楊生輝，祖廷勛，羅光宏,*，王丹霞，陳天仁，高自成

極大螺旋藻高光合速率藻種的紫外誘變篩選

楊生輝1，祖廷勛1，羅光宏1,*，王丹霞1，陳天仁1，高自成2

（1.河西學(xué)院凱源生物中心，甘肅省微藻工程技術(shù)研究中心，甘肅省河西走廊特色資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 張掖 734000；2.張掖市生產(chǎn)力促進(jìn)中心，甘肅 張掖 734000）

目的：篩選高光合速率極大螺旋藻藻種。方法：結(jié)合自然分離篩選、超聲處理、紫外誘變和高CO2條件脅迫等方法進(jìn)行誘變篩選。結(jié)果：得到3 株極大螺旋藻突變株KYZ1、KYZ2、KYZ3，通過(guò)藻絲形態(tài)、生長(zhǎng)量、CO2利用率、蛋白質(zhì)含量、葉綠素含量等因素對(duì)比，并采用綜合評(píng)分法，篩選出1株優(yōu)質(zhì)藻株KYZ2。結(jié)論：與出發(fā)藻株相比具有藻絲長(zhǎng)度均明顯變長(zhǎng)、藻絲個(gè)體大、生長(zhǎng)速度快、光合速率高、蛋白質(zhì)和葉綠素含量高等優(yōu)點(diǎn)，是一株具有工業(yè)養(yǎng)殖潛力的藻株。

極大螺旋藻；紫外誘變；突變?cè)逯?/p>

螺旋藻（Spirulina）是一種螺旋狀、不分枝的多細(xì)胞絲狀微藻（Microalga），藻體長(zhǎng)200～500 μm，寬5～10 μm，系藍(lán)藻門(mén)（Cyanophyta）、段殖體目（Hormogonales）、顫藻科（Oscilatoriaceae）、螺旋藻屬（Spirulina）的古老低等原核生物[1]。它含有豐富蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸和各種維生素等多種營(yíng)養(yǎng)成分，具有極高的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值。同時(shí)螺旋藻中還含有多種生物活性物質(zhì)，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、防治癌癥、降低血脂、減肥等多種臨床功效[2-4]。

20世紀(jì)90年代初以來(lái)，螺旋藻已成為全球范圍內(nèi)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)最為成功的微藻[5]。目前螺旋藻的產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)中應(yīng)用的碳源主要是NaHCO3，張峰等[6]的研究表明：CO2替代NaHCO3，不僅使碳源成本減少58%、產(chǎn)量提高20%，還可使鉛、砷、汞等重金屬元素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于利用NaHCO3作碳源生產(chǎn)的螺旋藻的重金屬含量。對(duì)于生產(chǎn)而言，優(yōu)良的螺旋藻藻種是關(guān)鍵。目前螺旋藻的誘變育種主要集中于耐低溫、富含某種功能成分等方面，尚鮮見(jiàn)對(duì)高光合速率螺旋藻藻種進(jìn)行誘變育種的報(bào)道。本研究采用超聲處理極大螺旋藻，制備單細(xì)胞懸液，用紫外線(xiàn)對(duì)該單細(xì)胞體進(jìn)行誘變，并利用高濃度CO2進(jìn)行脅迫處理，篩選獲得優(yōu)良的高光合速率極大螺旋藻藻種。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)基

極大螺旋藻（Spirulina maxima Setch. et Gardn）藻種：KY1，本實(shí)驗(yàn)室保存。

液體培養(yǎng)基為本實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)型的Zarrouk培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基為改進(jìn)型的Zarrouk培養(yǎng)基配方中不添加NaHCO3，其他成分不變。因pH 9.0～10.0是螺旋藻最適生長(zhǎng)pH值，而pH值低于9.3會(huì)影響CO2的吸收速率[7]，因此用NaOH調(diào)節(jié)pH值為9.5。

1.2 儀器與設(shè)備

SY-200型超聲處理器 上海寧商超聲儀器有限公司；DR6000紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)哈希公司；SP-1500型噴霧干燥機(jī) 上海順義實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藻絲單絲篩選擴(kuò)大培養(yǎng)

