董立君+張麗媛+彭金詠+董佩佩+王麗莉+張利娟+候曉林+趙艷艷

摘 要 建立了新型反相/強(qiáng)陰離子交換混合模式材料（C 18/SAX）的磷酸化肽富集方法?？疾炝肆鲃酉嘟M成（乙腈濃度、甲酸濃度、緩沖鹽濃度）對酪蛋白（α.Casein）酶解液中磷酸化肽分離選擇性的影響。實驗結(jié)果表明， 磷酸化肽在C 18/SAX上的保留行為受疏水和離子交換作用力的共同調(diào)控， 單磷酸化肽先于多磷酸化肽從材料上洗脫出來。隨著甲酸濃度增加， 磷酸化肽的保留減弱；隨著鹽濃度增加， 磷酸化肽保留變小。采用優(yōu)化后的流動相， 建立以20% ACN/20 mmol/L NH4Ac作為上樣溶液， 20% ACN/0.1% FA和50% ACN/100 mmol/L NH4Ac/2% FA分別作為洗脫液分段洗脫單、多磷酸化肽的方法。以α.Casein和人血清白蛋白（HSA）酶解液的混合溶液（1∶20， n/n）作為模擬樣品， 實現(xiàn)了單、多磷酸化肽的同時富集和分段洗脫， 分別檢測到4條單磷酸化肽和14條多磷酸化肽的信號。將本方法用于牛奶中的磷酸化肽檢測， 共鑒定到4條單磷酸化肽和8條多磷酸化肽信號。結(jié)果表明， 本富集方法選擇性高， 有良好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 磷酸化肽； 反相/強(qiáng)陰離子交換材料； 富集

1 引 言

磷酸化修飾是重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式。蛋白質(zhì)的磷酸化能夠調(diào)控細(xì)胞的增殖、發(fā)育、分化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等重要的生命進(jìn)程[1]， 具有重要的生物學(xué)意義。然而， 在通常的質(zhì)譜分析中， 磷酸化肽的信號會被其它高豐度的非磷酸化肽所抑制， 導(dǎo)致磷酸化肽難以分離鑒定[2，3]。因此有必要選擇性地富集磷酸化肽[4]。目前， 富集磷酸化肽的材料主要有固定金屬螯合色譜（IMAC）材料[5～7]、氧化鈦（TiO2）[8～10]、離子交換色譜（IXC）材料[11]、親水作用色譜材料[12]等。強(qiáng)陰離子交換色譜（SAX）在磷酸化肽選擇性富集中效果顯著。然而， SAX在富集磷酸化肽時， 帶有相同電荷的肽會被同時洗脫；另外， 單磷酸化肽信號會抑制多磷酸化肽的信號。因此， 發(fā)展能兼顧單、多磷酸化肽選擇性富集的材料非常重要。

反相/強(qiáng)陰離子交換材料（C 18/SAX）是一種能夠同時提供疏水和強(qiáng)陰離子交換作用的新型色譜材料， 采用極性共聚的合成方法將十八烷基鍵合相和季銨堿按照一定可調(diào)控比例鍵合到硅膠表面[13]。研究表明， 此材料對于極性不強(qiáng)的陰離子小分子（例如馬兜鈴酸）具有較強(qiáng)的保留[13]， 但尚未有用于磷酸化肽的選擇性富集的報道。就結(jié)構(gòu)特點而言， 磷酸化肽在一定pH條件下也以陰離子形式存在， 但其分子量相對較大， 在C 18/SAX上的保留機(jī)制應(yīng)該與小分子有一定差異， 因此有必要考察C 18/SAX對磷酸化肽的富集效果以及保留機(jī)制。

本研究以標(biāo)準(zhǔn)蛋白α.Casein酶解物作為模擬樣品， 考察不同流動相條件（乙腈含量、甲酸濃度、緩沖鹽濃度）對磷酸化肽在C 18/SAX材料上的富集選擇性差異， 優(yōu)化了分離富集條件。在此基礎(chǔ)上， 對牛奶中的磷酸化肽進(jìn)行富集和分析， 效果良好。本方法有望用于實際樣品中磷酸化肽選擇性富集。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

