，接種至第6天，葉片出現(xiàn)暗褐色至黑色近圓形或不規(guī)則形的小點(diǎn)，其發(fā)病癥狀與田間癥狀相同，對(duì)照植株未出現(xiàn)上述癥狀。病葉經(jīng)鏡檢及分離培養(yǎng)后，其病原菌鑒定為苜蓿莖點(diǎn)霉。7月1日進(jìn)行光合相關(guān)參數(shù)測(cè)定，測(cè)定時(shí)選擇上部長(zhǎng)勢(shì)一致，光照相似的相同葉位處測(cè)量3片葉片，測(cè)量3株，每個(gè)葉片均測(cè)定5次。病葉侵染嚴(yán)重度分級(jí)，見表1。苜蓿莖點(diǎn)霉對(duì)紫花苜蓿葉片在不同侵染時(shí)間的侵染嚴(yán)重程度，見圖1。

1.3 試驗(yàn)測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 光合參數(shù)的測(cè)定 光合測(cè)定時(shí)間2015年7月1日至7月23日開始于每日上午9:00-12:00時(shí)測(cè)定。測(cè)定系統(tǒng)為L(zhǎng)I-6400XT便攜式光合作用測(cè)量系統(tǒng)和6400-02B紅藍(lán)光源葉室測(cè)定，測(cè)定光強(qiáng)為1000 μmol/(m2·s)。測(cè)定Pn(光合速率)、Gs(氣孔導(dǎo)度)、Ci(胞間二氧化碳濃度)和Tr(蒸騰速率)。測(cè)定時(shí)選擇上部長(zhǎng)勢(shì)一致，光照相似的相同葉位處測(cè)量3片葉片，測(cè)量3株，每個(gè)葉片均測(cè)定5次，讀取數(shù)據(jù)。

1.3.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定 采用LI-6400XT便攜式光合作用測(cè)量系統(tǒng)和6400-40熒光葉室進(jìn)行測(cè)定，于2015年7月13日至7月23日開始于每日7:00前對(duì)葉片進(jìn)行標(biāo)記，采用錫紙包裹，避光處理30 min，進(jìn)行暗反應(yīng)， 測(cè)定其F0(the fluorescence parameters of the minimum initial fluorescence, 最小初始熒光)和Fv/Fm(photochemical quantum efficiency, 光化學(xué)量子效率)，當(dāng)日上午10:00打開活化光源，進(jìn)行光反應(yīng)，將葉片加入葉室，測(cè)定光適應(yīng)狀態(tài)下葉片的Fv′/Fm′ (PSⅡ reaction center of excitation energy capture efficiency, 光下開放的PSⅡ反應(yīng)中心的激發(fā)能捕獲效率)、ΦPSⅡ(the relative quantum efficiency of PSⅡ photochemistry, PSⅡ反應(yīng)中心電荷分離實(shí)際量子效率)、ETR (electron transport rate, 電子傳遞速率)、qP(photochemical quenching, 光化學(xué)猝滅系數(shù))和qN(nonphotochemical quenching, 非光化學(xué)猝滅系數(shù))。測(cè)定時(shí)選擇上部長(zhǎng)勢(shì)一致，光照相似的相同葉位處測(cè)量3片葉片，測(cè)量3株，每個(gè)葉片均測(cè)定5次，讀取數(shù)據(jù)。

表1 病葉侵染嚴(yán)重度分級(jí)Table 1 The disease severity level of M. sativa infected by P. medicaginis

圖1 在不同侵染時(shí)間苜蓿莖點(diǎn)霉對(duì)紫花苜蓿侵染的嚴(yán)重度Fig.1 The disease severity level of M. sativa infected by P. medicaginis at different infection time

1.3.3 光響應(yīng)曲線測(cè)定 于2015 年7月21 日9:00-12:00, 采用LI-6400XT便攜式光合作用測(cè)量系統(tǒng)和6400-02B紅藍(lán)光源葉室測(cè)定。對(duì)紫花苜蓿對(duì)照組和試驗(yàn)組葉片(嚴(yán)重度5級(jí))進(jìn)行光響應(yīng)曲線的測(cè)定。測(cè)定時(shí)將CO2濃度控制在(500±1) μmol CO2/mol。在光合有效輻射分別為2000, 1800, 1800, 1600, 1400, 1200, 1000, 800, 600, 400, 300, 200, 150, 120, 100, 80, 60, 40, 20, 10, 0 μmol/(m2·s) 下進(jìn)行測(cè)定，凈光合速率(Pn)為0時(shí)的光強(qiáng)為光補(bǔ)償點(diǎn)(light compensation point,LCP)，凈光合速率最大時(shí)的光強(qiáng)為光飽和點(diǎn)(light saturation point,LSP)。采用光合計(jì)算軟件計(jì)算光補(bǔ)償點(diǎn)、光飽和點(diǎn)、最大凈光合速率(maximum net photosynthetic rate,Pnmax)以及表觀量子效率(apparent quantum yield,AQY)。

