黃 新 ， 韓猛立 ， 張星星 ， 吳桐忠 ， 何延華 ， 鐘發(fā)剛

(新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)動(dòng)物疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 新疆農(nóng)墾科學(xué)院 ， 新疆 石河子 832000)

豬流行性腹瀉(PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的豬的一種急性、高度傳播性的腸道疾病。該病以急性腸炎、嘔吐、水樣腹瀉和脫水為主要特征。各年齡豬均易感，尤其是哺育仔豬，發(fā)病率為100%，死亡率為80%～100%。2010年來，該病在我國(guó)大部分地區(qū)均有流行[1]。2013-2015年期間，石河子市及周邊地區(qū)多個(gè)豬場(chǎng)出現(xiàn)2周齡內(nèi)仔豬腹瀉死亡的群發(fā)病例。為了弄清發(fā)病病原及流行情況，我們采集了該地區(qū)有腹瀉流行部分豬場(chǎng)的糞便樣本，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，調(diào)查該地區(qū)PED的流行及防控情況，為該疫病的診斷和預(yù)防提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 2013年5月-2015年12月樣品采集于石河子地區(qū)的莫索灣、安集海、下野地墾區(qū)和石河子市周邊，樣品來自該區(qū)域29個(gè)流行仔豬腹瀉豬場(chǎng)的487份肛拭子，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。豬群主要來自1～15日齡的新生仔豬，有臨床癥狀的樣本的豬主要表現(xiàn)為嘔吐、水樣腹瀉。

1.2 試劑與材料 RNA提取試劑盒，購(gòu)自Invitrogen公司的TRIZol；反轉(zhuǎn)錄(AMV)試劑盒、TaqDNA 聚合酶(含10×Buffer)、dNTP，DL-2 000 bp DNA Marker、膠回收試劑盒、pMD18-T連接試劑盒為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品，基因組提取試劑盒為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品，DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 擴(kuò)增豬病毒性腹瀉的引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank PEDV M蛋白相對(duì)保守序列設(shè)計(jì)3條引物，F(xiàn)m1:5′- GGGCGCCTGTATAGAGTTTA-3′; Rm1:5′- TGGAATGCAGACCTGTCG-3′; Rm2: 5′- AGACCACCAAGAATGTGTCC-3′;由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 樣本的處理及病毒總RNA的提取 使用PBS將肛拭子腸內(nèi)容物制成10%懸液，混勻，3 000 r/min(4 ℃)離心10 min。取上清400 μL，使用TRIZol法提取樣品中的總RNA。

1.5 RT-PCR擴(kuò)增 PEDV特異性片段及克隆測(cè)序 首先以反轉(zhuǎn)錄引物Rm1進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，反應(yīng)采用10 μL體系：模板RNA 5.5 μL，20 μmol/L引物Rm1 0.5 μL，70 ℃保溫10 min后，在冰上速冷2 min，加入5×M-MLV Buffer 2 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL,40 U/μL RNase Inhibitor 0.25 μL,200 U/μL RTase M-MLV 0.25 μL, DEPC水補(bǔ)至10 μL，瞬時(shí)離心后42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min，4 ℃存放備用。以此為模板，使用引物Fm1/Rm1進(jìn)行PCR第1次擴(kuò)增，然后使用一擴(kuò)產(chǎn)物1 μL分別使用引物Fm1/Rm2進(jìn)行第2次擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件如下：94 ℃變性5 min；94 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s 30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。兩次的反應(yīng)條件相同。反應(yīng)結(jié)束取第2次擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物 5 μL，用15 g/L的瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

1.6 石河子部分地區(qū)豬流行性腹瀉病初次和再次流行特征調(diào)查 使用調(diào)查問卷及定期回訪的形式對(duì)石河子部分地區(qū)發(fā)病豬場(chǎng)豬流行性腹瀉持續(xù)追蹤和現(xiàn)場(chǎng)調(diào)研。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)病的流行特點(diǎn)及臨床癥狀 發(fā)病豬場(chǎng)1～3日齡新生仔豬出現(xiàn)腹瀉，3～5日齡死亡率最高，能耐過15日齡的仔豬逐漸癥狀減輕，但往往生長(zhǎng)不良；部分生產(chǎn)母豬厭食、發(fā)熱和嘔吐，其他豬群偶有腹瀉，1周即康復(fù)。發(fā)病仔豬主要繼發(fā)性水樣腹瀉，黃色或灰白色，惡臭同時(shí)伴有體溫升高，后消瘦，被毛粗亂、精神委靡不食、全身衰竭，使用抗生素等藥物無(wú)效。

2.2 目的片段RT-PCR的擴(kuò)增結(jié)果 以腸內(nèi)容物提取的RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄后使用引物Fm1/Rm1一擴(kuò)，用其產(chǎn)物分別使用Fm1/Rm2 (圖1)，獲得預(yù)期大小(412 bp)PEDV特異性片段，與預(yù)期結(jié)果一致，見圖1。后克隆測(cè)序，為預(yù)計(jì)目的基因序列。

圖1 樣本中PEDV PCR的擴(kuò)增

M: DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1-7: Fm1/Rm2二擴(kuò)結(jié)果

2.3 石河子部分地區(qū)豬流行性腹瀉病病原調(diào)查情況 將采集的石河子部分地區(qū)及周邊29個(gè)豬場(chǎng)487份樣品RT-PCR結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，該地區(qū)豬流行性腹瀉病原感染陽(yáng)性率從30.0%～87.5%。其中石河子市周邊的145團(tuán)陽(yáng)性率最高，達(dá)到了87.5%，豬場(chǎng)平均陽(yáng)性率為75.9%(22/29)，見表1。