肽的分析在Nano.LC.ESI.Q.TOF/MS儀器（英國Waters MS Technologies公司）上進(jìn)行， 離子模式為正離子模式， 噴霧電壓為2.0 kV。一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集范圍為m/z 500～2000， 二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集范圍為m/z 100～2000， 二級質(zhì)譜的碰撞能為20～40 eV。

乙腈（ACN， 質(zhì)譜純， 德國Merck公司）； 甲酸（FA， 色譜純， 美國Acros公司）； 醋酸銨（NH4Ac， 美國Tedia公司）； NH4HCO 3、二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）， α.酪蛋白（Casein）、人血清白蛋白（HSA）、尿素（美國Sigma.Aldrich公司）； 質(zhì)譜序列級胰蛋白酶（美國Promega公司）； GELoader小柱（德國Eppendorf 公司）。C 18/SAX材料為實驗室自制[12]；ZipTip C 18色譜柱（美國Millipore公司）。實驗用水為超純水（美國Millipore純水系統(tǒng)）；脫脂牛奶購自本地超市。

2.2 蛋白質(zhì)的酶解

α.Casein的酶解：1.0 mg α.Casein溶于1 mL NH4HCO 3 （50 mmol/L， pH 8.0）溶液中， 按照α.Casein/胰蛋白酶=40∶1（m/m）的比例加入胰蛋白酶， 37℃下酶解反應(yīng)18 h后， 加入0.5%甲酸終止反應(yīng)。酶解液最終蛋白濃度為1 mg/mL， 在

20℃保存， 待測。

HSA的酶解：將1.0 mg HSA溶于100 μL含8 mol/L 尿素的50 mmol/L NH4HCO 3， 56℃變性10 min。 加入20 μL 100 mmol/L DTT， 于56℃反應(yīng)1 h。冷卻至室溫后， 加入20 μL 200 mmol/L IAA， 在暗處反應(yīng) 30 min。用 50 mmol/L NH4HCO 3稀釋至1 mL后， 按照蛋白質(zhì)/酶=50∶1（m/m）的比例加入胰蛋白質(zhì)酶， 37℃酶解12 h后， 加入5 μL甲酸中止反應(yīng)， 酶解產(chǎn)物于

20℃保存。

脫脂牛奶的酶解： 用Bradford assay法測得脫脂牛奶中蛋白質(zhì)濃度為20 mg/mL， 用50 mmol/L NH4HCO 3稀釋至2 mg/mL， 取100 μL上述溶液按照HSA的酶解方法進(jìn)行處理， 但是酶解時間延長為16 h。

2.3 磷酸化肽富集條件

按照文獻(xiàn)[14]的方法制備GELoader小柱， 每個GELoader小柱裝填有1.5 mg C 18/SAX材料， 用于富集磷酸化肽。條件優(yōu)化實驗：α.Casein酶解液86 pmol上樣后， 分別用0.1% FA 溶液， 10%、20%、30%和40% ACN/0.1% FA 溶液各20 μL進(jìn)行洗脫， 考察流動相中乙腈濃度對富集選擇性的影響；α.Casein 酶解液上樣后， 依次用50% ACN/0.1% FA （pH 4）、0.5% FA （pH 3）、1% FA （pH 2）、2% FA（pH 1）溶液各20 μL進(jìn)行洗脫， 考察流動相甲酸濃度對富集選擇性的影響；α.Casein酶解液上樣后， 依次用50% ACN/10 mmol/L NH4Ac、20 mmol/L NH4Ac、50 mmol/L NH4Ac、100 mmol/L NH4Ac、200 mmol/L NH4Ac溶液20 μL進(jìn)行洗脫， 考察流動相中醋酸銨濃度對富集選擇性的影響。優(yōu)化實驗中各個洗脫液， 離心、濃縮干燥后， 用50% ACN/0.1% FA溶液（10 μL）復(fù)溶， ZipTip C 18脫鹽， 取5 μL進(jìn)行質(zhì)譜分析。