1.3.4 CO2響應(yīng)曲線的測(cè)定 于2015年7月22日采用LI-6400XT便攜式光合作用測(cè)量系統(tǒng)和6400-02B紅藍(lán)光源葉室測(cè)定CO2響應(yīng)曲線。測(cè)定時(shí)設(shè)定光強(qiáng)為1000 μmol/(m2·s)，采用Li-6400液化CO2鋼瓶提供不同的CO2濃度，對(duì)紫花苜蓿對(duì)照組和試驗(yàn)組葉片(嚴(yán)重度5級(jí))進(jìn)行CO2響應(yīng)曲線的測(cè)定。分別在CO2濃度為0, 60, 80, 100, 120, 150, 200, 400, 600, 800, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000 μmol CO2/mol的條件下測(cè)定葉片Pn，然后采用光合計(jì)算軟件計(jì)算參數(shù)：最大凈光合速率(Pnmax)、核酮糖-1,5-二磷酸(Rubp)羧化效率(CE)、CO2飽和點(diǎn)(CSP)、CO2補(bǔ)償點(diǎn)(CCP)和光呼吸速率(Rp)。

1.4 統(tǒng)計(jì)與分析

用SPSS 21.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行t檢驗(yàn)分析 (*P<0.05，**P<0.01)，數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(means±SE)。用Origin 8.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿莖點(diǎn)霉對(duì)紫花苜蓿氣體交換參數(shù)的影響

2.1.1 苜蓿莖點(diǎn)霉對(duì)紫花苜蓿凈光合速率(Pn)的影響 由圖2A可見，試驗(yàn)組病葉隨著病情嚴(yán)重度加重，Pn值并沒呈下降趨勢(shì)，而是呈波浪形浮動(dòng)。在不同侵染時(shí)間與對(duì)照組比均降低并具顯著性差異，Pn在葉片接菌后不同侵染時(shí)間較對(duì)照組降低幅度大多在20%～45%之間，接菌第11和27天降低幅度最小，為6.0%左右，接菌第13和23天降低幅度大，分別為55.08%和63.21%。 說(shuō)明苜蓿莖點(diǎn)霉能夠影響紫花苜蓿的凈光合速率。

2.1.2 苜蓿莖點(diǎn)霉對(duì)紫花苜蓿胞間二氧化碳濃度(Ci)的影響 由圖2B可見，除侵染第27天外，試驗(yàn)組Ci在不同侵染時(shí)間變化幅度較小。與對(duì)照組相比，Ci值在感染后第9、14、19天比對(duì)照組高3.07%～7.38%，但沒有顯著性差異。感染至第27天降低幅度最大，為53.31%。說(shuō)明苜蓿莖點(diǎn)霉會(huì)影響紫花苜蓿對(duì)二氧化碳的吸收利用。

2.1.3 苜蓿莖點(diǎn)霉對(duì)紫花苜蓿氣孔導(dǎo)度(Gs)的影響 由圖2C可見，試驗(yàn)組Gs最大值在侵染第18和19天，侵染至第28天時(shí)Gs降至最低。與對(duì)照組相比，在不同侵染時(shí)間Gs均降低并呈顯著性差異，侵染第19天Gs較對(duì)照組降低幅度最小，為11.60%，降低幅度為70%以上的為侵染至第13、27和28天。表明苜蓿莖點(diǎn)霉可使紫花苜蓿葉片氣孔導(dǎo)度降低。