培養(yǎng)7 d螺旋藻培養(yǎng)液，用培養(yǎng)基稀釋50 倍，在40 倍體式顯微鏡下用挑針挑取健壯、長(zhǎng)度較長(zhǎng)、形態(tài)規(guī)則的單株藻絲，放入含適量培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)30 d，培養(yǎng)條件：光照3 000 lx、溫度25～27 ℃、光暗周期14∶10；再加入少量新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)15 d。轉(zhuǎn)入250 mL三角瓶加入50 mL新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d，再加入50 mL新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)條件：光照8 000 lx、溫度30～32 ℃、光暗周期14∶10。篩選出生長(zhǎng)速度較快的1 株作紫外誘變的出發(fā)藻株。前期為單絲培養(yǎng)，強(qiáng)光容易造成藻體灼傷死亡，選擇弱光和中溫，有利于生長(zhǎng)繁殖；后期藻絲體數(shù)量增加，相互間有光遮蔽效應(yīng)，選擇較高的光強(qiáng)和溫度，更有利于生長(zhǎng)。

1.3.2 CO2脅迫預(yù)實(shí)驗(yàn)

培養(yǎng)好的藻液過(guò)濾，藻體用實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基清洗，接入1 000 mL三角瓶，加入500 mL實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基，用橡皮塞密封，于光照8 000 lx、溫度30～32℃、光暗周期14∶10的條件下培養(yǎng)10 d。分別通入含0.25%、0.5%、0.75%、1% CO2的空氣（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），通氣頻率2 s/min（光周期），流量為0.2～0.25 L/min，設(shè)置3 個(gè)平行，根據(jù)藻體對(duì)CO2的利用率，確定實(shí)驗(yàn)通入空氣的CO2含量。

1.3.3 單細(xì)胞液制備

取生長(zhǎng)期6～7 d的極大螺旋藻培養(yǎng)液5 mL，在冰浴條件下，利用20 kHz、200 W的超聲細(xì)胞破碎儀處理藻體，使藻絲體斷裂。超聲處理1、2、4、8、10 s，顯微鏡觀(guān)察處理效果。使藻絲體斷裂成1～3 個(gè)細(xì)胞長(zhǎng)度的藻絲段為最佳。

1.3.4 紫外誘變

取超聲處理最好的一組，用培養(yǎng)基調(diào)節(jié)螺旋藻細(xì)胞密度為106～107CFU/mL，將8 mL單細(xì)胞懸液置于無(wú)菌直徑10 mm培養(yǎng)皿中，厚度約1 mm，用紫外燈進(jìn)行遠(yuǎn)紫外線(xiàn)輻照，照射時(shí)間分別為0、30、60、90、120、150 s，紫外燈功率為20 W，樣品與紫外燈的距離為20 cm。

1.3.5 突變?cè)逯旰Y選

將紫外輻照后的藻懸液在暗處?kù)o置24 h，加入10 倍體積實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基，移入250 mL三角瓶，用橡皮塞密封，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果通入含1% CO2的空氣，通氣頻率2 s/min（光周期），流量為0.2～0.25 L/min，于光照8 000 lx、溫度30～32 ℃、光暗周期14∶10的條件下培養(yǎng)，隔日顯微鏡觀(guān)察一次；挑選形態(tài)和長(zhǎng)度恢復(fù)較快的單株藻絲段于試管中加適量實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基，并通入預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的含CO2的空氣，通氣頻率2 s/h（光周期），流量為0.1～0.15 L/min，于光照3 000 lx、溫度25～27 ℃、光暗周期14∶10的條件下培養(yǎng)。在此條件下進(jìn)行反復(fù)篩選，根據(jù)生長(zhǎng)期內(nèi)平均生長(zhǎng)速率挑選高光合速率的突變?cè)逯辍?/p>

1.3.6 突變?cè)逯昱囵B(yǎng)

篩選出的藻株，移入1 000 mL三角瓶，加入500 mL實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基，用橡皮塞密封，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果通入含CO2的空氣，通氣頻率2 s/min（光周期），流量為0.2～0.25 L/min，于光照8 000 lx、溫度30～32℃、光暗周期14∶10的條件下培養(yǎng)10 d。同時(shí)以出發(fā)藻株做對(duì)比實(shí)驗(yàn)。