在優(yōu)化的條件下， 進(jìn)行α.Casein/HSA=1∶20 （n/n）模擬樣品以及脫脂牛奶的磷酸化肽富集。將α.Casein與HSA酶解液以摩爾比為1∶20進(jìn)行混合， 上樣量按混合液中α.Casein為86 pmol計。取6 μL牛奶酶解液與20 μL上樣溶液混合作為脫脂牛奶的樣品溶液。富集后， 收集洗脫液， 離心、濃縮干燥后， 用50% ACN/0.1% FA（10 μL）復(fù)溶， ZipTip C 18脫鹽， 取5 μL進(jìn)行質(zhì)譜分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 乙腈濃度對磷酸化肽富集選擇性的影響

考察了流動相中乙腈濃度對磷酸化肽富集選擇性的影響。實驗結(jié)果如圖1所示， 10% ACN/0.1%FA洗脫餾分中能夠檢測出5條磷酸化肽的信號， 分別是m/z 770.29 （2+）， m/z 797.83 （2+）， m/z 831.37 （2+）， m/z 907.26 （3+）， m/z 912.53 （3+）， 參考文獻(xiàn)[8，14]并根據(jù)二級質(zhì)譜結(jié)果確定磷酸化肽的結(jié)構(gòu)信息（表1）。在20% ACN/0.1%FA洗脫餾分中檢測出9條磷酸化肽信號， 分別為m/z 733.80（2+）， m/z 770.29（2+）， m/z 797.84 （2+）， m/z 830.88 （2+）， m/z 889.44 （3+）， m/z 971.47 （2+）， m/z 976.45 （2+）， m/z 979.55 （3+）， m/z 991.53 （2+）， 均帶有1～3個PO3

4。在高有機(jī)相濃度40% ACN/0.1%FA洗脫液中檢測出5條磷酸化肽信號， 即m/z 706.69 （2+）， m/z 865.32 （3+）， m/z 924.32 （2+）， m/z 979.36 （3+）， m/z 1339.48 （2+）， 均帶有2～5個PO3

4。值得注意的是， 通常情況下， 由于多磷酸化肽極性較強(qiáng)， 其在反相色譜材料上保留弱于單磷酸化肽。而在本研究中， 多磷酸化肽保留強(qiáng)于單磷酸化肽。這可能是磷酸化肽在C 18/SAX材料上的保留是疏水作用和離子交換作用的協(xié)同結(jié)果。20% ACN/0.1% FA洗脫餾分中少有多磷酸化肽信號出現(xiàn)， 這可能是因為溶液pH=2.5～3.0， 材料表面基團(tuán)帶有正電， 多磷酸化肽pKa值小于流動相pH值， 帶有負(fù)電， 此時磷酸化肽的保留主要取決于陰離子交換作用， 而單磷酸化肽pKa值大于流動相pH值， 不帶電性或帶正電， 此時保留主要取決于疏水作用。上述結(jié)果表明， 通過改變流動相中乙腈濃度能夠?qū)崿F(xiàn)單、多磷酸化肽順序洗脫， 磷酸化肽的保留受到疏水和離子交換作用力的雙重調(diào)控。然而僅通過改變流動相中乙腈濃度進(jìn)行選擇性富集， 存在非磷酸化肽的信號干擾較強(qiáng)、磷酸化肽富集選擇性不高的問題。