2.1.4 苜蓿莖點(diǎn)霉對(duì)紫花苜蓿蒸騰速率(Tr)的影響 由圖2D可見，試驗(yàn)組在侵染第19天Tr值最大，在第28天Tr值最小。與對(duì)照組相比, 在不同侵染時(shí)間Tr值均降低，并呈顯著性差異。病葉較對(duì)照組在不同侵染時(shí)間降低多在20%～50%，降低幅度在55%以上的為侵染第13天降低59.16%，侵染第27天降低70.50%，第28天降低69.00%。說(shuō)明苜蓿莖點(diǎn)霉可通過(guò)降低氣孔導(dǎo)度降低紫花苜蓿蒸騰速率。

圖2 苜蓿莖點(diǎn)霉對(duì)紫花苜蓿葉片光合速率、胞間CO2濃度、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率的影響Fig.2 Effect of P. medicaginis on the photosynthetic rate (Pn), CO2 concentration (Ci), stomatal conductance (Gs) and transpiration rate (Tr) of M. sativa leaves*P<0.05，**P<0.01.下同。The same below.

2.2 苜蓿莖點(diǎn)霉脅迫對(duì)紫花苜蓿葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

葉綠素?zé)晒鈪?shù)與光合作用的各種反應(yīng)密切相關(guān)，任何逆境脅迫對(duì)光合作用的影響都可以通過(guò)葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)反映出來(lái)。葉綠素?zé)晒馐枪夂献饔米兓奶结槪ㄟ^(guò)對(duì)各種熒光動(dòng)力學(xué)參數(shù)的分析可以獲知有關(guān)光能利用途徑的信息[17]。

2.2.1 苜蓿莖點(diǎn)霉對(duì)紫花苜蓿初始熒光(F0)的影響F0是光照下最小初始熒光，又稱基底熒光或暗熒光。指植物經(jīng)過(guò)充分暗適應(yīng)的光合機(jī)構(gòu)光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)反應(yīng)中心全部開放時(shí)的葉綠素?zé)晒獍l(fā)射強(qiáng)度，主要與PSⅡ天線色素內(nèi)的最初激子密度及葉綠素含量有關(guān)，而與光合作用的光化學(xué)無(wú)關(guān)[18]。由圖3A可見，試驗(yàn)組F0值均低于對(duì)照組，與對(duì)照組比F0值降低最小幅度為侵染第27天，降低5.92%，最大降低幅度為感染第18天，降低46.75%。

圖3 苜蓿莖點(diǎn)酶對(duì)紫花苜蓿葉片葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)的影響Fig.3 Effect of P. medicaginis on chlorophyll fluorescence kinetics parameters of M. sativa leaves

2.2.2 苜蓿莖點(diǎn)霉對(duì)紫花苜蓿光化學(xué)量子效率(Fv/Fm)的影響Fv/Fm表示葉片沒有遭受任何脅迫并經(jīng)過(guò)充分暗適應(yīng)，其PSⅡ最大光能轉(zhuǎn)化效率，也被稱為開放的PSⅡ反應(yīng)中心能量捕獲效率，反映了PSⅡ反應(yīng)中心原初光能轉(zhuǎn)化效率。持續(xù)穩(wěn)定的Fv/Fm值表明PSⅡ未受到損害[18]。由圖3B可見，對(duì)照組在不同測(cè)定時(shí)間保持持續(xù)穩(wěn)定(P<0.05)，試驗(yàn)組Fv/Fm隨著侵染程度的加重逐漸降低，侵染至第23天時(shí)Fv/Fm值呈顯著性降低，侵染至第28天時(shí)降為最低，較對(duì)照組降低11.93%。表明隨著苜蓿莖點(diǎn)霉對(duì)紫花苜蓿葉片損害程度的加重，紫花苜蓿葉片PSⅡ受損加重。

2.2.3 苜蓿莖點(diǎn)霉對(duì)紫花苜蓿PSⅡ反應(yīng)中心激發(fā)能捕獲效率(Fv′/Fm′)的影響Fv′/Fm′表示光存在時(shí)PSⅡ反應(yīng)中心初始光能捕獲效率。由圖3C可見，各對(duì)照組間Fv′/Fm′值無(wú)顯著性差異(P>0.05)。試驗(yàn)組隨著侵染程度的加深Fv′/Fm′值逐漸降低，在侵染第23天時(shí)Fv′/Fm′值呈顯著性降低。除侵染第19天外，試驗(yàn)組較對(duì)照組Fv′/Fm′均呈顯著性降低，最小降低為侵染至第19天，為4.64%，最大降低為侵染至第27天，為27.70%。