1.3.7 CO2用量計(jì)算

CO2用量/g=通氣頻率×流量×通氣時(shí)間×通入空氣中CO2含量×1.977 （1）

式中：1.977為CO2密度/（g/L）。

1.3.8 指標(biāo)測(cè)定

1.3.8.1 形態(tài)特征觀(guān)測(cè)

鏡檢觀(guān)察測(cè)定突變株藻體長(zhǎng)、螺旋寬、螺距、藻絲寬、螺旋數(shù)，每個(gè)參數(shù)測(cè)定50 條藻絲。

1.3.8.2 生長(zhǎng)量的測(cè)定

取突變?cè)逯昱囵B(yǎng)液3 mL，紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定560 nm波長(zhǎng)處吸光度（A560nm）。

1.3.8.3 CO2利用率的測(cè)定

根據(jù)李夜光等[8]測(cè)定螺旋藻對(duì)CO2利用率測(cè)定的方法，按公式（2）計(jì)算CO2的利用率。

式中：C為CO2的利用率/%；B為干藻量/g；Qg為CO2用量/g；0.47為螺旋藻含碳量系數(shù)；0.27為CO2含碳量系數(shù)。

1.3.8.4 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

參照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》第一法。

1.3.8.5 葉綠素含量的測(cè)定

將突變?cè)逯旰统霭l(fā)藻株用帶蓋的5 L廣口瓶（裝液量4 L），按1.3.6節(jié)條件培養(yǎng)10 d，用300 目尼龍網(wǎng)過(guò)濾清洗采收，利用SP-1500型實(shí)驗(yàn)噴霧干燥機(jī)干燥成粉，干燥條件：進(jìn)風(fēng)溫度150 ℃、出風(fēng)溫度60 ℃。稱(chēng)取3.0 g螺旋藻粉，在45 ℃避光條件下烘干1.5 h， 然后置干燥器中冷卻至室溫，精確稱(chēng)取0.050 g藻粉樣品于50 mL的具塞玻璃刻度試管中，加入20 mL浸提液（85%丙酮-95%乙醇體積比1∶1），34 ℃恒溫避光浸提6 h，每隔2 h攪動(dòng)3～5 min，靜置后沉淀30 min，浸出浸提液于25 mL的棕色容量瓶中，用浸提液定容于刻度線(xiàn)，并記錄定容液的體積（mL）。以浸提液作空白，用帶塞的1 cm的玻璃比色皿在652 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A652nm），根據(jù)公式（3）、（4）計(jì)算葉綠素含量。

式中：C為測(cè)定液中葉綠素含量/（mg/L）；V為色素提取丙酮和乙醇混合液的體積/mL；N為測(cè)定葉綠素時(shí)稀釋倍數(shù)；M為樣品的質(zhì)量/g。

1.3.8.6 綜合評(píng)價(jià)

參照胡海燕等[9]的綜合評(píng)價(jià)方法，以螺旋藻的蛋白質(zhì)含量和生長(zhǎng)速率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)分別設(shè)為0.6和0.4，按公式（5）進(jìn)行評(píng)分，對(duì)突變?cè)逯赀M(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

1.3.8.7 突變?cè)逯甑膫鞔€(wěn)定性分析

將確定的優(yōu)良突變?cè)逯杲尤胄迈r實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基，按1.3.6節(jié)方法連續(xù)培養(yǎng)10代，對(duì)第10代藻株用1.3.8.1節(jié)方法觀(guān)測(cè)形態(tài)特征、用1.3.8.2節(jié)方法測(cè)定其生長(zhǎng)量、用1.3.8.4節(jié)方法測(cè)定其蛋白質(zhì)含量、用1.3.8.5節(jié)方法測(cè)定葉綠素含量，與第1代突變?cè)逯瓯容^。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel結(jié)合SPSS軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 CO2脅迫預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

