張茜+王宋蒙+褚立強(qiáng)

摘 要 利用寡聚腺嘌呤序列（OAS）與金的強(qiáng)相互作用，在金納米粒子（AuNPs）上固定不同密度DNA探針（DNA probe），詳細(xì)探究不同條件 （OAS長(zhǎng)度、AuNPs粒徑、NaCl濃度等） 下單鏈DNA probe的固定效果，以及制備的納米探針（Au.probe）與互補(bǔ)DNA目標(biāo)分子（DNA target）的雜交性能。利用透射電子顯微鏡（TEM）、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV.Vis）、激光粒度儀等對(duì)制備的AuNPs的形貌、粒徑、表面DNA probe固定及雜交性能等進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，隨OAS堿基數(shù)量由10增加到30和50，Au.probe上固定的DNA probe數(shù)量降低。對(duì)粒徑為10.2和24.3 nm 的AuNPs，雜交效果最佳的NaCl濃度分別為300和25 mmol/L。隨著AuNPs粒徑增大，AuNPs單位面積上的DNA probe固定量及DNA target雜交量均呈下降趨勢(shì)。

關(guān)鍵詞 寡聚腺嘌呤序列； 金納米粒子； DNA固定； DNA檢測(cè)； 雜交性能

1 引 言

生物納米分析技術(shù)是涵蓋化學(xué)、物理學(xué)、生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等多學(xué)科技術(shù)的新興技術(shù)。DNA和金納米粒子（AuNPs）具有諸多獨(dú)特、優(yōu)良的分析特性，二者復(fù)合而成的新型納米材料被廣泛應(yīng)用于微納結(jié)構(gòu)構(gòu)建[1～3]、基因治療[4～6]、生物傳感[7～9]等領(lǐng)域。

DNA在AuNPs上的固定主要基于共價(jià)作用，包括AuS鍵[9～11]、AuN鍵[12]及AuC鍵[13]等。最常見(jiàn)的方法是利用AuS相互作用將含巰基的單鏈DNA固定到AuNPs表面，可通過(guò)DNA與小分子硫醇混合自組裝，或后期利用小分子硫醇的取代反應(yīng)，控制AuNPs表面DNA密度。但對(duì)AuNPs上固定的DNA密度的精確調(diào)控依然是研究的難點(diǎn)[14]。

最近研究表明，寡聚腺嘌呤序列（Oligo adenine sequence， OAS）可與Au表面優(yōu)先吸附，親和力與AuS鍵相當(dāng)。Opdahl等[15～17]發(fā)現(xiàn)，可通過(guò)控制OAS長(zhǎng)度精確控制單鏈DNA在Au基底上的接枝密度與構(gòu)型，并系統(tǒng)研究了OAS與Au基底相互作用，以及DNA表面相互作用對(duì)其雜交穩(wěn)定性的影響。Pei等[18]及Nourisaeid等[19]在比色法檢測(cè)DNA研究中，實(shí)現(xiàn)了不經(jīng)修飾、雙嵌段DNA制備的AuNPs探針間的快速雜交。Jiang等[20]利用該方法，設(shè)計(jì)了一種基于RNA適配體的AuNPs傳感器檢測(cè)血液中的茶堿。Zhu等[21，22]利用OAS構(gòu)建了以核.衛(wèi)星結(jié)構(gòu)的金/銀硅基納米雜化增強(qiáng)的SERS生物傳感器，并用于Hg2+及Pb2+的高靈敏、特異性檢測(cè)。與利用AuS相互作用相比，這種方法操作更簡(jiǎn)單，可控性更好，可以更方便控制DNA密度。這些研究均采用13 nm左右AuNPs，對(duì)不同尺寸AuNPs上含OAS單鏈DNA的固定及雜交行為的研究目前未見(jiàn)報(bào)道。

本研究考察了含OAS的單鏈DNA探針（DNA probe）在不同尺寸AuNPs上的固定及雜交行為。通過(guò)種子生長(zhǎng)法制備了一系列不同粒徑、分散性良好的AuNPs，利用OAS.Au間的相互作用制備了納米探針（Au.probe）。利用透射電子顯微鏡（TEM）、紫外.可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV.Vis）、激光粒度儀等對(duì)Au.probe進(jìn)行了表征，并系統(tǒng)研究了不同離子強(qiáng)度、OAS長(zhǎng)度及不同AuNPs粒徑下，DNA probe的固定及雜交行為，為其在生物傳感、基因診斷等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

UV.2550型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津有限公司）；HT7700透射電鏡（日立儀器有限公司）；ZS90激光粒度分析儀（英國(guó)馬爾文儀器有限公司）；XYF2.20.H超純水機(jī)（北京湘順源科技有限公司）；THZ.100B恒溫培養(yǎng)搖床（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

