王瑜+任舒悅+姜會聰+白家磊+彭媛+寧保安+高志賢

摘 要 采用溶劑熱法合成上轉(zhuǎn)換納米顆粒（UCNPs）.NaYF4∶Yb，Er，進行表面功能化修飾， 將其與己烯雌酚（DES）單克隆抗體偶聯(lián)， 制備熒光探針，以牛血清白蛋白.己烯雌酚（BSA.DES）偶聯(lián)物和羊抗鼠二抗分別噴涂硝酸纖維膜，形成試紙條檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線），建立了上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫層析試紙條快速定量檢測DES的方法。實驗結(jié)果表明，此試紙條定量檢測DES線性范圍為25～10000 ng/mL（y=0.43927x-0.57647，R2=0.996）， 檢出限為20.84 ng/mL，單個樣品檢測時間為15 min，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于10%，特異性識別能力強， 在37℃存放下7天檢測值RSD的平均值約為15%。加標(biāo)回收實驗顯示平均回收率為90.1%～115.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，與高效液相色譜法有較好的一致性。

關(guān)鍵詞 上轉(zhuǎn)換納米顆粒； 免疫層析試紙條； 己烯雌酚； 定量檢測

1 引 言

己烯雌酚（Dethylstilbestrol， DES）作為一種人工合成的雌激素藥物，廣泛應(yīng)用于婦科病的預(yù)防和治療[1]， 同時它還具有促進動物生長和提高飼料轉(zhuǎn)化率等作用[2]。DES可通過食物鏈進入人體，導(dǎo)致激素分泌異常、甚至乳腺癌和胚胎畸形等嚴重后果，因此許多國家已明令禁止將DES用于動物養(yǎng)殖[3]。我國國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的DES檢測方法為液相色譜.串聯(lián)質(zhì)譜法[4]，目前用于 DES檢測的方法主要有酶聯(lián)免疫分析法[5]、高效液相色譜法[6]、液相色譜.質(zhì)譜聯(lián)用法[7]、電化學(xué)法[8]、放射免疫法[9]等。以上方法準(zhǔn)確靈敏，但存在過程復(fù)雜、操作繁瑣以及攜帶不便等缺點。因此，建立簡單、靈敏、快速的檢測方法十分必要。

近年來，基于熒光標(biāo)記的免疫層析技術(shù)得到廣泛關(guān)注，量子點（Quantum dots， QDs）為免疫層析技術(shù)的常用的熒光標(biāo)記物[10]。 Beloglazova等[11]將QDs作為免疫探針， 建立了檢測玉米赤霉烯酮的免疫層析方法， 且靈敏度良好。段宏等[12]利用量子點熒光微球為探針，制備免疫層析試紙條定量檢測惡性瘧原蟲。稀土摻雜上轉(zhuǎn)換納米顆粒（UCNPs）是一種新型材料，其上轉(zhuǎn)換發(fā)光機制源于稀土離子在紅外光激發(fā)下，可以轉(zhuǎn)化為高能量可見光[13]。NaYF4∶Yb， Er為雙摻的上轉(zhuǎn)換稀土化合物，量子產(chǎn)率高，熒光穩(wěn)定性好[14]。與QDs相比，UCNPs具有穩(wěn)定性好、亮度高、干擾背景幾乎為零、不易光解和光漂白等優(yōu)點[15]。目前， 上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫層析技術(shù)的研究逐漸受到關(guān)注，於然等[16]將修飾羧基的上轉(zhuǎn)換顆粒用于免疫層析試紙， 檢測脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，但抗體標(biāo)記較復(fù)雜，檢測范圍窄。本研究以修飾醛基的UCNPs為載體，將DES單抗直接標(biāo)記在顆粒表面，制備出新型的熒光探針，建立了上轉(zhuǎn)換免疫層析試紙條快速定量檢測DES的新方法。方法檢測范圍寬，操作簡單，適用于大量樣品現(xiàn)場檢測。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

JEM.100CXII透射電子顯微鏡（日本電子株式會社）；FTS6000傅里葉紅外光譜儀（美國Bio.Rad公司）； LGJ.10D型冷凍干燥機（北京四環(huán)科學(xué)儀器廠）； HM3010單維往復(fù)劃膜儀（上海金標(biāo)公司）； ZQ2000微電腦自動斬切機（上海金標(biāo)公司）； 硝酸纖維素膜（NC膜）、加樣墊、結(jié)合墊、吸水墊、PVC底板及UPT.3A便攜式上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫分析儀，均由北京熱景生物技術(shù)有限公司提供。

