張廣平+李潮+馬薇+吳尚犬+張青川

摘 要 研制了一套基于光杠桿原理的微懸臂梁陣列傳感器平臺(tái)，并通過(guò)使用設(shè)計(jì)制作的微懸臂梁陣列芯片展示其在生物化學(xué)方面的檢測(cè)應(yīng)用。傳感器平臺(tái)使用光導(dǎo)纖維束分別與激光器耦合作為懸臂梁陣列的掃描光源，具有良好的檢測(cè)穩(wěn)定性，檢測(cè)信號(hào)噪聲水平約為2 nm； 設(shè)計(jì)制作的微懸臂梁陣列芯片具有良好的平直度，溫度響應(yīng)均勻一致，各梁溫度改變響應(yīng)靈敏度偏差不超過(guò)5.0%。將整套傳感系統(tǒng)被用于檢測(cè)水溶液中的Hg2+，檢測(cè)濃度范圍為1～200 ng/mL； 同一濃度下微懸臂梁陣列檢測(cè)結(jié)果曲線一致性良好，平均偏差小于15%。在研制儀器平臺(tái)上，分別實(shí)現(xiàn)了自制和國(guó)外商品化芯片對(duì)1.0和0.2 ng/mL樣品的檢測(cè)，結(jié)果表明，制作的微懸臂梁陣列芯片的檢測(cè)靈敏度相對(duì)較低，需進(jìn)一步改進(jìn)懸臂梁陣列制作工藝。

關(guān)鍵詞 生物化學(xué)傳感器； 光導(dǎo)纖維； 懸臂梁陣列； 汞離子； 定量檢測(cè)

1 引 言

微懸臂梁傳感技術(shù)是目前在生物化學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域具有廣泛發(fā)展前景的傳感技術(shù)手段。微懸臂梁傳感器的設(shè)計(jì)使用起源于原子力顯微鏡探針技術(shù)[1]，該傳感技術(shù)將分子識(shí)別結(jié)合過(guò)程轉(zhuǎn)化為可識(shí)別記錄的機(jī)械信號(hào)。這項(xiàng)傳感技術(shù)具有無(wú)需標(biāo)記、高靈敏度、可實(shí)時(shí)原位檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，已用于檢測(cè)各類化學(xué)分子、離子[2～4]，識(shí)別生物分子如蛋白質(zhì)[5]、核酸[6]以及監(jiān)測(cè)細(xì)胞[7，8]及微生物[9]的生長(zhǎng)過(guò)程。

近年來(lái)，隨著微制造工藝的發(fā)展，微懸臂梁芯片的制造技術(shù)越來(lái)越成熟，已經(jīng)可以制作出包含多個(gè)微懸臂梁的陣列芯片，可輕松實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)以及設(shè)置平行對(duì)照實(shí)驗(yàn)。制作機(jī)械性能良好且一致的微懸臂梁陣列芯片以及穩(wěn)定可靠的傳感檢測(cè)平臺(tái)，是懸臂梁傳感器檢測(cè)應(yīng)用的工作基礎(chǔ)和重點(diǎn)。目前已經(jīng)有很多實(shí)現(xiàn)微懸臂梁陣列檢測(cè)的報(bào)道。最初， 垂直腔面發(fā)射激光器陣列被用于時(shí)序掃描檢測(cè)陣列梁[10]，但不方便進(jìn)行溫度控制，激光器輸出不穩(wěn)定引入噪聲。 Martinez等[11]使用掃描的激光實(shí)現(xiàn)檢測(cè)二維排布的微懸臂梁陣列，但這種方法無(wú)法避免移動(dòng)誤差帶來(lái)的噪聲。 鄔林等[12]使用壓電陶瓷管帶動(dòng)透鏡移動(dòng)使激光照射位置產(chǎn)生變化的方法， 實(shí)現(xiàn)了對(duì)包含2根懸臂梁的芯片的檢測(cè)，這種方法一方面會(huì)有移動(dòng)位移誤差噪聲，另一方面透鏡的移動(dòng)也會(huì)影響匯聚的激光光斑形狀，造成不同梁檢測(cè)信號(hào)噪聲不同，影響檢測(cè)精度。