2.2.4 苜蓿莖點(diǎn)霉對(duì)紫花苜蓿PSⅡ反應(yīng)中心電荷分離實(shí)際量子效率(ΦPSⅡ)和電子傳遞速率(ETR)的影響ΦPSⅡ是指當(dāng)光存在時(shí)PSⅡ反應(yīng)中心電荷分離實(shí)際量子效率，反映被用于光化學(xué)途徑激發(fā)能占進(jìn)入PSⅡ總激發(fā)能的比例，是植物光合能力的一個(gè)重要指標(biāo)。ETR反映實(shí)際光強(qiáng)條件下的表觀電子傳遞效率[19]。由圖3D和圖3E可見，試驗(yàn)組ΦPSⅡ和ETR在感染第19天分別較對(duì)照組高2.97%和3.04%，但無(wú)顯著性差異，侵染至第23天后ΦPSⅡ和ETR顯著下降，接種第27天降低幅度較對(duì)照組最大，分別為50.18%和50.24%。表明植物光化學(xué)激發(fā)能和光合電子傳遞速率由于苜蓿莖點(diǎn)霉的影響而降低和變慢。

2.2.5 熒光猝滅動(dòng)力學(xué) 光化學(xué)淬滅系數(shù)qP表示PSⅡ反應(yīng)中心開放程度，反映PSⅡ天線色素吸收的光能用于光化學(xué)電子傳遞的份額，qP愈大，PSⅡ的電子傳遞活性愈大，反映光合活性的高低[20]。非光化學(xué)淬滅系數(shù)qN代表PSⅡ天線色素吸收的光能不能用于光化學(xué)電子傳遞而被用于非光化學(xué)反應(yīng)的程度。由圖3F可見，對(duì)照組qP相差不大，試驗(yàn)組各值相差較大。在苜蓿莖點(diǎn)霉侵染至第19天時(shí)qP值高于對(duì)照組，但沒有顯著性差異，在侵染至第23天時(shí)qP值呈顯著性下降，在侵染第27天達(dá)到最小值，較對(duì)照組降低最大幅度為第23天，為34.85%。qP下降說(shuō)明 PSⅡ中的質(zhì)體醌(QA)氧化態(tài)數(shù)量減少，導(dǎo)致 PSⅡ反應(yīng)中心開放部分比例降低，使QA向泛醌(QB)光合電子傳遞受到抑制。表明苜蓿莖點(diǎn)霉使紫花苜蓿葉片PSⅡ反應(yīng)開放比例降低。

由圖3G可見，對(duì)照組qN值相差較小，試驗(yàn)組葉片在侵染第23天開始qN值顯著降低，除侵染第19天，qN值均顯著低于對(duì)照組，與對(duì)照組比降低最小幅度在侵染第19天，為7.06%，侵染第28天最大降低幅度為32.34%。表明隨著苜蓿莖點(diǎn)霉侵染程度的加重，紫花苜蓿葉片電子傳遞和熱耗散能力最終均降低，病葉熱耗散降低。

2.3 苜蓿莖點(diǎn)霉脅迫對(duì)光響應(yīng)曲線和CO2響應(yīng)曲線的影響

2.3.1 對(duì)光響應(yīng)參數(shù)的影響 苜蓿莖點(diǎn)霉侵染紫花苜蓿葉片后，在不同光照強(qiáng)度下病葉和健葉光響應(yīng)曲線變化有差異。從圖4A可以看出，在0～120 μmol CO2/(m2·s)的光強(qiáng)范圍內(nèi)，病葉中凈光合速率幾乎呈線性增長(zhǎng)，在120～1400 μmol CO2/(m2·s)光強(qiáng)范圍內(nèi)凈光合速率的增長(zhǎng)處于極緩慢狀態(tài)，在光強(qiáng)為1600～2000 μmol CO2/(m2·s)時(shí)凈光合速率開始下降，說(shuō)明病葉在一定的光照強(qiáng)度下，葉片光合作用處于抑制狀態(tài)。健葉在0～800 μmol CO2/(m2·s)的光強(qiáng)范圍內(nèi)，葉片中凈光合速率幾乎呈線性增長(zhǎng)，800～2000 μmol CO2/(m2·s)光強(qiáng)范圍內(nèi)凈光合速率的增長(zhǎng)處于極緩慢狀態(tài)。用雙曲線修正模型擬合并計(jì)算參數(shù)：光補(bǔ)償點(diǎn)、光飽和點(diǎn)、最大凈光合速率以及表觀量子效率。由表2可見，苜蓿莖點(diǎn)霉侵染紫花苜蓿葉片后，使葉片光飽和點(diǎn)、光補(bǔ)償點(diǎn)、最大凈光合速率和暗呼吸速率均顯著性低于健葉(P<0.05)，表觀量子效率大于健葉，但無(wú)顯著性差異。說(shuō)明苜蓿莖點(diǎn)霉的侵染使紫花苜蓿葉片適于在弱光下生長(zhǎng)，對(duì)強(qiáng)光產(chǎn)生抑制[21]。