出發(fā)藻株按1.3.2節(jié)方法培養(yǎng)，通入空氣中CO2含量不同，采收的干藻量和CO2利用率不同，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 出發(fā)藻株CO2脅迫預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table1 Biomass and CO2 utilization rate of the parental strain under extremely highh CO2 conditiioonnss

由表1可知，通入空氣中的CO2含量為0.25%時(shí)，CO2利用率最高，但收獲的干藻量較少，可能是CO2含量較少，不能滿(mǎn)足藻體光合作用需要導(dǎo)致；隨著空氣中CO2的含量升高，收獲的干藻量逐漸增加，但CO2的利用率降低；當(dāng)空氣中CO2的含量達(dá)到0.75%時(shí)，收獲的干藻量和CO2的利用率均降低，可能是極大螺旋藻對(duì)高濃度CO2的培養(yǎng)環(huán)境不適應(yīng)造成的，為了得到在高CO2質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下高光合速率的突變?cè)逯?，選擇實(shí)驗(yàn)CO2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%。

2.2 超聲處理對(duì)藻細(xì)胞的影響

采用超聲處理使螺旋藻藻絲體破碎成1～3 個(gè)細(xì)胞的藻絲段，通過(guò)鏡檢不同處理時(shí)間的藻液發(fā)現(xiàn)，以超聲處理8 s效果最好，僅有少量細(xì)胞破碎；而超聲處理時(shí)間過(guò)短，螺旋藻絲狀體僅斷裂成稍短的藻絲段；處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，螺旋藻細(xì)胞則完全破碎。因此超聲處理時(shí)間為8 s。

2.3 突變?cè)逯晷螒B(tài)特征

突變?cè)逯杲?jīng)多次篩選和傳代培養(yǎng)，獲得了3株生長(zhǎng)速度較快藻株，編號(hào)為KYZ1、KYZ2、KYZ3。按1.3.8.1節(jié)方法鏡檢觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)藻絲形態(tài)發(fā)生變異：藻絲長(zhǎng)度變化明顯、藻絲寬度和螺旋數(shù)量增加，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。而較大形體使螺旋藻藻絲體更易被過(guò)濾采收，因此藻絲體變長(zhǎng)是理想特征之一。

表2 出發(fā)藻種和突變?cè)宸N主要形態(tài)特征比較Table2 Comparison of the main morphological characteristics between the parental strain and the mutants

2.4 突變?cè)逯昱c出發(fā)藻株生長(zhǎng)速度比較

突變?cè)逯昱c出發(fā)藻株相比，不但形態(tài)有明顯差異，生長(zhǎng)速度也發(fā)生了明細(xì)變化，用實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基，通入含1% CO2的空氣，按1.3.6節(jié)方法培養(yǎng)10 d，用1.3.8.2節(jié)方法每2 d測(cè)定A560nm，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 出發(fā)藻株和突變?cè)逯暝趯?shí)驗(yàn)培養(yǎng)基條件下的生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig. 1 Growth curves of the parental strain and the mutants in the culture medium used in this experiment

3 株突變?cè)逯晟L(zhǎng)速度明顯快于出發(fā)藻株，KYZ3生長(zhǎng)速度最快，KYZ1和KYZ2生長(zhǎng)速度接近，生長(zhǎng)高峰出現(xiàn)在6 d以后。

出發(fā)藻株用普通培養(yǎng)基，在光照8 000 lx、溫度30～32 ℃、光暗周期14∶10的條件下培養(yǎng)，其生長(zhǎng)速度高于實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基條件，對(duì)比結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 出發(fā)藻株在普通培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基條件下生長(zhǎng)曲線(xiàn)對(duì)比Fig. 2 Comparison of the growth curves of the parental strain in a common culture medium and in the culture medium used in this investigation

圖1 、2表明，3 株突變?cè)逯暝诟哔|(zhì)量分?jǐn)?shù)CO2條件下生長(zhǎng)較快，出發(fā)藻株則對(duì)高質(zhì)量分?jǐn)?shù)CO2條件不適應(yīng)，生長(zhǎng)較慢。2.5 突變?cè)逯昱c出發(fā)藻株CO2利用率比較