本研究利用八束光導(dǎo)纖維分別耦合至8個(gè)激光器作為陣列梁探測(cè)光源， 搭建基于光杠桿原理的陣列懸臂梁傳感平臺(tái)，設(shè)計(jì)制作包含8個(gè)懸臂梁的微懸臂梁陣列芯片。初步分析制作的懸臂梁陣列的平直度以及在改變溫度時(shí)各懸臂梁的響應(yīng)，利用傳感檢測(cè)系統(tǒng)平臺(tái)和制作的微懸臂梁陣列芯片定量檢測(cè)水溶液中Hg2+，比較不同微懸臂梁陣列芯片對(duì)極低濃度的Hg2+檢測(cè)的差異。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 微懸臂梁陣列芯片制作

懸臂梁陣列芯片是檢測(cè)過(guò)程最重要的消耗部件，而且容易損壞，制作的目的是希望制作出價(jià)格經(jīng)濟(jì)、具有高靈敏度且懸臂梁性能一致的芯片。微梁陣列主要制作步驟如下[13]： （1）在清洗后的硅片（Nanoshift LLC. USA）上經(jīng)低壓化學(xué)氣相沉積過(guò)程兩面沉積1 μm厚氮化硅膜； （2）利用光刻得到掩膜，對(duì)氮化硅層的反應(yīng)離子刻蝕過(guò)程在硅片正面形成微梁陣列的圖形； （3）經(jīng)等離子體增強(qiáng)化學(xué)氣相沉積法在硅片正面沉積3 μm厚氧化層形成保護(hù)層； （4）該過(guò)程刻蝕出微梁芯片的側(cè)壁以及芯片與硅片框架間的連接部分： 首先通過(guò)光刻及對(duì)氧化層的反應(yīng)離子刻蝕過(guò)程在硅片正面形成需要刻蝕的輪廓，經(jīng)深反應(yīng)等離子刻蝕過(guò)程，刻蝕硅片深度為300 μm，最后濕法刻蝕去除表面剩余氧化層； （5）硅片正面熱生長(zhǎng)1 μm厚氧化層； （6）通過(guò)光刻及對(duì)氮化硅層的反應(yīng)離子刻蝕過(guò)程在硅片的背面形成微梁陣列腐蝕圖形； （7）各向異性腐蝕釋放微懸臂梁陣列芯片，然后使用緩沖氧化物刻蝕去除正面氧化層； （8）蒸發(fā)過(guò)程，在懸臂梁表面依次沉積Ti層和Au層，厚度依次為3和20 nm。

2.2 微梁陣列傳感系統(tǒng)設(shè)計(jì)

傳感系統(tǒng)設(shè)計(jì)原理圖如圖2所示。懸臂梁陣列的偏轉(zhuǎn)信號(hào)利用光杠桿方法由光電位置敏感探測(cè)器（Position Sensitive Detector， PSD）接收，微梁陣列的探測(cè)光源為與8個(gè)激光器（650 nm，北京華源世達(dá)激光技術(shù)有限公司）分別耦合的8束光導(dǎo)纖維，各光導(dǎo)纖維束末端匯集在間隔為250 μm的8個(gè)硅刻蝕制作V型槽結(jié)構(gòu)內(nèi)，使得光纖末端發(fā)出光束與各懸臂梁一一對(duì)應(yīng)。通過(guò)對(duì)各激光器進(jìn)行時(shí)序控制實(shí)現(xiàn)對(duì)微梁陣列芯片中各懸臂梁偏轉(zhuǎn)的探測(cè)。每個(gè)激光器都被分別安置在半導(dǎo)體溫控器上，溫度設(shè)定為25.0℃以確保各激光器工作溫度恒定，為激光器穩(wěn)定輸出提供保證。微梁陣列芯片被固定在體積為200 μL的反應(yīng)池內(nèi)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中溶液流動(dòng)速度設(shè)定為1 μL/s。反應(yīng)池底部距離懸臂梁芯片2 mm的位置安裝有溫控器（MAP6A， SHIMAX），溫控精度達(dá)±0.05℃； 整個(gè)儀器安置在光學(xué)隔震臺(tái)上，放置于溫度穩(wěn)定的室內(nèi)。