氯化釔（YCl3·6H2O）、氯化鐿（YbCl3·6H2O）、氯化鉺（ErCl3·6H2O）、十八烯（C 18H 36）購于山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；四乙氧基硅烷（TEOS）、3.氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），牛血清白蛋白（BSA）購于上海Sigma公司；己烯雌酚（DES）、雌二醇（E2）、己烷雌酚（HEX）、雙烯雌酚（DIEN）、雙酚A（BPA）購于北京百靈威公司；己烯雌酚單克隆抗體（DES.ab）、己烯雌酚抗原（DES.BSA）本實驗室制備； 羊抗鼠抗體（北京索萊寶公司）； 實驗用水為超純水（18.2 MΩ cm）；其它試劑均為分析純。牛奶樣品購于當(dāng)?shù)爻小?/p>

2.2 上轉(zhuǎn)換納米材料NaYF4∶Yb， Er的合成與表面修飾

根據(jù)文獻[17，18＼]的方法并加以改進。稱取0.18 mmol YbCl3·6H2O，0.80 mmol YCl3·7H2O和0.02 mmol ErCl3·6H2O，加入10 mL C 18H 34O2和30 mL C 18H 36。將溶液加熱至160℃并維持30 min，形成均勻溶液，同時除去O2和水，然后冷卻至50℃。逐滴加入20 mL溶有5 mmol NaOH和8 mmol NH4F的甲醇溶液并攪拌30 min，盡快升溫至100℃除去水和甲醇。在氮氣保護下迅速加熱至320℃并維持1 h。反應(yīng)完成后，溶液自然冷卻至室溫，所得產(chǎn)物用環(huán)己烷和乙醇洗3次，烘干備用。

稱取上述UCNPs 100 mg于60 mL乙醇中，超聲分散。加入2.5 mL氨水，20 mL超純水和25 μL TEOS，40℃下攪拌反應(yīng)6 h。隨后，加入50 μL APTES，40℃繼續(xù)攪拌反應(yīng)6 h。所得產(chǎn)物用乙醇洗滌3次，干燥備用。稱取10 mg修飾氨基的UCNPs， 分散于10 mL PBS緩沖液（0.01 mol/L， pH 7.4），然后加入20 mL 2.5%的戊二醛溶液，振蕩反應(yīng)30 min，所得產(chǎn)物用PBS緩沖液洗滌兩次。

2.3 DES單抗標(biāo)記的UCNPs探針和UCNPs試紙條的制備

稱取10 mg 修飾后的UCNPs，加入2 mL超純水超聲分散。隨后，加入4.8 μL （10.5 mg/mL）的DES單克隆抗體， 室溫振蕩1 h，再加入50 μL 20%牛血清白蛋白（BSA）溶液封閉1 h。用PBS洗滌兩次后，將偶聯(lián)上抗體的UCNPs用PBS重懸，于4℃下保存待用。

上轉(zhuǎn)換發(fā)光試紙條包括加樣墊、結(jié)合墊、層析膜、吸水墊和PVC板。將標(biāo)記好抗體的UCNPs均勻滴涂在結(jié)合墊上，真空冷凍干燥。用劃膜儀將0.8 mg/mL DES.BSA和1 mg/mL羊抗鼠IgG噴涂在NC膜上，分別作為檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線），37℃干燥1 h。將加樣墊、結(jié)合墊、NC膜、吸水墊裁剪成合適大小，依次粘貼在PVC板上，用自動切條機切成4 mm寬的試紙條，干燥備用。

2.4 UCNPs試紙條的檢測流程及條件優(yōu)化

DES的檢測流程如圖1所示。將不同濃度的樣品取100 μL滴加到檢測卡加樣墊上，室溫反應(yīng)15 min后，UPT.3A免疫分析儀讀取試紙條T和C線熒光強度。當(dāng)樣品中沒有DES時，UCNPs探針經(jīng)NC膜遷移至試紙條T線區(qū)域， 未結(jié)合的UCNPs探針與DES.BSA結(jié)合，T線出現(xiàn)熒光條帶； 反之，UCNPs探針上的DES單克隆抗體與DES結(jié)合，免疫復(fù)合物經(jīng)NC膜進一步遷移至試紙條C線區(qū)域與羊抗鼠二抗結(jié)合，C線出現(xiàn)熒光條帶，T/C的值與DES濃度呈負相關(guān)。如果C線沒有產(chǎn)生熒光條帶，說明試紙條無效。

