朱曉靜 ， 王金花 ， 廖承紅 ， 徐永昊 ， 韓 謙

(海南大學熱帶農(nóng)林學院 ， 海南 ?？?570228)

犬惡絲蟲病是由蚊子傳播的線蟲類絲蟲病，能對其終末宿主-家犬(犬屬)和野生犬科動物(山狗和狼等)造成嚴重的心肺疾病，除犬外，貓和其他野生肉食動物均可作其終末宿主。動物的感染病例已出現(xiàn)在除南極洲以外的各大洲，在熱帶和亞熱帶地區(qū)廣泛流行，且流行時間比溫帶和寒帶長。由于蚊蟲是本病的傳播媒介，特別是在熱帶地區(qū)，蚊蟲一年四季都很活躍，而海南地處熱帶地區(qū)，該病幾乎可全年流行。在我國的北京、上海、重慶、廣東、福建、浙江、湖北、四川、云南、山東、遼寧、內(nèi)蒙古和深圳等27個省和直轄市已有犬惡絲蟲感染動物的報道[1]。而人患該病的確診病例數(shù)呈逐年上升趨勢，2005年在中國有2 例人體感染犬惡絲蟲病例[2]。而到了2012年，香港有3例人感染了新型犬惡絲蟲病病例[3]，犬惡絲蟲病已成為潛在的嚴重威脅人類健康的新發(fā)人獸共患寄生蟲病。但迄今為止，未見到海南犬心絲蟲病流行病學的相關報道。

沃爾巴克氏體(Wb)是共生于犬惡絲蟲體內(nèi)的內(nèi)共生菌，在絲蟲發(fā)育的各個階段均存在，當犬惡絲蟲死亡后，向機體釋放出大量的Wb，在心絲蟲病治療前減少沃爾巴克的水平有利于減少絲蟲引起的不良病理反應，故Wb為犬惡絲蟲的致病機理以及診療提供了新的研究途徑，開發(fā)新的診斷工具來檢測Wb是建立更有效的心絲蟲診斷、治療和控制不良反應的新方法。

目前Wb被報道的基因序列有wsp基因、過氧化氫酶基因、16S rRNA和沃爾巴克絲狀熱敏感蛋白基因(ftsZ基因)。ftsZ基因在沃爾巴克氏體中調(diào)節(jié)細菌細胞分裂，有著保守的和高度分散的序列，可作為細菌分類的基礎[4]。

本試驗基于PCR和凝膠電泳的技術，擴增犬心絲蟲沃爾巴克氏體ftsZ基因，間接診斷犬的外周血的犬心絲蟲感染，旨在探尋心絲蟲病早期診斷技術，同時了解和證實海南省?？谑腥慕z蟲的感染情況和犬心絲蟲內(nèi)共生體Wb基因分型情況。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 血樣采集來自與海南省小動物流浪狗中心、?？谑兄Z康寵物醫(yī)院和海口市樂寵寵物醫(yī)院。

1.1.1 試劑 Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒，SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒。

1.1.2 儀器 離心機：上海手術器械廠生產(chǎn)；坩浴鍋；PCR儀；移液槍；紫外分析儀；瓊脂糖水平電泳儀；泡沫低溫箱。

1.2 血液DNA的提取 取50 μL的血液樣品加入到1.5 mL離心管中，再加入150 μL PBS使總體積為200 μL，混勻。加入20 μL Proteinase K，混勻。再加入200 μL的Buffer CL，震蕩混勻，56 ℃水浴 10 min。向上述離心管中加入200 μL的無水乙醇，充分顛倒混勻。將吸附柱放入收集管中，用移液器將溶液和半透明纖維狀懸浮物全部加入吸附柱中，靜置2 min，再10 000 r/min(室溫)離心1 min，倒掉收集管中廢液。將吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500 μL CW1 Solution，10 000 r/min離心 30 s，倒掉廢液。將吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500 μL CW2 Solution，10 000 r/min離心30 s倒掉廢液。將吸附柱重新放回收集管中，于 12 000 r/min(室溫)離心2 min，離心去除殘留的CW2 Solution。將吸附柱蓋子打開于室溫放置 5 min。取出吸附柱，加入一個新的1.5 mL離心管中，加入50 μL ddH2O靜置3 min，12 000 r/min(室溫)離心 2 min，收集DNA溶液。提取的DNA可立即進行下一步試驗或-20 ℃保存。