3 結(jié)果與討論

3.1 微懸臂梁陣列性能分析

微懸臂梁陣列芯片滿足檢測(cè)實(shí)驗(yàn)要求，一方面要保證具有較高的平直度，即較大的曲率半徑，可以確保反射至PSD靶面的光斑不會(huì)過(guò)于彌散[14]，避免因此降低檢測(cè)靈敏度。根據(jù)購(gòu)買(mǎi)的商品化微陣列懸臂梁芯片參數(shù)（Micromotive，Germany），通常懸臂梁曲率半徑在20 mm左右完全滿足該要求。使用三維輪廓儀（Wyko NT9100）測(cè)得的制作的陣列梁芯片各懸臂梁曲率半徑均約為15 mm，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中初步滿足對(duì)曲率半徑的要求。

另一方面，微懸臂梁陣列的使用意義之一是在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)芯片中不同懸臂梁間的偏轉(zhuǎn)信號(hào)結(jié)果進(jìn)行比較，因此必須保證實(shí)驗(yàn)中使用的各懸臂梁性能一致或相近，即各懸臂梁在相同的激勵(lì)下產(chǎn)生的響應(yīng)一致，這里利用懸臂梁陣列對(duì)溫度變化的響應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證。微懸臂梁陣列芯片安置在反應(yīng)池中，池中充滿水，反應(yīng)池最初溫度設(shè)定為28.0℃，溫度穩(wěn)定后，每15 min升高2.00℃。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3A，由于雙材料梁的溫升效應(yīng)，每次溫度變化均使各懸臂梁產(chǎn)生方向一致的偏轉(zhuǎn)。提取當(dāng)溫度穩(wěn)定時(shí)各懸臂梁的穩(wěn)定偏轉(zhuǎn)值，生成穩(wěn)定偏轉(zhuǎn)值與溫度關(guān)系曲線圖，并進(jìn)行線性擬合如圖3B所示，擬合系數(shù)均大于0.99，說(shuō)明每個(gè)懸臂梁偏轉(zhuǎn)與溫度成線性關(guān)系，證明各懸臂梁結(jié)構(gòu)均勻。表1列出了芯片所有懸臂梁對(duì)溫度響應(yīng)靈敏度k值，即為圖3B中各擬合直線斜率，利用溫度響應(yīng)靈敏度平均值分別計(jì)算相對(duì)偏差Δ，其絕對(duì)值最大為5.0%，各懸臂梁的溫度響應(yīng)靈敏度值非常接近，一定程度說(shuō)明各懸臂梁的結(jié)構(gòu)和尺寸均勻一致，適合用于微懸臂梁陣列檢測(cè)應(yīng)用。

3.2 傳感系統(tǒng)檢測(cè)Hg2+

將研制的微懸臂梁陣列傳感系統(tǒng)以及微懸臂梁陣列芯片用于檢測(cè)水溶液中Hg2+。汞是一種重金屬，是劇毒的環(huán)境污染物，對(duì)人和動(dòng)物有毒害作用。水溶液中的Hg2+可以在金表面沉積，當(dāng)Hg2+在懸臂梁的金層表面沉積時(shí)，會(huì)使懸臂梁表面應(yīng)力發(fā)生變化從而產(chǎn)生彎曲變形[15]，但尚未有使用陣列梁檢測(cè)進(jìn)行比較驗(yàn)證的報(bào)道。

實(shí)驗(yàn)中使用的Hg2+樣品原液為1 mg/mL Hg（NO3）2溶液（含2%～5% HNO3），實(shí)驗(yàn)中使用的溶液均通過(guò)加入HNO3（65%～68%）保持pH=6.0，以防止Hg（NO3）2水解沉淀。將清洗干凈的微梁陣列芯片固定在傳感平臺(tái)的反應(yīng)池中，浸泡在水溶液中。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中溶液流速為1 μL/s，傳感器反應(yīng)池溫度控制為（25.00±0.05）℃。