氯金酸（HAuCl4·4H 2O，天津市金鉑蘭精細(xì)化工有限公司）；含OAS單鏈DNA（上海生工生物工程有限公司，序列見(jiàn)表1）；檸檬酸鈉（C 6H 5Na 3O 7·2H 2O）、NaH 2PO4、Na 2HPO4、NaCl（阿拉丁試劑）；所用實(shí)驗(yàn)試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水（電阻率18.25 MΩ·cm）。

2.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

2.2.1 AuNPs制備 參照文獻(xiàn)[23＼]的方法，在三口燒瓶中加入150 mL 2.2 mmol/L檸檬酸鈉溶液，快速攪拌，加熱至沸騰。加入1 mL 25 mmol/L氯金酸溶液，煮沸10 min后，取30.2 mL，記為G0。將溫度降至90 ℃并恒溫，加入1.6 mL 25 mmol/L氯金酸和1.6 mL 60 mmol/L檸檬酸鈉溶液，每隔30 min重復(fù)加入適量試劑并取出適量AuNPs樣品（即不同代數(shù)的AuNPs，記為G1、G2……G8），在冰水混合物中降溫后，利用UV.Vis、TEM和激光粒度儀進(jìn)行表征。

2.2.2 Au.probe的制備 將330 μL AuNPs與過(guò)量DNA probe溶液混合， 置于恒溫?fù)u床，在35℃以120 r/min孵育16 h； 加入相應(yīng)體積超純水、PB緩沖液，恒溫孵育1 h；再加入2 mol/L NaCl溶液，以調(diào)節(jié)最終NaCl濃度，恒溫孵育10 h，并用UV.Vis進(jìn)行表征。

2.2.3 Au.probe與DNA target的雜交 將DNA target按與Au.probe上DNA probe完全雜交的量，加入樣品中，室溫振蕩孵育1 h，用UV.Vis進(jìn)行表征。以DNA probe吸附前后吸收峰位置之差表征DNA probe吸附量變化；以DNA target雜交前后吸收峰位置之差表征DNA target雜交量變化[24，25]。

3 結(jié)果與討論

3.1 AuNPs的制備

以種子生長(zhǎng)法合成不同粒徑AuNPs，其吸收光譜見(jiàn)圖1。AuNPs種子（G0）最大吸收峰出現(xiàn)在518.5 nm處，峰型尖銳。隨代次增加，最大吸收峰發(fā)生紅移，峰形差別不大，說(shuō)明其合成是按步增長(zhǎng)，且不同代數(shù)的樣品尺寸均勻。

TEM（圖2）及激光粒度分析儀表征結(jié)果（表2）表明，AuNPs呈良好球狀結(jié)構(gòu)，分布均勻。隨代次增加，粒徑逐步增大。 Zeta電位測(cè)試表明， 其表面負(fù)電荷絕對(duì)值均達(dá)30 mV以上，穩(wěn)定性好。

3.2 DNA probe的固定

圖3為實(shí)驗(yàn)過(guò)程示意圖，將含不同OAS長(zhǎng)度的DNA probe固定到AuNPs上，形成Au.probe，再加入DNA target進(jìn)行雜交。由于OAS與Au之間的強(qiáng)相互作用，DNA probe被直接吸附到AuNPs表面，通過(guò)裸眼觀察即可初步判斷Au.probe是否制備成功（圖4）。對(duì)單純AuNPs， 加入300 mmol/L NaCl后，溶液立即變?yōu)樗{(lán)灰色，UV.Vis圖譜吸收峰變寬，出現(xiàn)大范圍紅移，即AuNPs發(fā)生團(tuán)聚。而對(duì)Au.probe， 由于AuNPs表面固定了DNA probe，表面電荷密度增加，對(duì)AuNPs起到保護(hù)作用，加入300 mmol/L NaCl后，溶液穩(wěn)定，仍呈粉紅色。

文獻(xiàn)[26＼]表明，可通過(guò)鹽老化方法（即在一定濃度NaCl溶液中）增加Au.probe表面固定的DNA probe的密度，但不同粒徑AuNPs所需NaCl濃度不同。由圖5a可見(jiàn)，對(duì)于10.2 nm AuNPs，隨NaCl濃度增加，最大吸收峰位置發(fā)生紅移，300 mmol/L NaCl時(shí)差值達(dá)最大，雜交效果最佳。造成這種現(xiàn)象有兩種可能的原因：一是加入NaCl導(dǎo)致溶液整體折光系數(shù)的變化。分別使用不含NaCl和含500 mmol/L NaCl的緩沖液作參比，對(duì)同一Au.probe樣品進(jìn)行測(cè)試，兩者UV.Vis譜圖基本一致，說(shuō)明此因素不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其次，NaCl 起到靜電屏蔽作用，減小了DNA probe間的靜電排斥。隨NaCl濃度從25 mmol/L開(kāi)始增加，靜電屏蔽作用增大，使DNA probe固定量增加，表面密度升高，Au.probe與DNA target雜交機(jī)會(huì)更大。同時(shí)，由于靜電排斥的降低，DNA target更易與DNA probe雜交。但當(dāng)NaCl濃度超過(guò)300 mmol/L，DNA probe表面密度過(guò)大，會(huì)形成空間位阻，導(dǎo)致雜交量下降。