3.2 甲酸濃度對磷酸化肽在C 18/SAX材料上保留的影響

考察了流動相中甲酸濃度（pH值）對磷酸化肽在C 18/SAX材料上保留的影響（圖2）。在保持乙腈濃度（50% ACN）不變的條件下（此濃度能夠洗脫出大多數(shù)肽）， 考察了流動相中甲酸濃度（0.1%， 0.5%， 1%， 2% FA）對磷酸化肽在C 18/SAX 上保留的影響。當(dāng)甲酸的濃度為0.1% （pH 4）時， 以單磷酸化肽為主的信號出現(xiàn)， 如m/z 733.79 （2+）， m/z 770.30 （2+）， m/z 797.83 （2+）， m/z 830.43 （2+）， m/z 924.34 （2+）， m/z 964.31 （2+）， m/z 976.43 （2+）， m/z 1029.45 （2+）。當(dāng)甲酸濃度增加到0.5% （pH 3）時， 多磷酸化肽得以洗脫， 如m/z 1339.98 （2+）， m/z 1002.26 （2+）， m/z 983.29 （2+）， m/z 964.31 （2+）， m/z 893.65 （3+）。當(dāng)甲酸濃度增加到2% （pH=1）時， 仍然有多磷酸化肽信號出現(xiàn)， 如m/z 964.36 （2+）， m/z 1312.43 （2+）， 但信號強(qiáng)度很低。上述結(jié)果表明， 采用C 18/SAX富集α.Casein中的磷酸化肽， 隨著溶液中甲酸的濃度逐漸提高（pH值逐漸降低）， 磷酸化肽保留減弱；上樣和洗脫溶液中的甲酸濃度分別為0.1%和2%為宜。通過調(diào)節(jié)流動相pH值能夠?qū)崿F(xiàn)單、多磷酸化肽的分段洗脫， 是因為單磷酸化肽的pKa值大于多磷酸化肽的pKa值；當(dāng)流動相pH值小于磷酸化肽pKa時， 磷酸化肽不電離， 與SAX材料的離子交換作用減弱， 從而得以洗脫。

3.3 鹽濃度對磷酸化肽在C 18/SAX材料上保留的影響

保持流動相中乙腈濃度（50% ACN）不變， 考察了流動相中醋酸銨濃度對磷酸化肽在C 18/SAX上保留的影響（圖3）。采用50% ACN/10 mmol/L NH4Ac為流動相時， 洗脫液中主要出現(xiàn)帶1～2個PO3

4的磷酸化肽， 如m/z 651.63 （3+）， m/z 733.78 （2+）， m/z 797.82 （2+）， m/z 830.87 （2+）， m/z 841.86 （2+）， m/z 865.30 （3+）， m/z 971.53 （2+）， m/z 976.94 （2+）。 隨著流動相中NH4Ac增加到50 mmol/L， 這些磷酸化肽仍然能夠洗脫出來。而當(dāng)流動相中鹽濃度提高到100 mmol/L NH4Ac時， 帶有3～5個PO3

4的多磷酸化肽得以洗脫， 如m/z 893.65（3+）， m/z 916.90 （2+）， m/z 924.3294 （2+）， m/z 964.31 （2+）， m/z 983.28 （2+）， m/z 1002.26 （2+）， m/z 1339.95 （2+）， m/z 1373.91 （2+）。這是因為在離子交換作用下，多磷酸化肽比單磷酸化肽在C 18/SAX上的保留更強(qiáng)， 提高流動相鹽濃度能夠減弱PO3

4與C 18/SAX材料的離子交換作用。上述結(jié)果表明， 鹽濃度的逐漸增高能夠?qū)崿F(xiàn)單、多磷酸化肽分段洗脫， 溶液中鹽濃度提高到100 mmol/L NH4Ac時，大多數(shù)多磷酸化肽能夠被洗脫。

3.4 C 18/SAX材料的富集選擇性

將α.Casein酶解液.HSA酶解液（1∶20， n/n）配制的混合樣品溶液作為模擬樣品， 以20% ACN/0.1% FA和50% ACN/2% FA/100 mmol/L NH4Ac分別作為兩步洗脫條件， 分段洗脫單磷酸化肽和多磷酸化肽， 結(jié)果如圖4所示， 單、多磷酸化肽得到分段洗脫， 其中單磷酸化肽主要出現(xiàn)在20% ACN/0.1% FA餾分中， 共檢測到4條單磷酸化肽信號， 如m/z 797.86 （2+）， m/z 830.89 （2+）， m/z 924.69 （2+）， m/z 976.99 （2+）；而多磷酸化肽主要出現(xiàn)在50% ACN/2% FA/100 mmol/L NH4Ac餾分中， 共檢測到14條多磷酸化肽信號。與文獻(xiàn)[14]的結(jié)果相比， 大量非磷酸化肽去除， 磷酸化肽信號強(qiáng)度顯著提高；在優(yōu)化條件下， 單、多磷酸化肽在C 18/SAX材料上能夠被同時富集并分段洗脫， 此結(jié)果未見文獻(xiàn)報道。上述結(jié)果表明， 采用優(yōu)化后的分離條件， 對模擬樣品的磷酸化肽富集效果較好。