當(dāng)采集得到的各懸臂梁偏轉(zhuǎn)曲線均達(dá)到平衡狀態(tài)后，將濃度為50 ng/mL Hg2+溶液加入檢測(cè)樣品入口，檢測(cè)得到的偏轉(zhuǎn)曲線結(jié)果如圖4A所示。各懸臂梁產(chǎn)生的偏轉(zhuǎn)方向一致，自加入樣品開(kāi)始出現(xiàn)偏轉(zhuǎn)約1 h后，懸臂梁產(chǎn)生的偏轉(zhuǎn)減緩并趨于穩(wěn)定，各懸臂梁偏轉(zhuǎn)結(jié)果一致性良好。忽略懸臂梁陣列中偏轉(zhuǎn)最大及最小值，計(jì)算得該微懸臂梁陣列的平均偏轉(zhuǎn)曲線結(jié)果如圖4A內(nèi)插圖所示，100 min時(shí)各懸臂梁平均偏轉(zhuǎn)約為 424.2 nm。其余各梁偏轉(zhuǎn)值與平均值偏差為9.5%， 5.6%， 3.1%， 2.9%， 7.1%和14.0%。

圖4B為使用微懸臂梁陣列依次檢測(cè)濃度介于1～200 ng/mL的各濃度Hg2+溶液得到的各檢測(cè)結(jié)果的平均偏轉(zhuǎn)曲線。當(dāng)檢測(cè)含更高濃度Hg2+的溶液時(shí)，對(duì)應(yīng)檢測(cè)過(guò)程中懸臂梁偏轉(zhuǎn)速率也隨之變快，相同時(shí)刻下檢測(cè)到的懸臂梁偏轉(zhuǎn)量也更大。很明顯，這是由于當(dāng)Hg2+濃度升高時(shí)，Hg2+在金表面聚積速率變快，相同時(shí)刻下沉積的量也增多，導(dǎo)致懸臂梁表面應(yīng)力變化改變速率更快、產(chǎn)生應(yīng)力變化更大。同時(shí)可以看出在一定濃度下，最終在金層上最終聚積的汞總量也趨于穩(wěn)定。

為了比較制作的微懸臂梁芯片在極低濃度樣品的檢測(cè)表現(xiàn)，分別使用制作的微懸臂梁陣列芯片和購(gòu)買(mǎi)的商品化微懸臂梁陣列芯片（Micromotive， germany）對(duì)極低濃度的Hg2+進(jìn)行檢測(cè)，兩種芯片懸臂梁尺寸相同.檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5。圖5中曲線a為使用制作的陣列梁芯片對(duì)1 ng/mL Hg2+檢測(cè)的平均結(jié)果曲線，達(dá)到的穩(wěn)定偏轉(zhuǎn)約為 21.0 nm，信號(hào)噪聲約為±1 nm； 曲線b為使用購(gòu)買(mǎi)的陣列梁芯片對(duì)0.2 ng/mL Hg2+檢測(cè)的平均結(jié)果曲線，達(dá)到的穩(wěn)定偏轉(zhuǎn)約為 39.0 nm， 信號(hào)噪聲約為±2 nm?？梢悦黠@看出，購(gòu)買(mǎi)的陣列梁芯片檢測(cè)靈敏度更高，這可能是由于制作的陣列梁芯片的懸臂梁彈性系數(shù)更大，與商品化的陣列梁芯片相比，要使懸臂梁產(chǎn)生相同的偏轉(zhuǎn)，所需的懸臂梁表面應(yīng)力更大，需要在更大濃度樣品檢測(cè)中才能達(dá)到，因此，本系統(tǒng)在檢測(cè)低濃度樣品表現(xiàn)較差。（m）曲線的噪聲明顯大于（s）曲線的噪聲，說(shuō)明彈性系數(shù)小的懸臂梁具有更高靈敏度的優(yōu)勢(shì)，但同時(shí)也更容易受外界噪聲干擾。

4 結(jié) 論

構(gòu)建了可以實(shí)時(shí)檢測(cè)包含8根懸臂梁的微懸臂梁陣列的生化傳感系統(tǒng)，此系統(tǒng)具有良好的性能。自行設(shè)計(jì)制作了包含8根懸臂梁的微懸臂梁陣列芯片，懸臂梁具有良好的平直度和溫度響應(yīng)一致性。此微懸臂梁陣列傳感系統(tǒng)和制作的微懸臂梁陣列芯片被用于定量檢測(cè)水溶液中Hg2+，檢測(cè)最低濃度達(dá)1 ng/mL。制作的懸臂梁芯片檢測(cè)靈敏度低于國(guó)外商品化的芯片，因此其制作工藝仍需改進(jìn)。