以結(jié)合墊寬度、加樣墊寬度、DES.BSA濃度、羊抗鼠二抗?jié)舛葹橐蛩?，設(shè)計四因素三水平正交試驗優(yōu)化試紙條性能，具體見表1。通過正交試驗選取陰性樣本T0/C0與陽性樣本T/C的差值最大時的條件為試紙條最佳工藝條件。采用免疫動力學(xué)分析方法確定試紙條最佳檢測時間。最優(yōu)條件下，將濃度為500 ng/mL的DES溶液加入加樣孔，每隔30 s，UPT.3A免疫分析儀讀取試紙條T/C的值，以T/C的值達到穩(wěn)定的時間為最佳檢測時間。

2.5 DES檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線

用10%甲醇溶液配制DES系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（0， 25， 50， 100， 200， 500， 800， 1000， 4000， 8000和10000 ng/mL）。UCNPs試紙條檢測，15 min后UPT.3A免疫分析儀讀取試紙條T和C線熒光強度以及T和C線熒光強度比值，每個濃度重復(fù)檢測3次。以DES濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)，陰性樣本T0/C0對數(shù)與陽性樣本T/C對數(shù)的差值為縱坐標(biāo)，繪制DES檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.6 UCNPs試紙條的性能評價

2.6.1 重復(fù)性和熱穩(wěn)定性測試 將同批和不同批次的試紙條分別檢測DES，重復(fù)3次，通過軟件計算其變異系數(shù)（CV， %），評價試紙條的批內(nèi)和批間重復(fù)性。

根據(jù)文獻[19，20＼]和實驗室前期工作，試紙條的熱穩(wěn)定性是一個重要的評價指標(biāo)。將試紙條密封存放于37℃恒溫恒濕箱，在第0， 3， 7天取出6條分別檢測DES，重復(fù)3次，觀察試紙的熱穩(wěn)定性并推測其保存期限。

2.6.2 特異性 分別配制濃度為270 ng/mL的DES， HEX， DIEN， BPA， E2標(biāo)準(zhǔn)溶液。用UCNPs試紙條檢測，重復(fù)3次，通過計算其競爭抑制率（1 - B/B0）判斷試紙條的特異性，其中B為陽性時試紙條的T/C值， B0為陰性時試紙條的T0/C0值。

2.6.3 實際樣品檢測 牛奶樣品購買于當(dāng)?shù)爻?。分別取1 mL牛奶置于離心管中，按50， 200， 800， 4000和8000 ng/mL水平添加DES標(biāo)準(zhǔn)品。每個樣品中加入等體積的乙酸乙酯萃取，小心振蕩，靜置，待樣品分層后，收集上清液，用氮氣吹干。最后，將殘留物溶解在10%甲醇溶液中進行分析。同時用高效液相色譜法[21]進行對比。

3 結(jié)果與討論

3.1 UCNPs修飾前后的表征

UCNPs修飾前后的透射電鏡圖見圖2。由圖2A可見，合成的UCNPs粒徑均一且顆粒分散性較好，粒徑約為110 nm，呈六角盤狀，厚度約為60 nm。由圖2B可見， 修飾后的UCNPs表面均勻包裹一層SiO2，厚度約為9 nm。傅里葉紅外光譜儀對修飾前后UCNPs進行表征，圖3a為油酸包覆的上轉(zhuǎn)換納米顆粒，1703.21 cm 1處為羧基CO的振動峰，2856.57 和2928.49 cm 1處為長鏈烷基中CH2的伸縮振動峰。修飾硅殼后的UCNPs如圖3b所示，在1095.56 cm 1處出現(xiàn)屬于硅氧鍵 （SiO）的對稱伸縮振動峰，說明上轉(zhuǎn)換顆粒表面包覆有SiO2，在3394.69和1633.85 cm 1處出現(xiàn)的特征吸收峰，分別屬于氨基（NH2）的伸縮振動和彎曲振動峰。證明本方法成功制備出包覆硅殼并修飾上氨基的上轉(zhuǎn)換納米顆粒。

3.2 UCNPs試紙條的優(yōu)化

結(jié)合墊寬度、加樣墊寬度、DES.BSA濃度、羊抗鼠二抗?jié)舛仁怯绊懺嚰垪l檢測靈敏度的關(guān)鍵參數(shù)。本研究通過正交試驗優(yōu)化，結(jié)果見表2：當(dāng)結(jié)合墊寬度為0.7 cm，加樣墊寬度為1.8 cm，DES.BSA濃度為0.8 mg/mL，羊抗鼠二抗?jié)舛葹? mg/mL時，陰性樣本T0/C0與陽性樣本T/C的差值最大。因此，本實驗選擇該條件為試紙條的最優(yōu)條件。

