姚 遠(yuǎn) 汪蓓蕾 王大瑋 陳 皓 郭 剛

(天津醫(yī)科大學(xué)內(nèi)分泌研究所，天津 300070)

Shh信號通路相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控甲狀腺功能減退的機(jī)制

姚 遠(yuǎn) 汪蓓蕾 王大瑋 陳 皓 郭 剛

(天津醫(yī)科大學(xué)內(nèi)分泌研究所，天津 300070)

目的 探討甲狀腺功能減退(甲減)大鼠海馬組織中Shh信號通路信號肽Shh、膜受體Patched-1和核轉(zhuǎn)錄因子Gli-1的表達(dá)及甲減對腦發(fā)育及功能調(diào)控影響的分子機(jī)制。方法 12只SPF級健康Wistar大鼠按照隨機(jī)字?jǐn)?shù)表法分為對照組和甲減組，每組6只，甲減組經(jīng)腹腔注射丙基硫氧嘧啶建模，對照組經(jīng)腹腔注射生理鹽水，測定兩組三碘甲狀腺原氨酸(T3)、T4及促甲狀腺激素(TSH)水平，對比兩組Shh、Patched-1和Gli-1蛋白水平及 mRNA表達(dá)。結(jié)果 與對照組比較，甲減組大鼠血清T3、T4水平明顯降低，TSH水平明顯升高(P<0.05)。甲減組Shh，Patched-1及 Gli-1蛋白及mRNA表達(dá)相比對照組均明顯降低(P<0.05)。結(jié)論 甲減腦組織Shh、Patched-1和Gli-1 蛋白水平及mRNA表達(dá)明顯降低，導(dǎo)致甲狀腺激素生物學(xué)效應(yīng)降低，為甲狀腺功能減退的臨床治療打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

甲狀腺功能減退；Shh；Patched；Gli

早期胚胎發(fā)育過程中，Hedgehog信號通路能夠確定胚體極性和影響多種成體附屬物的形成〔1，2〕。脊椎動(dòng)物的Hedgehog家族包括三個(gè)成員Shh、Ihh、Dhh，其中Shh蛋白可以通過Shh信號通路發(fā)揮信號傳遞作用，從而影響細(xì)胞分化、器官形成和胚胎發(fā)育〔3，4〕。Shh與其跨膜受體Patched結(jié)合后，使細(xì)胞膜跨膜蛋白Smo游離和激活；Smo下游分子Gli因子水平升高，然后同DNA結(jié)合，從而誘導(dǎo)目的基因的轉(zhuǎn)錄〔5〕。所以Shh信號通路在機(jī)體生長發(fā)育過程中起重要作用。Fagman等〔6〕通過檢測Shh基因缺陷的小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲狀腺發(fā)育和移位的時(shí)間延遲，并且形成大部分位于左側(cè)的單側(cè)甲狀腺，其與同齡對照組一側(cè)的甲狀腺大致相等。此結(jié)果顯示Shh基因能夠控制甲狀腺后期發(fā)育的對稱性。由此推測Shh信號通路與甲減的發(fā)生有關(guān)系。甲減作為一種以基礎(chǔ)代謝率降低為特征的內(nèi)分泌疾病，心率減慢、精神萎靡、肌肉無力和血壓降低等病理變化可能與大腦海馬結(jié)構(gòu)功能改變或者發(fā)育相關(guān)〔7〕。旨在探討甲狀腺功能減退與Shh信號通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型建立 清潔SPF級健康Wistar大鼠12只，雌雄各半，體重(200.1±20.2)g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司購買。買回后的大鼠常規(guī)喂養(yǎng)1 w，并且沒有懷孕等不良反應(yīng)，將12只大鼠按照隨機(jī)字?jǐn)?shù)表法分為對照組和甲減組，每組6只。甲減組按1 mg/100 g體重經(jīng)腹腔注射丙基硫氧嘧啶(Sigma，美國)，連續(xù)4 w；對照組腹腔注射生理鹽水(500 μl/只)。