References

1 Meyer G， Amer Nabil M. Appl. Phys. Lett.， 1988， 53（12）： 1045-1047

2 XU Ying.Ming， PAN Hong.Qing， WU San.Hua， ZHANG Bai.Lin. Chinese J. Anal. Chem.， 2009， 37（6）： 783-787

徐英明， 潘宏青， 伍三華， 張柏林. 分析化學(xué)， 2009， 37（6）： 783-787

3 Zhao H W， Xue C G， Nan T G， Tan G Y， Li Z H， Li Q X， Zhang Q C， Wang B M. Anal. Chim. Acta， 2010， 676（1.2）： 81-86

4 Zhou X R， Wu S Q， Liu H， Wu X P， Zhang Q C. Sens. Actuators B， 2016， 226： 24-29

5 Yue M， Stachowiak J C， Lin H， Datar R， Cote R， Majumdar A. Nano Lett.， 2008， 8（2）： 520-524

6 Mertens J， Rogero C， Calleja M， Ramos D， Martin.Gago J A， Briones C and Tamayo J. Nat. Nanotech.， 2008， 3： 301-307

7 Wu S Q， Liu X L， Zhou X R， Liang X M， Gao D Y， Liu H， Zhao G， Zhang Q C， Wu X P. Biosens. Bioelectron.， 2016， 77（15）： 164-173

8 Chen X J， Pan Y G， Liu H Q， Bai X J， Wang N， Zhang B L. Biosens. Bioelectron.， 2016， 79（15）： 353-358

9 Maloney N， Lukacs G， Jenson J， Hegner M. Nanoscale， 2014， 6（14）： 8242-8249

10 Battiston F M， Ramseyer J P， Lang H P， Baller M K， Gerber C， Gimzewski J K， Meyer E， Guntherodt H J. Sens. Actuators B， 2001， 77（1.2）： 122-131

11 Martinez N F， Kosaka P M， Tamayo J， Ramirez J， Ahumada O， Mertens J， Hien T D， Rijn C V， Calleja M. Rev. Sci. Instrum.， 2010， 81（12）： 125109

12 WU Lin， ZHOU Xia.Rong， WU Shang.Quan， WANG Ping， ZHANG Qing.Chuan， WU Xiao.Ping. Chinese J. Anal. Chem.， 2012， 40（4）： 493-497

鄔 林， 周夏榮， 吳尚犬， 王 萍， 張青川， 伍小平. 分析化學(xué)， 2012， 40（4）： 493-497

13 Shi H T， Zhang Q C， Qian J， Mao L， Cheng T， Gao J， Wu X P， Chen D P， Jiao B B. Opt. Express， 2009， 17（6）： 4367-4381

14 Miao Z Y， Zhang Q C， Guo Z Y， and Wu X P. Opt. Lett.， 2007， 32（6）： 594-596

15 Xu X H， Thundat T G， Brown G M， and Ji H F. Anal. Chem.， 2002， 74（15）： 3611-3615

Abstract A cantilever array sensor platform has been developed based on the optical lever method， the cantilever array chip is also fabricated to introduce its applications on biochemical detection. Optical fibers coupled to lasers are used as the scanning light source. This sensor system has good stability， and the noise of the detection signal is about 2 nm. Meanwhile， the cantilevers of the fabricated chip have good straightness and are consistent to temperature response， and the deviations of response sensitivity of cantilevers caused by temperature change are no more than 5.0%. This sensing system is used to detect Hg2+ in aqueous solution with a concentration range of 1-200 ng/mL. The deflections of one array chip are close in the same concentration， and the average deviation is less than 15%. Samples at the concentration levels of 1 ng/mL and 0.2 ng/mL are detected separately by the fabricated chip and a foreign commercial chip on the sensor platform. The result shows that it′s difficult for the fabricated chip to achieve a higher detection sensitivity and necessary to improve the cantilever array production process.

Keywords Biochemical sensor； Optical fiber； Cantilever array； Mercury； Quantitative detection