2.3.2 對(duì)CO2響應(yīng)參數(shù)的影響 CO2濃度對(duì)健葉和病葉光合作用有顯著影響，CO2響應(yīng)曲線變化有差異。從圖4B可以看出，在0～600 μmol CO2/mol的濃度范圍內(nèi)，病葉凈光合速率幾乎呈線性增長(zhǎng)，在800～1800 μmol CO2/mol濃度范圍內(nèi)凈光合速率基本維持穩(wěn)定，在光強(qiáng)為1800～2000 μmol CO2/mol時(shí)凈光合速率逐漸下降，健葉在0～1000 μmol CO2/mol的濃度范圍內(nèi)，凈光合速率幾乎呈線性增長(zhǎng)，1000～2000 μmol CO2/mol濃度范圍內(nèi)凈光合速率處于緩慢增長(zhǎng)狀態(tài)。用雙曲線修正模型擬合并計(jì)算參數(shù)：最大凈光合速率、核酮糖-1,5-二磷酸(Rubp)羧化效率、CO2飽和點(diǎn)、CO2補(bǔ)償點(diǎn)和光呼吸速率。由表2可見，苜蓿莖點(diǎn)霉侵染紫花苜蓿葉片后，試驗(yàn)組葉片Pnmax、CE和CSP都顯著低于對(duì)照組，CCP和Rp顯著高于對(duì)照組。紫花苜蓿侵染后適于病葉在一定的CO2濃度下，葉片的凈光合速率被抑制。苜蓿莖點(diǎn)霉侵染紫花苜蓿葉片后使其Rubp羧化效率減低，在一定高CO2濃度下，產(chǎn)生光合抑制。

圖4 苜蓿莖點(diǎn)霉對(duì)紫花苜蓿葉片光合響應(yīng)曲線和CO2響應(yīng)曲線的影響Fig.4 Effect of P. medicaginis on photosynthetic response curves and the CO2 response curve of M. sativa leaves

參數(shù)Parameters樣品Samples健葉Control病葉Inoculation光飽和最大凈光合速率Thelightsaturationmaxnetphotosyntheticrate[Pnmax,μmolCO2/(m2·s)]8.4654±0.1391a3.5123±0.1008b表觀量子效率Apparentquantumyield[AQY,μmolCO2/(m2·s)]0.0324±0.0035a0.0447±0.0039a光飽和點(diǎn)Thelightsaturationpoint[LSP,μmol/(m2·s)]2066.2562±38.6887a1278.4824±271.1648b光補(bǔ)償點(diǎn)Thelightcompensationpoint[LCP,μmol/(m2·s)]19.5365±0.3059a12.6252±0.2342b暗呼吸速率Darkrespirationrate[Rd,μmolCO2/(m2·s)]0.6007±0.0560a0.5042±0.0427aCO2飽和最大凈光合速率CO2saturationmaxnetphotosyntheticrate[Pnmax,μmolCO2/(m2·s)]18.2413±0.3161a10.7427±0.2741bRubp羧化效率Rubpcarboxylationefficiency[CE,μmolCO2/(m2·s)]0.0643±0.0034a0.0361±0.0034bCO2飽和點(diǎn)CO2saturationpoint(CSP,μmolCO2/mol)2041.9194±60.2874a1441.5865±13.0886bCO2補(bǔ)償點(diǎn)CO2compensationpoint(CCP,μmolCO2/mol)4.9983±0.2863b32.6146±0.2548a光呼吸速率Photorespirationrate[Rp,μmolCO2/(m2·s)]0.3154±0.0093b1.1097±0.1044a

注:同行數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在P=0.05水平差異顯著(Studentt檢驗(yàn))。

Note: The different lowercase letters in the same line stand for significant differences atP=0.05 level (Studentttest).

