孔德柱++張樹峰++周玉生+郝亞峰

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.143

摘要：為了研究固氮魚腥藻Anabaena Azotica 119作為未來生物肥料的可能性，分別以小麥和西紅柿為目標作物，設計了藻肥、尿素和羊糞的肥效對比試驗和藻肥改善土壤氮含量試驗。結(jié)果顯示：生長50 d的小麥，藻肥組鮮質(zhì)量為33.7 g，是對照組的3倍；干質(zhì)量為10.4 g，是對照組的2倍。生長50 d的西紅柿，藻肥組的鮮質(zhì)量為87.7 g，是空白對照的15倍，是羊糞和尿素的2倍還多；藻肥組干質(zhì)量為11.4 g，是空白對照組的14倍。施用藻肥的土壤在90 d后，含氮量可以提高416%，維持在0.075%左右。固氮魚腥藻在土壤中能夠持續(xù)固定空氣中的氮氣，有望開發(fā)成為環(huán)境友好、肥效持久的生物肥料。

關鍵詞：固氮魚腥藻；肥效；土壤氮含量；生物肥料

中圖分類號： S142+.5文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）10-0499-03

收稿日期：2015-11-10

基金項目：國家科技部國際合作項目（編號：2011DFA32640）。

作者簡介：孔德柱（1984—），男，黑龍江綏化人，碩士，工程師，主要從事生物質(zhì)應用領域項目開發(fā)。Tel：（010）56632598；E-mail：kongdezhukong@163.com。固氮藍藻是一類低等原核植物，能固定空氣中分子態(tài)氮成為氮素化合物[1]。很早以前人們就發(fā)現(xiàn)了藻類對植物具有肥效作用[2-3]。1939年人們發(fā)現(xiàn)生長在稻田的固氮藍藻可以使水稻連年保持較高的產(chǎn)量[4]。John研究了藍藻作為肥料固氮的能力，并在開放池中進行了藍藻培育[5]，但沒有對后續(xù)的肥效做進一步研究。夏建明等研究了固氮藍藻對稻田的肥效作用，無論是干藻還是鮮藻，施用于水稻后，水稻的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量相比于對照都有明顯的提高[6]。Mohmmed等用豌豆對藍藻肥料進行試驗，發(fā)現(xiàn)藍藻肥料配合化肥施用后豌豆的生長效果更好，甚至可以用藍藻肥料代替一半的化肥[7]。但到目前為止，對藍藻肥料的研究并不系統(tǒng)，藍藻作為肥料也多見于在水稻上的應用[8-9]，在其他作物的應用仍鮮有報道。本研究基于對現(xiàn)有尿素等氮肥生產(chǎn)能耗高、環(huán)境污染大[10]、對土壤有害[11]等弊端，研究了固氮藍藻作為氮肥對小麥和西紅柿的肥效及對土壤氮含量的改善，希望能在未來開發(fā)出一種環(huán)境友好、肥效持久的生物肥料。

1材料與方法

1.1藻種

固氮魚腥藻Anabaena azotica 119，由中國科學院武漢水生生物研究所提供，篩選分離自庫布其地區(qū)土壤。

1.2藻種培養(yǎng)基

采用BG11缺氮培養(yǎng)基。

1.3培養(yǎng)條件

在恒溫光照搖床中培養(yǎng)，光照：60 000～80 000 lx；光暗周期12 h—12 h；溫度：28 ℃；搖床轉(zhuǎn)速：150 r/min。培養(yǎng)基pH值：7.0～7.5；選擇1 L錐形瓶，每瓶裝液量0.5 L。

1.4固氮魚腥藻119顯微鏡觀察

用滴管吸取培養(yǎng)7 d的固氮魚腥藻119培養(yǎng)液，滴入事先準備好的載玻片上，輕輕蓋上蓋玻片，選擇10倍目鏡和40倍物鏡觀察。

1.5固氮魚腥藻119生長曲線測定

固氮魚腥藻在培養(yǎng)過程中會分泌多糖而出現(xiàn)藻之間團聚和貼壁現(xiàn)象，所以D值和細胞計數(shù)法研究藻的生長狀況并不適合。所以本研究采用如下方法測定其生長曲線：取1 L錐形瓶15個，洗凈，烘干，稱量，記錄瓶質(zhì)量。每瓶中加入 500 mL 培養(yǎng)基，接種量10%，放入光照搖床中培養(yǎng)，每2 d取樣，70 ℃烘箱中干燥至恒質(zhì)量。