3.5 牛奶中磷酸化肽的富集

將牛奶樣品進(jìn)行酶解， 然后采用C 18/SAX進(jìn)行富集和洗脫， 并用納升電噴霧.四級桿.飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行分析。從圖5可見， 20% ACN/0.1% FA餾分中出現(xiàn)了4條單磷酸化肽信號， 包括m/z 733.81（2+）， m/z 797.86 （2+）， m/z 831.39 （2+）， m/z 976.98 （2+）。50% ACN/2% FA/100 mmol/L NH4Ac餾分中出現(xiàn)了8條多磷酸化肽信號， 包括m/z 915.96 （3+）， m/z 928.95 （3+）， m/z 964.34 （2+）， m/z 983.33 （2+）， m/z 1002.30 （2+）， m/z 1333.47 （2+）， m/z 1339.51 （2+）， m/z 1373.43 （2+）。從牛奶中鑒定出的多磷酸化肽數(shù)目高于文獻(xiàn)[5]的結(jié)果， 表明所建立方法具有較強(qiáng)的實際應(yīng)用價值。

4 結(jié) 論

本研究將新型分離材料C 18/SAX用于磷酸化肽的選擇性富集， 以α.Casein酶解液作為分析樣品， 系統(tǒng)考察流動相組成條件對富集選擇性的影響。結(jié)果表明， 磷酸化肽在C 18/SAX上的保留受疏水作用和離子交換作用的共同影響。在此基礎(chǔ)上，建立了單、多磷酸化肽的同時富集和分段洗脫方法， 其中20% ACN/0.1% FA洗脫餾分中主要為單磷酸化肽， 50% ACN/2% FA/100 mmol/L NH4Ac洗脫餾分主要為多磷酸化肽。采用本方法可從α.Casein酶解液和HSA混合液（1∶20， n/n）中分離檢測到4條單磷酸化肽信號和14條多磷酸化肽的信號， 從牛奶中共檢測到4條單磷酸化肽和8條多磷酸化肽信號。本研究結(jié)果表明， 本方法具有較強(qiáng)的實際應(yīng)用價值 。

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Abstract Selective enrichment before mass spectrometric analysis is very important for detection and identification of phosphopeptides. In this work， a novel method based on the reversed phase/strong anion exchange material （C 18/SAX） was established and applied in phosphopeptide enrichment. The influence of mobile phase composition （acetonitrile content， formic acid content， salt concentration） on the phosphopeptide enrichment selectivity was carried out by taking α.casein digests as model sample. It was found that the retention of phosphopeptides on C 18/SAX was ascribed to both the hydrophobic and strong anion exchange interactions. Mono.phosphopeptides were eluted earlier than multi.phosphopeptides. The retention of phosphopeptides on C 18/SAX was reduced along with the increase of formic acid content and the increase of salt content. After optimization， an enrichment method was developed with 20% ACN/20 mmol/L NH4Ac as loading buffer， 20% ACN/0.1% FA and 50% ACN/100 mmol/L NH4Ac/2% FA as two steps elution phase to fractionate mono.and multi.phosphopeptides. By using the developed method， 4 mono.phosphopeptides and 14 multi.phosphopeptides were isolated from the mixture of α.Casein and HSA at a molar ratio of 1∶20. The application of the developed method to bovine milk digests resulted in the separation and identification of 4 mono.phosphopeptide and 8 multi.phosphopeptides. These results indicated that the methods had great potential for practical application.

Keywords Phosphopeptides； Reversed phase/strong anion exchange material； Enrichment