1.2 標(biāo)本的采集和制備 將兩組大鼠動(dòng)脈采血以后做甲狀腺功能檢測。處死大鼠后，將冰上獲得的海馬腦組織放到4℃生理鹽水中，置于-80℃冰箱備用，用于Shh、Patched-1、Gli-1 mRNA的檢測。

1.3 甲狀腺激素水平測定 將采集的血液經(jīng)過10 000 r/min離心5 min，然后取血清，-80℃保存，備用。三碘甲狀腺原氨酸(T3)、T4、促甲狀腺激素(TSH)水平采用放免法檢測，放免試劑盒購自德國Bayer CLIA試劑盒，具體操作按照說明書進(jìn)行。

1.4 Shh、Patched-1、Gli-1 mRNA表達(dá)的測定 海馬組織總RNA提?。焊鶕?jù)說明書每100 mg大鼠海馬組織加入1 ml Trizol(購自Takara)，通過勻漿儀破碎后37℃孵育5 min。然后再加入0.2 ml氯仿，渦旋振蕩器振蕩15 s后，接著孵育3 min。4℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清液加入0.2 ml異丙醇，室溫下孵育10 min。4℃ 12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入1 ml 75%乙醇沖洗3次。4℃ 7 500 r/min離心5 min，棄上清，37℃烘箱中干燥10 min。最后將RNA沉淀溶于焦碳酸乙二酯(DEPC)水處理過的去離子水中，-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｍㄟ^逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)最后獲得cDNA。

PCR擴(kuò)增：將樣品預(yù)變性5 min，然后進(jìn)入以下循環(huán)：94℃變性1 min，56℃退火45 s，72℃延伸1.5 min。經(jīng)過37℃?zhèn)€循環(huán)以后，72℃延伸10 min。利用SYBR Green(Taraka，美國)熒光染料進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，最終獲得各組樣本標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析Ct值。北京生工生物工程有限公司合成各目的基因的引物序列，Shh(156 bp)引物：正義5′-GAACTCCGTGGCGGCCAAATC-3′，反義5′-GTCCAGGAAGGTGAGGAAGTC-3′；Gli-1(110 bp)引物：正義5′-TATGTCAGGGTCCCAGGGTTATG-3′，反義5′-GAGCCCGCTTCTTAGTCAGTTTG-3′；Patched-1(80 bp)引物：正義5′-CCATTTCTTGCCCTTGGTGTTG-3′，反義5′-CCTCTTATTCTGTCCCGTTTCAC-3′。

1.5 Shh，Patched-1，Gli-1分子的測定 通過組織勻漿器將加入RIPA裂解液(購自索萊寶)(含蛋白酶抑制劑PMSF)的海馬腦組織磨勻。4℃將勻漿液12 000 r/min離心15 min，取上清液。利用BCA法(Thermo，美國)測定海馬腦組織總蛋白含量。用微量加樣器加入樣品，保證每孔總蛋白量在20 μg。上層濃縮膠的電泳電壓(80 V)，分離膠電泳電壓(110 V)。當(dāng)溴酚藍(lán)染料前沿到凝膠末端處停止電泳。將海綿、濾紙、激活的聚偏氟乙烯(PVDF)膜、分離膠按照既定的順序排列，PVDF膜與膠、濾紙之間不能出現(xiàn)氣泡。在冰盒中80 V電轉(zhuǎn)2 h。Tris鹽酸緩沖液(TBST)室溫漂洗。洗滌過后加入5%胎牛血清(BSA)封閉2 h。然后加入三種分子對應(yīng)的一抗(羊抗大鼠Shh，羊抗大鼠Patched-1，兔抗大鼠Gli-1，1∶200；購自Santa)，4℃搖床孵育過夜。加相應(yīng)辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(中杉金橋，中國)室溫孵育1 h(1∶5 000)，洗膜后，混合好的化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光法(ECL)顯色試劑覆蓋印跡膜。利用Image圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行光密度分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 兩組血清甲狀腺激素水平比較 與對照組比較，甲減組大鼠血清T3、T4水平明顯降低，TSH水平明顯升高(P<0.05)，說明建模成功。見表1。