1.6固氮魚腥藻氮含量測定

委托中國科學院武漢水生生物研究所檢測。

1.7小麥和西紅柿肥效試驗

選擇庫布其當?shù)厣惩裂b于直徑為18 cm的花盆中，分別以小麥和西紅柿為目標作物，施肥量以200 kg/hm2純氮[12-13]為基準換算，每個花盆施用純氮0.5 g。尿素組：每個花盆施用尿素1.1 g；羊糞組：羊糞含氮量為2.3%[14]，每個花盆施用羊糞21.7 g。藻肥組：需要累積施用干藻7 g，用培養(yǎng)22 d成熟的固氮魚腥藻119藻液，藻液含藻量 0.7 g/L，濃縮5倍，對植物進行澆灌，每次澆灌1 L，澆灌2次（中間相隔 3 d），尿素組和對照組用等量水澆灌。之后，對所有盆栽澆灌清水，每周2次，每次500 mL，生長時間為50 d。

1.8小麥、西紅柿干質(zhì)量、鮮質(zhì)量測定

取500 mL燒杯，洗凈、烘干、稱量，記錄杯質(zhì)量。剪取盆栽中生長50 d的小麥或西紅柿地上部分的全部生物質(zhì)，分別放入事先準備好的燒杯中，稱質(zhì)量，計算出質(zhì)量差，為小麥或西紅柿的鮮質(zhì)量。把盛有小麥或西紅柿的燒杯放入烘箱中，70 ℃烘干至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量，計算出質(zhì)量差，為小麥或西紅柿的干質(zhì)量。

1.9土壤氮含量測定

土壤氮含量采用半微量開氏法[15]測定。1.10藍藻和尿素肥料對土壤含氮量影響試驗設計

本試驗選擇的庫布其當?shù)氐纳惩?，土壤含氮?.017%。取直徑18 cm花盆，處理方法同“1.7”節(jié)中的尿素組和藻肥組。按時分別取尿素組和藻肥組花盆中2 cm深度的沙土，測定其土壤的總氮含量，測定方法見“1.9”節(jié)。

2結(jié)果與分析

2.1固氮魚腥藻119形態(tài)觀察

圖1是固氮魚腥藻119培養(yǎng)7 d后的光學顯微鏡照片。從照片可以看出：固氮魚腥藻119菌絲單一，細胞呈球形或圓柱形，異形固氮細胞明顯。異形細胞是藍藻固氮的場所[1]，藍藻在缺氮培養(yǎng)基中生長，自身需要的氮全部來自異形細胞固定大氣中的氮氣。培養(yǎng)22 d的固氮魚腥藻119含氮量為 7.2%（干質(zhì)量）。

2.2固氮魚腥藻119生長規(guī)律

固氮魚腥藻119生長速度較慢，需要22～24 d進入成熟期（圖2）。該藻在生長過程中伴隨大量胞外多糖產(chǎn)生，并團聚在一起。當該藻種作為肥料施用到土壤中，胞外多糖有助于細胞適應外部環(huán)境，進一步在土壤中繁殖。肥效試驗所用的藍藻肥料是培養(yǎng)22 d的固氮魚腥藻119，此時該藻種活性和生物量都比較高，作為藻肥的藍藻含氮量為7.2%（干質(zhì)量），培養(yǎng)22 d的生物量為0.7 g/L。

2.3固氮魚腥藻119作為生物肥料在小麥上的肥效

藍藻肥料澆灌后，會在土壤表面形成聚集，1周后會形成藍綠色的結(jié)皮，藻種會在土壤中繼續(xù)生長固定空氣中的氮氣，持續(xù)提供給小麥作物肥料。

從圖3中可以看出，50 d后，加入藍藻肥料的小麥更加茂密，顏色相對更綠，葉片較寬，基本沒有黃葉；對照組生長較慢，葉子很窄，顏色偏黃綠，植株很??；尿素組枯葉較多，植株已經(jīng)抽穗。從整個試驗來看，由于沙土肥力很差，15 d后對照基本停止生長；施用尿素化肥的小麥在前半個月相比于對照和藍藻肥料生長迅速，隨著肥力匱乏，到后期黃葉增多，40 d 后開始抽穗。藍藻肥料施用后半個月內(nèi)，相比于對照組差異不大。但半個月后肥效開始明顯體現(xiàn)。藍藻肥料特點為肥效比較緩慢，施用后期效果明顯，且肥力持久。原因在于藍藻固氮在細胞體內(nèi)完成，對作物供氮需要藍藻細胞死亡釋放或代謝釋放，所以比較緩慢。藍藻施用到土壤中后，部分藻體可以持續(xù)存活并利用光能繼續(xù)繁殖，體現(xiàn)到作物上表現(xiàn)為持久的肥效。

從圖4小麥試驗的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量對比可以看出，固氮魚腥藻肥料明顯優(yōu)于不施加肥料的對照組，鮮質(zhì)量為33.7 g，是對照組的3倍，干質(zhì)量為10.4 g，是對照組的2倍。藍藻肥料相比于尿素，鮮質(zhì)量和干質(zhì)量略低，從生長狀態(tài)來看，如果延長生長時間，藍藻肥料更有優(yōu)勢。對于小麥來說，固氮魚腥藻是非常好的生物肥料，基本可以代替氮肥尿素。