將突變?cè)逯旰统霭l(fā)藻株按1.3.6節(jié)方法培養(yǎng)至10 d采收烘干，根據(jù)采收的干藻量和CO2用量，用1.3.8.3節(jié)中公式計(jì)算CO2利用率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 突變?cè)逯昱c出發(fā)藻株CO利用率比較Table3 Comparison of the CO2availability between the mutants and the parental strain

由表3可知，所有突變?cè)逯曛蠧O2利用率比出發(fā)藻株平均高52%左右，其中最高的是KYZ3，比出發(fā)藻株高出56%。

2.6 突變?cè)逯昱c出發(fā)藻株蛋白質(zhì)含量和葉綠素含量比較

測(cè)定采收烘干的藻粉蛋白質(zhì)和葉綠素含量，由表4可知，所有突變?cè)逯曛械鞍踪|(zhì)含量比出發(fā)藻株平均高2.5%左右，其中最高的是KYZ2，比出發(fā)藻株高出13%，含量最低的KYZ3比出發(fā)藻株低6.5%；葉綠素含量出發(fā)藻株平均高13.3%左右，其中最高的是KYZ2，比出發(fā)藻株高出24.6%。

表4 突變?cè)逯昱c出發(fā)藻株蛋白質(zhì)含量和葉綠素含量比較Table4 Comparison of the contents of protein and chlorophyll between the mutants and the parental strain

出發(fā)藻株應(yīng)用普通培養(yǎng)基，在光照8 000 lx、溫度30～32 ℃、光暗周期14∶10的條件下培養(yǎng)，烘干后的藻粉其蛋白質(zhì)和葉綠素含量分別為61.2%、7.9 g/kg，高于實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基條件。

2.7 綜合評(píng)價(jià)

綜合評(píng)分法是當(dāng)評(píng)價(jià)指標(biāo)無(wú)法用統(tǒng)一的量綱進(jìn)行定量分析時(shí)使用的一種分析方法。評(píng)分時(shí)以各指標(biāo)的最大值為參照將數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，再給每個(gè)指標(biāo)一個(gè)權(quán)重，權(quán)重的大小根據(jù)各指標(biāo)在總體中的貢獻(xiàn)比重給定[10]。對(duì)突變?cè)逯赀M(jìn)行綜合評(píng)分，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 突變?cè)逯昃C合評(píng)分情況Table5 Comprehensive evaluation of the mutants

由表5可以看出，突變?cè)逯闗YZ2的生長(zhǎng)速率、蛋白質(zhì)含量和綜合評(píng)分最高，分別為0.132 g/（L·d）、65.9%、98.3。因此，突變?cè)逯闗YZ2可以作為工業(yè)化培養(yǎng)的藻株。

2.8 優(yōu)良突變?cè)逯陚鞔€(wěn)定性分析

表6 突變?cè)逯曛饕螒B(tài)特征穩(wěn)定性測(cè)試Table6 Stability of the main morphological characteristics of the mutant KKYYZZ22

圖3 突變?cè)逯闗YZ2第1代與第10代生長(zhǎng)曲線(xiàn)比較Fig. 3 Comparison of the growth curves of the 1stgeneration and 10thgeneration of the mutant strain KYZ2

突變?cè)逯甑姆€(wěn)定性分析見(jiàn)表6和圖3。對(duì)優(yōu)良突變?cè)逯闗YZ2經(jīng)過(guò)10 代的傳代培養(yǎng)，藻體形態(tài)保持穩(wěn)定，第1代和第10代生長(zhǎng)曲線(xiàn)未發(fā)生明顯變化，蛋白質(zhì)和葉綠素含量下降對(duì)比不顯著（表7），表明這是一株性狀穩(wěn)定的突變?cè)逯辍?/p>

表7 突變?cè)逯甑?代與第10代蛋白質(zhì)含量和葉綠素含量比較Table7 Comparison of the contents of protein and chlorophyll between thhee 11ssttgeneration and10tthhgeneration of the mutant strain KYZ2