免疫動力學(xué)曲線見圖4，T線和C線熒光強度比值隨著反應(yīng)時間的延長呈現(xiàn)下降趨勢，在15 min后即趨于穩(wěn)定。此結(jié)果表明，試紙條最佳的檢測時間為加樣后15 min。

3.3 UCNPs試紙條定量檢測DES的標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

UCNPs免疫層析試紙條檢測DES的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5。結(jié)果表明，DES濃度在25～10000 ng/mL時，其對數(shù)值和陰性樣本T0/C0對數(shù)與陽性樣本T/C對數(shù)的差值呈線性關(guān)系，線性回歸方程為y=0.43927x-0.57647（R2=0.996）。檢出限按m0-3SD（m0為20次空白測試T/C的平均值，SD為20次空白測試的標(biāo)準(zhǔn)差）計算為20.84 ng/mL。

3.4 UCNPs試紙條檢測性能的評價

3.4.1 UCNPs試紙條重復(fù)性和熱穩(wěn)定性 由表3可知，UCNPs試紙條批內(nèi)和批間重復(fù)性相對較好。通過計算得出批內(nèi)RSD小于6%，批間RSD變異系數(shù)（CV）小于10%。結(jié)果表明，UCNPs試紙條重復(fù)性好。

實際應(yīng)用中，UCNPs試紙條應(yīng)存放在室溫或4℃以保持生物分子活性。一般認為，如果試紙條存放在37℃，它的檢測能力將更快受到損害。因此，將試紙條密封存放于37℃恒溫恒濕箱，分別在第0， 3， 7天取出檢測，以第0天的檢測值作為對照組。如表4所示，第3天的檢測值的RSD小于10%，而第7天的檢測值的RSD平均值約為15%，說明UCNPs試紙條熱穩(wěn)定性良好。

3.4.2 UCNPs試紙條的特異性 選取DES的結(jié)構(gòu)類似物DINE，HEX，BPA和功能類似物E2評價試紙條的特異性。由圖6可知，在濃度為270 ng/mL時，只有DES的競爭抑制率為67.7%，其結(jié)構(gòu)類似物和功能類似物的競爭抑制率均小于20%，表明UCNPs試紙條具有良好的特異性識別能力。

3.4.3 加標(biāo)樣品的檢測 UCNPs試紙條的準(zhǔn)確性以及精密度通過加標(biāo)回收實驗進行評價。從表5可知，5個加標(biāo)水平的平均回收率為90.1%～115.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于5%，表明UCNPs試紙條的精密度及準(zhǔn)確性滿足快速定量檢測DES的需求。為了進一步驗證UCNPs試紙條的可靠性，同時用高效液相色譜法測定加標(biāo)樣品中的DES，回收率為96.3%～113.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于4%。同時，兩種方法的測定結(jié)果有較好的一致性。

4 結(jié) 論

本研究建立了上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫層析法快速定量檢測DES的方法。與膠體金試紙條相比，方法不僅具有更高的靈敏度，而且可以定量分析；與高效液相色譜法相比，方法檢測時間僅需15 min， 操作過程簡單，檢測設(shè)備輕巧便攜，可用于食品中己烯雌酚的現(xiàn)場大批量快速定量檢測。

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牛奶和奶粉中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚殘留量的測定. 中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn). GB/T 22992.2008

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Abstract The upconversion nanoparticles （UCNPs） NaYF4∶Yb，Er were synthesized by the solvent thermal method. Fluorescence probe was prepared by coupling the anti.diethylstilbestrol （DES） monoclonal antibody with UCNPs. The DES.labeled bovine serum albumin （BSA） conjugates and goat anti.mouse antibodies were sprayed onto the nitrocellulose membrane as the test line and the control line， respectively. The resultant fluorescence probes were introduced into the immunochromatographic strip for rapid determination of DES. The UCNPs.based immunochromatographic strips for determination of DES exhibited a good linear range from 25 ng/mL to 10000 ng/mL （y=0.43927x-0.57647， R2=0.996）， with a limit of detection of 20.84 ng/mL. The detection time of the proposed UCNPs based immunochromatographic strips for each sample was only 15 min. The RSDs of the intra and inter assay were less than 10%. The strip showed excellent specificity to structural and functional analogues， and the average RSD of detection value after storage at 37℃ for 7 days was about 15%. The recovery experiment showed that the average recoveries of DES at 5 spiked concentration levels were 90.1%-115.2%， and the RSDs were below 5%. These results were consistent with that of HPLC.

Keywords Upconversion nanoparticles； Immunochromatographic strip； Diethylstilbestrol； Quantitative determination