1.3 目的基因PCR擴增 采用PCR擴增犬心絲蟲沃爾巴克絲狀熱敏感蛋白基因(ftsZ基因)，片段520～580 bp，擴增引物參照國外文獻報道的序列引物[8]。上游引物ftsZF為: 5′-ATAACAGCAGGAATGGGTGGT-3′; 下游引物ftsZR: 5′-TCACGCACTCTATTTGCTGCA-3′。PCR 反應總體積為25 μL, 包括1 μL模板, 10.5 μL雙蒸水(ddH2O)，12.5 μL mix酶，1 μLftsZ基因引物。94 ℃ 變性4 min 進入循環(huán), 94 ℃ 45 s, 52 ℃ 45 s, 72 ℃ 45 s，35個循環(huán)后72 ℃延伸7 min。將PCR產(chǎn)物進行電泳, 用1.5%瓊脂糖凝膠電泳, 溴化乙錠染色，于紫外燈下觀察。每次試驗都設立空白(水)對照, 并采取嚴格措施以避免污染，出現(xiàn)預期大小的條帶，采用膠回收DNA 片段，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 序列測定與親緣性分析 PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術服務有限公司測序, 登錄美國國家生物技術信息中心(NCBI) 站點后，利用“Blast Sequence Similarity Searching”工具，將測序結(jié)果與GenBank中注冊的ftsZ基因相關核苷酸序列(見表1)進行同源性比較。用MEGA 3.1 軟件neighborjoining 法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 用于ftsZ基因分析的相關序列

2 結(jié)果

2.1 基因擴增結(jié)果及測序結(jié)果 共檢測犬血60份，犬心絲蟲沃爾巴克氏體陽性3份，陽性率5.0%。測序結(jié)果目的片段長度為544～560 bp。電泳圖見圖1。

圖1 陽性標本PCR擴增電泳

注：M：DNA DL-2 000 的Marker； 1～3：陽性樣本，其中1為haikou 1 hao，2為haikou 2 hao，3為chengdu 1 hao； 4：空白對照

2.2 基因親緣性分析結(jié)果 將犬心絲蟲沃爾巴克氏體ftsZ基因序列與GenBank 中注冊的核苷酸序列進行比較, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本次調(diào)查犬感染的犬心絲蟲沃爾巴克氏體(Hainan 1hao)與GenBank中注冊的犬心絲蟲沃爾巴克氏體(AY523519.1)的同源性最高。構建的系統(tǒng)發(fā)育樹也顯示海南省犬感染的心絲蟲沃爾巴克氏體與成都的犬感染的心絲蟲沃爾巴克氏體聚在一個分支上, 而Dirofilariarepens、Dipetalonemagracile、Onchocercaochengi等都聚在外圍, 見圖2。序列分析表明, 本次調(diào)查的海南省海口市犬所感染的沃爾巴克氏體均屬于D.immitis基因型而它們之間又并不是完全相同，在系統(tǒng)發(fā)育樹上雖然聚在一個大的分支上, 但在大分支上又有小的分支，而且遺傳距離各不相同。Hainan 1 hao 和成都發(fā)現(xiàn)的chengdu 1 hao基因型最近，而hainan 3 hao 與成都的基因型最遠，并且hainan 1 hao 與hainan 3 hao 的基因型差距也較遠。