3 討 論

螺旋藻生產(chǎn)中藻種混雜退化、生長(zhǎng)慢、單位面積產(chǎn)量低、質(zhì)量不穩(wěn)定、采收困難等問(wèn)題，已嚴(yán)重阻礙螺旋藻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[10]。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者采用馴化、自然選擇、物理或化學(xué)誘變、基因工程等方法已篩選出一些新品系[11]。紫外線(xiàn)誘變是一種有效的育種方法[12]，紫外誘變技術(shù)以其簡(jiǎn)便快捷和效果顯著，備受誘變育種研究者的青睞[13]。陳新美等[14]用紫外線(xiàn)誘變鈍頂螺旋藻，結(jié)果表明，與出發(fā)藻株相比，藻絲長(zhǎng)度均明顯變長(zhǎng)，螺旋數(shù)超過(guò)40個(gè)，形體較大，易于采收；王妮等[15]通過(guò)紫外線(xiàn)誘變篩選出2株耐低溫鈍頂螺旋藻藻種；李建宏等[16]成功利用紫外誘變獲得優(yōu)良穩(wěn)定鈍頂螺旋藻突變?cè)逯辍?/p>

本研究通過(guò)超聲處理后，利用紫外誘變和高CO2條件脅迫，篩選出的3株極大螺旋藻藻株KYZ1、KYZ2、KYZ3，利用實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d后的藻細(xì)胞生長(zhǎng)量（A560nm）平均比通過(guò)單細(xì)胞分離的出發(fā)藻株KY1高出約75.7%，CO2利用率高52%，這與陳明明等[17]的研究結(jié)果紫外誘變育種技術(shù)可以提高微藻的生長(zhǎng)速率、耐受CO2濃度以及固定CO2效率及葉麗[18]的研究結(jié)果三角褐指藻經(jīng)紫外輻射處理后生長(zhǎng)速率提高相符；在這3 株藻中，KYZ3的生長(zhǎng)速率提高的最多，但其蛋白質(zhì)含量低于出發(fā)藻株，與劉曉娟[19]的研究結(jié)果采用紫外誘變的方法篩選微綠球藻突變?cè)逯?，蛋白質(zhì)含量有所下降相符；KYZ2的蛋白質(zhì)含量提高，與葉麗等[20]的研究結(jié)果紫外誘變的突變?cè)逯昱c出發(fā)藻株相比可以提高綠藻蛋白質(zhì)及梁譯之等[21]的研究結(jié)果利用單細(xì)胞分離技術(shù)和紫外誘變技術(shù)，篩選獲得海水小球藻和鹽生杜氏藻，胞內(nèi)蛋白含量分別高于對(duì)照組18.2%和14.5%的結(jié)果相符。引起這些變化的原因尚需繼續(xù)研究。出發(fā)藻株在普通培養(yǎng)基下培養(yǎng)，其生長(zhǎng)速度、蛋白質(zhì)和葉綠素含量與在實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基條件下差別顯著，說(shuō)明出發(fā)藻株不適應(yīng)高質(zhì)量分?jǐn)?shù)CO2條件、光合速率低，而3株突變?cè)逯昱c出發(fā)藻株相比是適應(yīng)高質(zhì)量分?jǐn)?shù)CO2條件、光合速率高的藻株。