組別T3T4TSH對照組0.04±0.01598.38±7.260.45±0.04甲減組0.01±0.01218.37±4.780.96±0.03t/P值31.512/0.00184.624/0.00118.543/0.002

2.2 兩組Shh，Patched-1及Gli-1 mRNA及蛋白含量 甲減組Shh，Patched-1及 Gli-1 mRNA及蛋白表達(dá)比對照組明顯降低(P<0.05)，見表2，表3。

組別ShhPatched-1Gli-1對照組1.08±0.321.12±0.461.15±0.45甲減組0.60±0.160.62±0.140.81±0.21t/P值10.964/0.00110.335/0.0176.046/0.019

組別ShhPatched-1Gli-1對照組1.08±0.081.04±0.071.09±0.09甲減組0.34±0.060.32±0.040.41±0.01t/P值20.911/0.00120.339/0.01220.045/0.017

3 討 論

甲減最為有效的治療方法是甲狀腺激素終身替代療法。遵循的基本原則是由低量開始，然后慢慢增加劑量，最后達(dá)到有效量后長期維持。但是這需要較長時(shí)間才能達(dá)到體內(nèi)激素水平的動(dòng)態(tài)平衡，而且達(dá)平衡以后，部分患者仍然需要終身激素替代治療。所以長時(shí)間服藥導(dǎo)致的多種副作用是不可忽視的，嚴(yán)重者可能誘發(fā)心絞痛甚至心力衰竭等嚴(yán)重癥狀〔8〕。T3是生物界中生物活性最強(qiáng)的甲狀腺激素，T4是T3的主要來源和甲狀腺激素庫的主要存在形式，因此測定血清中T3和T4 的濃度能夠反映出甲狀腺功能的狀態(tài)。作為調(diào)節(jié)甲狀腺功能的主要激素，TSH作用于碘代謝的所有環(huán)節(jié)，它可以促進(jìn)碘的轉(zhuǎn)運(yùn)、甲狀腺球蛋白水解、酪氨酸碘化和碘泵活性等。最重要的是TSH能夠調(diào)節(jié)T3和T4合成與分泌。當(dāng)甲狀腺功能改變時(shí)，TSH濃度的變化、合成和分泌比 T3和T4 更快，并且更加明顯。所以血清中TSH含量變化是診斷甲減的最主要指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，甲減組Shh、Patched-1及 Gli-1的蛋白水平比對照組明顯降低，提示甲減能夠影響Shh信號通路。Farmer等〔5〕指出Shh與其跨膜受體 Patched結(jié)合后，使細(xì)胞膜跨膜蛋白Smo游離并被激活，Smo下游鋅指家族轉(zhuǎn)錄因子Gli水平升高，成為轉(zhuǎn)錄激活因子，與DNA結(jié)合，從而誘導(dǎo)目的基因的轉(zhuǎn)錄。這有助于加深對甲減腦損害分子機(jī)制的理解，提示Shh信號通路在甲減腦損害的發(fā)病過程中起到特殊作用。Hasebe等〔9〕發(fā)現(xiàn)大鼠甲減時(shí)，這三個(gè)基因只有Shh基因的相對表達(dá)量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的降低，與本次研究一致。進(jìn)一步研究提示Shh信號通路在甲減腦損害的發(fā)病過程中起到特殊作用。

綜上所述，甲減時(shí)腦組織Shh信號通路mRNA表達(dá)水平下調(diào)，直接導(dǎo)致了甲狀腺激素的生物學(xué)效應(yīng)降低，造成神經(jīng)細(xì)胞損傷。甲減腦組織Shh mRNA表達(dá)水平降低的現(xiàn)象，有助于進(jìn)一步加深對甲減性腦損傷病理機(jī)制的認(rèn)識，推測可以利用某些激活劑激活Shh信號通路，為甲減的臨床提供新思路。

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〔2016-04-18修回〕

(編輯 袁左鳴)

郭 剛(1963-)，男，碩士，研究員，主要從事甲狀腺疾病和糖尿病的分子機(jī)制研究。

姚 遠(yuǎn)(1990-)，女，在讀碩士，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)方面的研究。

R581.2

A

1005-9202(2017)01-0049-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.022