圖2 基于犬心絲蟲沃爾巴克ftsZ基因構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

我國的犬心絲蟲調(diào)查工作開展較早，在我國的北京、上海、深圳、貴州、重慶、廣東、福建、浙江、湖南、四川、云南、山東、遼寧、內(nèi)蒙古和吉林等27個省和直轄市已有犬惡絲蟲感染動物的報道。但在海南開展相關的工作卻較晚，2014年，賈麗欣首次用商品化的愛得士商品化膠體金免疫診斷試劑盒檢測到了海南8只犬感染了心絲蟲病[5]。近年來，在犬惡絲蟲病的診斷和防治研究上已取得了系列成果，免疫學如酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)診斷技術近年來在本病的研究上不斷完善，具有高度特異性和敏感性，越來越多地被應用于該病的臨床檢測。然而商品化診斷試劑盒卻存在以下問題：對5個月齡以下的犬不易檢出；心臟寄生成蟲少于5條時因血中抗體量較小，易出現(xiàn)假陰性；同時, 在自然感染犬惡絲蟲的犬中有10%～67% 為單性感染，不能產(chǎn)生微絲蚴，這些仍然是該診斷中的一個難點[6]。國內(nèi)外也有許多關于犬惡絲蟲病檢測的其他方法的報道，如：有微絲蚴蟲體檢測、皮內(nèi)變態(tài)反應試驗、直接凝聚試驗、間接血凝試驗、瓊脂擴散試驗、補體結(jié)合試驗、熒光抗體標記技術、PCR法等。目前診斷該病所采用的方法中，微絲蚴檢查法操作簡單、容易判斷，但容易出現(xiàn)假陰性。皮內(nèi)變態(tài)反應試驗、直接凝聚試驗、間接血凝試驗、瓊脂擴散試驗、補體結(jié)合試驗等方法操作復雜。

而PCR的檢測方法具有較高的靈敏性和特異性，在該病的診斷上具有良好的應用前景。

沃爾巴克氏體是共生于犬惡絲蟲體內(nèi)的共生菌，在絲蟲發(fā)育的各個階段均存在，它誘導的免疫病理引起的炎癥反應是絲蟲感染后致病的主要原因之一[7]，當犬惡絲蟲死亡后，向機體釋放出大量的Wb會加劇犬的炎性反應，在心絲蟲病治療前減少沃爾巴克的水平有利于減少絲蟲引起的不良病理反應，故Wb為犬惡絲蟲的致病機理以及診療提供了新的研究途徑，成為了治療犬惡絲蟲病的靶位點[8]。開發(fā)新的診斷工具來檢測Wb是建立更有效的心絲蟲治療方案和控制不良反應的新方法。

本試驗在海南?？谑幸约胰疄閷嶒瀯游?，在犬類全血樣品中檢測到了犬心絲蟲沃爾巴克氏體的沃爾巴克絲狀熱敏感蛋白基因(ftsZ基因)的特異核苷酸片段，從分子生物學的角度證實和發(fā)現(xiàn)了?？谑写嬖谌慕z蟲沃爾巴克氏體及其基因型，認為該地區(qū)為犬心絲蟲病的潛在疫源地。并且犬感染心絲蟲率高達5.0%，不僅反映出犬是海南省海口市犬心絲蟲的重要宿主動物之一，也說明在犬心絲蟲疫源地調(diào)查中利用犬作為指示動物具有重要的價值和意義。

海南本地犬感染犬心絲蟲沃爾巴克氏體雖然都屬于D.immitis基因型，但它們在系統(tǒng)發(fā)育樹矩形框的距離之間仍存在著一定差異，反映了海南省?？谑蠨.immitis型沃爾巴克氏體基因的多樣性較高。而我們本次試驗采用的試驗樣本均來自小動物流浪狗中心和寵物醫(yī)院，說明這些試驗樣本極有可能受到比較復雜的環(huán)境因素影響，但是這是否確實與復雜的地理和氣候環(huán)境、宿主動物等因素有關，或者它們?nèi)绾问苡绊懙?，還有待于進一步研究證實。相對而言，它們與我國四川發(fā)現(xiàn)的D.immitis型較為接近。在進化樹中，遺傳距離與地理分布間無明顯規(guī)律，可能由于沃爾巴克氏體的基因型比較復雜，媒介、宿主比較多樣，地理分布與基因型之間的關系需在今后的研究中繼續(xù)探索。

這些分子生物學的技術，可以對心絲蟲的早期感染進行診斷。而且，雖然大多數(shù)物種中都存在沃爾巴克氏體，但是隨著不斷進化，寄主與沃爾巴克氏體的相互影響，沃爾巴克氏體漸漸進化出許多個超群，通過研究不同物種中沃爾巴克氏體的基因親緣性關系，可以為治療絲蟲病找到新的研究方向。

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