2.4 石河子部分地區(qū)豬流行性腹瀉病初次和再次流行特征分析

2.4.1 發(fā)病地區(qū)初次流行特征 對(duì)發(fā)病豬場(chǎng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，四季都有發(fā)病，沒有明顯的季節(jié)性特點(diǎn)。但距離相近的豬場(chǎng)發(fā)病時(shí)間間隔較短，按時(shí)間來看，首先是石河子周邊的石河子總場(chǎng)、沙灣先發(fā)病，其次是莫索灣148團(tuán)、149團(tuán)發(fā)病，最后是下野地和安集海地區(qū)見表1。

表1 石河子地區(qū)豬流行性腹瀉病原檢測(cè)結(jié)果

2.4.2 發(fā)病地區(qū)再次流行特征 對(duì)發(fā)病地區(qū)持續(xù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，有15個(gè)豬場(chǎng)(其他13個(gè)豬場(chǎng)數(shù)據(jù)不詳)在初次流行該病時(shí)，發(fā)病率達(dá)50%～95%，經(jīng)過8～12個(gè)月后，新生仔豬腹瀉的發(fā)病率下降到15%～20%。但死亡率多在90%以上，表現(xiàn)在某窩或某幾窩仔豬全部死亡；發(fā)病豬妊娠時(shí)同圈母豬產(chǎn)仔正常，與發(fā)病仔豬鄰窩豬群也生長(zhǎng)正常。發(fā)病母豬表現(xiàn)產(chǎn)后厭食、高熱和嘔吐等癥狀，3～6 d恢復(fù)正常，其仔豬常常消瘦脫水而死亡。

2.5 石河子部分地區(qū)豬流行性腹瀉病流行豬場(chǎng)采取的防控策略及效果

2.5.1 流行前后采取的防控策略 通過對(duì)石河子市及周邊地區(qū)29個(gè)豬場(chǎng)的防疫情況及流行發(fā)病后所采取的防控出來方案進(jìn)行調(diào)查，豬流行性腹瀉病毒和豬傳染性胃腸炎二聯(lián)滅活疫苗已經(jīng)作為日常免疫程序的豬場(chǎng)23個(gè)，按照4個(gè)月1次對(duì)母豬進(jìn)行普免；2個(gè)豬場(chǎng)在腹瀉流行期前2個(gè)月免疫過該滅活苗；沒有接種該疫苗的豬場(chǎng)有3個(gè)。

流行該病后，16個(gè)豬場(chǎng)對(duì)全群母豬緊急接種了豬豬流行性腹瀉病毒和豬傳染性胃腸炎二聯(lián)滅活疫苗，其中2個(gè)豬場(chǎng)在發(fā)病后，連續(xù)3個(gè)月緊急接種該滅活疫苗，1次/月；5個(gè)豬場(chǎng)采取給產(chǎn)前母豬喂食腹瀉仔豬排泄物；另外5個(gè)豬場(chǎng)沒有采取注射疫苗的手段，僅僅使用每天及時(shí)清除腹瀉物、消毒及抗生素等策略。

2.5.2 防控效果 不論是流行前還是流行后采取以上一種或多種防控方案的豬場(chǎng)，都沒有取得有效控制該病的結(jié)果。

3 討論

本工作中調(diào)查了石河子莫索灣、安集海、下野地和石河子市周邊地區(qū)29個(gè)有腹瀉癥狀的豬場(chǎng)，檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒流行和防控情況，為該病的確診及進(jìn)一步防控提供了依據(jù)。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)487份肛拭子樣品中，304份樣品陽(yáng)性，平均陽(yáng)性率62.4%，不同地區(qū)的陽(yáng)性率差異較大(30.0%～87.5%)。29個(gè)豬場(chǎng)中22個(gè)豬場(chǎng)豬流行性腹瀉病毒陽(yáng)性，平均陽(yáng)性率75.9%?？梢源_認(rèn)豬流行性腹瀉病毒是引起新生仔豬群腹瀉疫情的主要病原。在檢測(cè)PEDV病原時(shí)，從部分豬場(chǎng)的臟器中也分離到了致病性大腸桿菌，可能加重了一些豬場(chǎng)仔豬腹瀉和死亡。

免疫疫苗本是防控該病的主要手段，但是本調(diào)查中75.9%(22/29)的豬場(chǎng)在此疫情之前都已經(jīng)免疫豬流行性腹瀉疫苗，所有的豬場(chǎng)都緊急接種了該疫苗，同時(shí)2個(gè)豬場(chǎng)連續(xù)3個(gè)月對(duì)豬場(chǎng)母豬普免疫苗，但都沒有取得明顯的效果。內(nèi)地多個(gè)地區(qū)的免疫豬場(chǎng)都沒有逃脫該病的流行[2-3]。資料表明，多地流行株與疫苗毒株CV777遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，可能是該病流行的主要原因[4-5]。

[1] 常鐵城,陳建飛,馮力，等.2014年部分地區(qū)豬流行性腹瀉病毒流行病學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2016,38(4):335-338.

[2] 趙振鵬,楊振,林偉東,等.江蘇省豬流行性腹瀉病毒的流行病學(xué)調(diào)查[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,43(19):125-127.

[3] 董彥鵬,白娟,范寶超,等．豬流行性腹瀉病毒RT-PCR檢測(cè)與ORF3基因分子流行病學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2013,35(7):555-558.

[4] 劉孝珍,陳建飛,時(shí)洪艷,等.2011年豬流行性腹瀉病毒的遺傳變異分析[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2012,34(3):180-183.

[5] 施標(biāo),董世娟,朱于敏,等.中國(guó)豬流行性腹瀉病毒分子流行病學(xué)研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013,46(20):4 362-4 369.