3 討論

3.1 對(duì)光合和葉綠素?zé)晒獾淖饔?/p>

植物受到脅迫導(dǎo)致光合作用下降，分為氣孔因素和非氣孔因素。氣孔限制是由于氣孔關(guān)閉，阻斷植物CO2的供應(yīng)，造成植物光合作用下降[22]。非氣孔限制包括光合器官的破壞和抑制，光合磷酸化解偶聯(lián)，暗反應(yīng)酶系失活和細(xì)胞質(zhì)膜的破壞等，即使提供足夠的CO2，光合作用仍然不能正常運(yùn)行[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿莖點(diǎn)霉侵染造成紫花苜蓿葉片凈光合速率(Pn)降低，氣孔導(dǎo)度(Gs)下降，但胞間CO2濃度(Ci)除侵染第27天急劇下降外基本變化不大。當(dāng)參數(shù)Gs與Ci以同樣趨勢(shì)下降時(shí)，才能確定Pn的降低是由氣孔因素造成的[24]。由此可見，本研究中Pn降低是由非氣孔因素造成。

在苜蓿莖點(diǎn)霉侵染初期，紫花苜蓿葉片ΦPSⅡ、qP和ETR會(huì)有不同程度升高，說(shuō)明苜蓿莖點(diǎn)霉侵染后使PSⅡ反應(yīng)中心開放部分比例加大, 增加葉片PSⅡ光合電子傳遞能力。光合作用的電子傳遞與形成ATP的光合磷酸化相偶聯(lián)，這將有助于為光合碳同化提供更充足的ATP和NADPH。但隨著病情逐漸嚴(yán)重，在侵染至23 d，ΦPSⅡ、qP、ETR和Fv′/Fm′顯著降低，導(dǎo)致NADPH降低，使光合電子傳遞率降低，光學(xué)活性降低，使光合作用受到抑制[25-27],qN在苜蓿莖點(diǎn)霉侵染后降低，使反應(yīng)葉片吸收的光能散熱減少，最終加重對(duì)光合系統(tǒng)Ⅱ的損傷。苜蓿莖點(diǎn)霉侵染紫花苜蓿后其葉片PSⅡ的光化學(xué)效率Fv/Fm降低，說(shuō)明侵染使PSⅡ的結(jié)構(gòu)和功能都受到損傷，葉綠體把所捕獲的光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的效率降低，使光合碳同化所需ATP合成減少。F0初始熒光降低是由非光化學(xué)能量耗散而引起的，具保護(hù)作用。

3.2 對(duì)光響應(yīng)曲線的作用

光照強(qiáng)度對(duì)植物的光合特性有顯著影響[28]，植物葉片光飽和點(diǎn)與光補(bǔ)償點(diǎn)反映了植物對(duì)光照條件的要求，病葉光補(bǔ)償點(diǎn)LCP和光飽和點(diǎn)LPS低于健葉，AQY高于健葉但無(wú)顯著性差異，說(shuō)明苜蓿莖點(diǎn)霉侵染葉片后，使紫花苜蓿葉片結(jié)構(gòu)和生理功能發(fā)生變化，使葉片中防御強(qiáng)光破壞的保護(hù)機(jī)制減弱，如葉黃素循環(huán)的熱耗散和活性氧清除能力降低，使其適用于弱光。病葉光合作用的飽和光強(qiáng)大大低于健康葉片，因此當(dāng)暴露在強(qiáng)光下時(shí)，出現(xiàn)光合作用的光抑制作用甚至可能有光氧化和光破壞。病葉暗呼吸速率(Rd)低于健葉，說(shuō)明其對(duì)CO2在光下被重新回收利用率降低[29-31]。