24.3 nm AuNPs （圖5b）的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與10.2 nm基本一致，但最佳NaCl濃度為25 mmol/L。對(duì)大粒徑AuNPs，需更高的表面電荷密度來(lái)保持穩(wěn)定。但相同條件下，大粒徑AuNPs制備的Au.probe上DNA probe固定量更少（見(jiàn)3.5節(jié)）。NaCl濃度較高時(shí)，DNA probe上的負(fù)電荷不足以保持Au.probe穩(wěn)定而發(fā)生團(tuán)聚。粒徑越大，對(duì)NaCl濃度升高越敏感。因此，大粒徑樣品所需NaCl濃度通常較低。10.2 nm AuNPs制備的Au.probe，NaCl濃度為500 mmol/L仍可穩(wěn)定存在；但24.3 nm AuNPs制備的Au.probe，NaCl濃度超過(guò)100 mmol/L即會(huì)聚集。

3.4 OAS長(zhǎng)度的影響

通過(guò)改變OAS堿基數(shù)，可以調(diào)控Au.probe表面DNA probe密度，并在納米尺度上精確控制AuNPs表面DNA probe分子間距離。如圖6所示，隨OAS堿基數(shù)增長(zhǎng)，其吸收峰藍(lán)移，且與DNA target雜交量上升，表明隨OAS鏈長(zhǎng)度增加，Au.probe表面DNA probe量減少，密度降低，證明利用本方法可容易地實(shí)現(xiàn)對(duì)Au.probe 表面DNA probe密度的控制。同時(shí)，DNA probe間距離增大，使得其與DNA target的靜電排斥及空間位阻降低，雜交更易進(jìn)行，DNA target雜交量上升。

3.5 AuNPs粒徑的影響

如圖7所示，隨AuNPs粒徑增大，Au.probe上DNA probe量出現(xiàn)明顯下降，DNA target雜交量則先下降然后基本保持不變。由于大粒徑AuNPs表面積更大，因而隨粒徑增大，單位面積上的DNA probe固定量及DNA target雜交量均降低。

Au.probe表面DNA probe固定量及DNA target雜交量是由OAS與Au的吸附作用，以及DNA鏈間靜電排斥和空間位阻共同作用的結(jié)果。小粒徑AuNPs曲率更高，對(duì)相同長(zhǎng)度OAS，Au.probe表面DNA probe間距離更大，靜電排斥及空間位阻更小[27]，DNA probe更易吸附到AuNPs表面，雜交也更易進(jìn)行。因此，隨AuNPs粒徑增大，其單位面積上DNA probe固定量及DNA target雜交量均降低。

4 結(jié) 論

利用OAS.Au相互作用在AuNPs上固定單鏈DNA分子，系統(tǒng)研究了溶液NaCl濃度、OAS長(zhǎng)度及AuNPs粒徑對(duì)DNA probe固定及其與DNA target雜交性能的影響。結(jié)果表明，對(duì)10.2和24.3 nm AuNPs，雜交效果最佳的NaCl濃度分別為300和25 mmol/L。隨著OAS堿基數(shù)量從10增加到30和50，Au.probe的DNA probe固定量降低。隨粒徑增大，AuNPs單位面積上DNA probe固定量及DNA target雜交量均降低。因此，DNA間靜電排斥、位阻效應(yīng)及溶液離子的靜電屏蔽作用等均會(huì)影響Au.probe上DNA probe固定量及其與DNA target的雜交性能。本研究為AuNPs探針在生物傳感、基因診斷、納米材料構(gòu)建等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了參考依據(jù)。

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Abstract Oligo.adenine sequence （OAS） containing DNA probes （DNA probe） was immobilized on gold nanoparticles （AuNPs） with various surface densities via the strong interaction between OAS sequence and gold surface， and the influences of different conditions （e.g.， length of OAS， size of AuNPs， concentration of NaCl， etc.） on the immobilization of DNA probe and hybridization performance of the resulting nanoparticle probe （Au.probe） were investigated. Transmission electron microscopy （TEM）， ultraviolet.visible absorption spectroscopy （UV.Vis） and nanoparticle size analyzer were utilized to characterize the morphology and size of AuNPs and Au.probe， as well as the DNA probe immobilization on AuNPs surface and their hybridization with DNA target（DNA target）. The results showed that， when the number of adenine in an OAS sequence increased from 10， to 30 and 50， the amount of the immobilized DNA probe decreased as expected. The optimal NaCl concentrations for the hybridization were 300 mmol/L for 10.2.nm AuNPs， and 25 mmol/L for 24.3.nm AuNPs， respectively. With increasing size of AuNPs， the amount of both immobilized DNA probe and hybridized DNA target decreased.

Keywords Oligo.adenine sequence ； Gold nanoparticles； Deoxyribonucleic acid immobilization； Deoxyribonucleic acid detection； Hybridization performance