適合固定高用量CO2的微藻，其最適宜生長(zhǎng)的CO2用量約在10%～20%[22]。Yun等[23]在利用漸增CO2濃度法來(lái)提高小球藻對(duì)CO2的耐受性的研究中所獲得的最大CO2固定速率為0.936 g/（L·d）；Sung等[24]分離出最大CO2固定速率達(dá)1.859 g/（L·d）的小球藻藻種KR-1；Kodama等[25]從海水中分離出最高可耐受60% CO2含量的海灘綠球藻（Chlorococcum littorale）；黃云[26]釆用60Co-Y射線(xiàn)核誘變和高用量CO2梯度馴化的方法提高了蛋白核小球藻對(duì)高用量CO2的適應(yīng)性，提高了誘變?cè)宸N的生物質(zhì)產(chǎn)量和固碳效率，微藻的生物質(zhì)產(chǎn)量提高了115%，達(dá)到2.41 g/L，對(duì)15%高用量CO2固定速率和效率分別達(dá)到1.538 g/（L·d）和32.7%；楊闖[27]通過(guò)紫外誘變選育的方法，篩選出耐受20% CO2的小球藻藻株。可以看出提高經(jīng)濟(jì)微藻CO2的耐受性和固定速率還有很大的提升空間。夏建榮等[28]研究認(rèn)為高用量CO2可減輕極大螺旋藻的光抑制，提高強(qiáng)光條件下其光合速率。因此在后續(xù)的工作中采取新的方法進(jìn)行藻種選育，提高螺旋藻對(duì)CO2的耐受性、固定速率和光合速率是亟需解決的問(wèn)題，也是螺旋藻藻種選育的方向。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較出發(fā)藻株和突變?cè)逯甑闹饕L(zhǎng)性能和品質(zhì)（藻絲形態(tài)、生長(zhǎng)量、CO2利用率、蛋白質(zhì)和葉綠素含量），并采用綜合評(píng)分法，從3 株突變?cè)逯曛泻Y選出1 株優(yōu)質(zhì)藻株KYZ2。此突變?cè)逯曛饕呱L(zhǎng)速度快、光合速率高、蛋白質(zhì)和葉綠素含量高、藻絲個(gè)體大等優(yōu)點(diǎn)，是一株具有工業(yè)化養(yǎng)殖潛力的藻株。

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UV-Induced Mutagenesis and Screening of Spirulina maxima for High Photosynthetic Rate

YANG Shenghui1, ZU Tingxun1, LUO Guanghong1,*, WANG Danxia1, CHEN Tianren1, GAO Zicheng2
(1. Kai-yuan Biotechnology Center, Gansu Engineering Research Center for Microalgae, Key Laboratory of Hexi Corridor Resources Utilization of Gansu, Hexi University, Zhangye 734000, China; 2. Zhangye Productivity Promotion Center, Zhangye 734000, China)

Purpose: To screen a mutant strain of Spirulina maxima with high photosynthetic rate. Methods: The mutagenesis and screening were conducted by a combination of spontaneous isolation, ultrasonic treatment, UV irradiation and extremely high CO2stress. Results: Three mutants, namely KYZ1, KYZ2 and KYZ3, were obtained. The filament morphology, biomass, CO2availability, and protein and chlorophyll contents of these three mutants were compared. Finally, KYZ2 was screened as the best strain. Conclusions: Strain KYZ2 revealed longer and larger filaments, faster growth, higher photosynthetic rate, and higher contents of protein and chlorophyll compared with the starting strain. Thus, the mutant strain could have potential for industrial culture.

Spirulina maxima; UV irradiation; mutant strain

10.7506/spkx1002-6630-201702018

Q949.2

A

1002-6630（2017）02-0109-06

楊生輝, 祖廷勛, 羅光宏, 等. 極大螺旋藻高光合速率藻種的紫外誘變篩選[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(2): 109-114. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702018. http://www.spkx.net.cn

YANG Shenghui, ZU Tingxun, LUO Guanghong, et al. UV-induced mutagenesis and screening of Spirulina maxima for high photosynthetic rate[J]. Food Science, 2017, 38(2): 109-114. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201702018. http://www.spkx.net.cn

2016-03-31

2014年甘肅省農(nóng)業(yè)領(lǐng)域知識(shí)產(chǎn)權(quán)優(yōu)勢(shì)企業(yè)培育項(xiàng)目（14OPIPG002）；甘肅省工程技術(shù)研究中心專(zhuān)項(xiàng)（1009FTGG017）；河西學(xué)院科研創(chuàng)新與應(yīng)用校長(zhǎng)基金項(xiàng)目（XZ2011-08）；張掖市科技重大專(zhuān)項(xiàng)（144JTCG254-08）

楊生輝（1976—），男，副教授，碩士，研究方向?yàn)樘厣r(nóng)產(chǎn)品加工及螺旋藻生產(chǎn)及其產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。E-mail：15025888518@163.com

*通信作者：羅光宏（1965—），男，教授，碩士，研究方向?yàn)橹参镔Y源利用與產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)。E-mail：13993693452@163.com