3.3 對(duì)CO2響應(yīng)曲線的影響

植物的光合速率受植物體內(nèi)葉綠體的光合速率和CO2供應(yīng)控制，苜蓿莖點(diǎn)霉侵染紫花苜蓿后，紫花苜蓿葉片CCP升高，CSP降低使葉片CO2利用幅度變窄，凈光合速率降低，影響植物生長(zhǎng)。葉片最大羧化速率是表征植物光合能力的重要參數(shù)，是光合作用過(guò)程中羧化反應(yīng)這一重要限速反應(yīng)的速率，對(duì)光合速率起著決定作用，提高葉片最大羧化速率是提高光能利用率的關(guān)鍵[32]。植物葉片羧化效率是光合速率與CO2濃度的比值，反映核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco) 的活性大小及含量多少，Rubisco 活性越大，含量越高，羧化效率就越高，它決定植物的最大凈光合速率(Pnmax)、暗呼吸速率(Rd)和光呼吸速率(Rp)等過(guò)程[33-34]。苜蓿莖點(diǎn)霉侵染紫花苜蓿葉片后， Rubp羧化效率(CE)較對(duì)照組降低，其可能原因是紫花苜蓿葉片被苜蓿莖點(diǎn)霉侵染后，其葉片內(nèi)部構(gòu)造發(fā)生重排，葉片葉綠素含量、Rubisco 含量開始減少，葉片最大羧化速率隨之下降[35-36]。

4 結(jié)論

苜蓿莖點(diǎn)霉侵染紫花苜蓿后，使其光合作用降低，為非氣孔因素。苜蓿莖點(diǎn)霉可降低紫花苜蓿葉片中光合電子傳遞捕獲速率、非光化學(xué)猝滅系數(shù)(qN)和羧化效率(CE)，產(chǎn)生光抑制，并使CO2的同化作用降低，加重對(duì)PSⅡ的損害進(jìn)而影響植物生長(zhǎng)。但隨著葉片病情的加重，光合作用并未迅速降低，而是呈波浪形浮動(dòng)，說(shuō)明在苜蓿莖點(diǎn)霉侵染紫花苜蓿后，寄主也產(chǎn)生一些防御機(jī)制，同時(shí)病原菌為其生存也會(huì)改變植物的生理生化過(guò)程，因此還需從植物與光合作用有關(guān)的碳代謝、氮代謝、次生代謝產(chǎn)物及抗病蛋白基因表達(dá)等方面進(jìn)行更深入研究。

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The effect of Phoma medicaginis on the photosynthetic physiology of Medicago sativa

FAN Qin1,2, LI Yan-Zhong1,3*

1.StateKeyLaboratoryofGrasslandAgro-ecosystems,CollegeofPastoralAgricultureScienceandTechnology,LanzhouUniversity,Lanzhou730020,China; 2.GansuUniversityofChineseMedicine,Lanzhou730000,China; 3.InstituteofGrasslandResearch,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Hohhot010010,China

The yield and quality ofMedicagosativaare seriously affected by the fungal pathogenPhomamedicaginis. A study has been undertaken using growth chamber pot experiments and the LI-6400/XT photosynthesis measurement system to investigate the effects of this pathogen on the photosynthetic physiology ofM.sativa. The results showed that until 27 days post-inoculation (dpi) the net photosynthetic rate (Pn), stomatal conductance (Gs) and transpiration rate (Tr) ofM.sativawere reduced byP.medicaginisinfection. In the early stages of infection there were little changes in intercellular CO2concentration (Ci) in the leaves. By 23 dpi, infected leaves showed significant reductions in photochemical quantum efficiency (Fv/Fm), PSⅡ reaction center of excitation energy capture efficiency (Fv′/Fm′), the relative quantum efficiency of PSⅡ photochemistry (ΦPSⅡ), electron transfer rate (ETR), photochemical quenching (qP) and non-photochemical quenching (qN). Light compensation point, CO2compensation point and carboxylation efficiency (CE) also decreased. The results indicate that the photosynthetic electron transfer rate and capture efficiency, non-photochemical quenching (qN), and carboxylation efficiency (CE) decreased in leaves infected byP.medicaginis, leading to light suppression and a decrease in the assimilation of CO2that affect the growth and development ofM.sativa.

Medicagosativa;Phomamedicaginis; chlorophyll fluorescence; photosynthesis response curve; CO2response curve

10.11686/cyxb2016275

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-07-14；改回日期：2016-09-20

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303057)，國(guó)家牧草產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-35)和國(guó)家自然科學(xué)基金(31272496)資助。

樊秦(1976-), 女, 重慶酉陽(yáng)人，副教授，在讀博士。E-mail：fanqin408@126.com*通信作者Corresponding author. E-mail：liyzh@lzu.edu.cn

樊秦, 李彥忠. 苜蓿莖點(diǎn)霉對(duì)紫花苜蓿光合生理的影響. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2017, 26(1): 112-121.

FAN Qin, LI Yan-Zhong. The effect ofPhomamedicaginison the photosynthetic physiology ofMedicagosativa. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(1): 112-121.