2.4固氮魚腥藻119作為生物肥料在西紅柿上的肥效

固氮魚腥藻肥料在西紅柿上的表現(xiàn)更為突出。從圖5可以看出，施用藍藻肥料的西紅柿植株明顯高于對照組和羊糞組，與尿素組高度相當，但枝多葉茂，更加粗壯。西紅柿等果實類作物，在生長周期中需要更多的肥料。一般種植過程中多采用農(nóng)家肥和化肥混合且多次施用。在沒有肥料的情況下，西紅柿秧苗生長基本停滯；尿素組在移栽后1個月內(nèi)一直長勢迅猛，后期開始乏力，秧苗較細；羊糞和藍藻組前期肥效都較慢，半個月后開始快速生長，羊糞組40 d后高度不再增加，而藻肥組持續(xù)生長，肥效非常顯著。

圖6是對西紅柿鮮質(zhì)量和干質(zhì)量的對比，施加藍藻肥料的西紅柿鮮質(zhì)量為87.7 g，是空白對照的15倍，是羊糞和尿素的2倍還多；藍藻肥料組干質(zhì)量為11.4 g，是空白對照組的14倍。說明藍藻肥料對于改良沙漠土壤效果十分明顯。固氮魚腥藻肥料在西紅柿中的表現(xiàn)完全優(yōu)于尿素和羊糞，可以代替現(xiàn)有的化學肥料。

2.5固氮魚腥藻肥料對土壤含氮量的影響

從圖7可以看出，尿素剛施入土壤中，土壤含氮量較高，達到0.083%，但之后迅速下降，3 d后下降到0.064%，6 d 后下降到0.055%。尿素剛施入土壤中氮含量較高，主要以水徑流和氣體揮發(fā)的形式損失[10]。之后土壤中氮含量下降緩慢。而固氮藍藻肥料相反，在剛施用階段土壤氮含量很低，只有0.023%，之后開始逐漸增加，到30 d土壤氮含量達到0066%，增速開始變緩，60 d后達到平衡點，氮含量為 0.073%。

“2.3”節(jié)試驗結(jié)果顯示，施用藍藻肥料的小麥15 d內(nèi)與對照組表現(xiàn)差別不大，原因在于藍藻施用15 d內(nèi)，土壤中的氮含量沒有很大改善。15 d后，施用藻肥的土壤氮含量快速增加，小麥開始快速生長?！?.3”節(jié)和“2.4”節(jié)的試驗結(jié)果都與本節(jié)試驗數(shù)據(jù)吻合。

施用藍藻肥料的土壤在90 d后，土壤含氮量可以維持在0.075%左右，而施用尿素的土壤在90 d后，土壤含氮量基本回到最初的水平。在本試驗選用的沙土中，施用藍藻肥料 90 d 后，土壤含氮量提高416%。

3結(jié)論與討論

固氮魚腥藻119在BG11缺氮培養(yǎng)基中22～24 d進入生長成熟期。成熟期的藻液可以直接或濃縮后作為肥料施用的土壤中，該藻可以在土壤中持續(xù)存活并生長，并不斷固定空氣中的氮氣，作為氮肥分泌到土壤中。

固氮魚腥藻肥料肥效比較緩慢，但十分持久。該肥料使用后15 d內(nèi)幾乎沒有效果，但15 d后作物生長好轉(zhuǎn)。生長 50 d 的小麥，藍藻肥料組鮮質(zhì)量是對照組的3倍，干質(zhì)量是對照組的2倍。生長50 d的西紅柿，藍藻肥組料的鮮質(zhì)量為87.7 g，是空白對照的15倍，是羊糞和尿素的2倍還多；藍藻肥料組干質(zhì)量為11.4 g，是空白對照組的14倍。藍藻肥料不僅可以應用在稻田中，在沙地中仍然有優(yōu)良的表現(xiàn)。驗證藍藻的田間肥效試驗，如何形成有效的藍藻養(yǎng)殖施肥模式和經(jīng)濟效益分析等方面，需要進一步研究。

施用藍藻肥料的土壤在90 d后，土壤含氮量可以維持在0.075%左右，而施用尿素的土壤在90 d后，土壤含氮量基本回到原始土壤含氮量水平。在本試驗選用的沙土中，施用藍藻肥料90 d后，土壤含氮量提高416%。該藻在土壤中的生長繁殖固氮規(guī)律和對土壤有機質(zhì)等方面的影響還有待進一步研究。

我國尿素化肥的利用率只有30%～40%，且對土壤和環(huán)境都有很大的負面作用[10]。藍藻肥料不但可以提供植物生長所需要的氮肥，而且能夠保持土壤含氮量長期保持較高水平，未來應用前景廣闊。

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