邢芳芳++高明夫++胡兆平++李新柱

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.132

摘要：從番茄根際采集的土壤中分離篩選得到12株產(chǎn)IAA的菌株，經(jīng)復(fù)篩獲得1株具有較好IAA生產(chǎn)能力的細(xì)菌，其發(fā)酵24 h產(chǎn)IAA水平達(dá)到48 mg/L以上，將其命名為HB-1。通過對(duì)菌株HB-1的16S rDNA序列分析對(duì)該菌進(jìn)行鑒定，并將菌株HB-1進(jìn)行液體發(fā)酵擴(kuò)繁，將得到的發(fā)酵液沖施白菜，試驗(yàn)其促生作用。結(jié)果表明，該高產(chǎn)IAA菌株為枯草芽孢桿菌。盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株HB-1對(duì)白菜生長具有明顯的促生作用，施加HB-1發(fā)酵液處理的葉綠素含量、葉片數(shù)均高于對(duì)照（CK）；HB-1發(fā)酵液處理的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量與沖施清水的CK相比都增加，鮮質(zhì)量增加 1.54～17.98 g，增幅達(dá)1.16%～13.55%，差異達(dá)到顯著水平，干質(zhì)量增加0.26～1.32 g，增幅達(dá)到2.97%～1492%。其中添加發(fā)酵液1.0 mL/盆的處理組效果較好，葉綠素含量比CK高5.02%，葉片數(shù)比CK高15.78%，鮮質(zhì)量較空白處理增加 17.98 g，增幅達(dá)13.55%，差異達(dá)極顯著水平，干質(zhì)量平均增加1.32 g，增幅達(dá)到14.92%。

關(guān)鍵詞：IAA；篩選；鑒定；枯草芽孢桿菌；促生作用

中圖分類號(hào)：S144文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）09-0458-03

收稿日期：2015-09-14

基金項(xiàng)目：山東省科技重大專項(xiàng)（新興產(chǎn)業(yè)）（編號(hào)：2015ZDXX0502B02）。

作者簡介：邢芳芳（1982—），女，山東臨沂人，碩士研究生，工程師，主要從事新型肥料研發(fā)及其施肥研究。Tel：（0539）7198803；E-mail：xingfangfang@kingenta.com。

通信作者：李新柱，博士研究生，工程師，主要從事新型肥料研發(fā)及其施肥研究。Tel：（0539）7198803；E-mail：lixinzhu@kingenta.com。植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，簡稱PGPR）是指能夠通過分泌有益物質(zhì)直接或間接促進(jìn)植物生長的細(xì)菌[1]。產(chǎn)生植物激素是根際促生細(xì)菌與植物相互作用的主要機(jī)制之一。吲哚乙酸（indole 3 aceticacid，簡稱IAA）是產(chǎn)生調(diào)節(jié)植物生長素的信號(hào)物質(zhì)，是在植物體內(nèi)普遍存在的生長素物質(zhì)[2]。自1977年科學(xué)家發(fā)現(xiàn)巴西固氮螺菌能合成IAA后，更多研究發(fā)現(xiàn)，土壤中約50%以上的細(xì)菌可以產(chǎn)生IAA[3]。篩選具有產(chǎn)生IAA的微生物可為促生生物肥料的研發(fā)等提供出發(fā)菌株。

本研究對(duì)番茄根際產(chǎn)IAA菌株進(jìn)行分離、鑒定及盆栽促生效果研究，以期為開發(fā)高效根際促生菌劑、生物肥料資源提供生物學(xué)支撐。

1材料與方法

1.1土壤樣品

在山東省壽光市采集同一區(qū)域內(nèi)生長情況良好的番茄根際范圍的土壤。采樣過程中，首先剝離土壤表面覆蓋的凋落物，然后剔除石塊等雜物，最后使用滅菌采樣鏟采集10～20 cm 深的土壤樣品裝于滅菌袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室后置于4 ℃冰箱保存，及時(shí)分離。

1.2培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：5.0g牛肉膏，10.0g蛋白胨，5.0 g NaCl，20.0 g瓊脂，加蒸餾水定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值為7.0～7.2，10 000 Pa滅菌30 min。

LB液體培養(yǎng)基[4]：10.0 g胰蛋白胨，5.0 g酵母提取物，10.0 g NaCl，pH值7.4，滅菌后用細(xì)菌過濾器加入L-色氨酸至濃度100 mg/L。

1.3儀器和試劑

主要儀器：Ultimate 3000高效液相色譜儀（美國Therom Fisher）、紫外檢測(cè)器VWD-3100（美國Therom Fisher）、恒溫振蕩搖床ZHTY-70（上海知楚儀器有限公司）、電熱恒溫培養(yǎng)箱BPX-272（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）。

主要試劑：Salkowski顯色液[5]，50 mL 35% HClO4+1 mL 0.5 mol/L FeCl3；IAA標(biāo)準(zhǔn)品；Sigma公司提供的HPLC試劑。

1.4菌株的分離

稱取土壤樣品10 g，加入帶玻璃珠并裝有100 mL無菌水的250 mL錐形瓶中，振蕩20 min，靜置10 min形成濃度為 0.1 g/mL 菌懸液，對(duì)此菌懸液進(jìn)行稀釋，依次得到10-2、10-3、10-4 g/mL等濃度的菌懸液。用稀釋平板法在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中分離其中的細(xì)菌，將分離所得菌株經(jīng)過純化轉(zhuǎn)接到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的試管斜面，保存于4 ℃冰箱中。

1.5產(chǎn)IAA菌株的篩選

1.5.1產(chǎn)IAA菌株的初篩將分離純化后的菌株接種于L-色氨酸濃度為100 mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min 條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h。取50 μL菌懸液滴于白色陶瓷板上，同時(shí)加入等量Salkowski顯色液進(jìn)行顯色反應(yīng)，以加入50 μL培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。白色陶瓷板于室溫、避光條件下放置30 min后觀察，顏色變紅者表示能夠產(chǎn)IAA。顏色越深，表示分泌的量越大，不變色為陰性，表示不能分泌IAA。

1.5.2定量復(fù)篩

1.5.2.1IAA標(biāo)準(zhǔn)液及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備標(biāo)準(zhǔn)液的制備：準(zhǔn)確稱取IAA（精確至0.001 mg）用流動(dòng)相定容，并進(jìn)行超聲處理數(shù)秒鐘使其充分溶解，轉(zhuǎn)移到棕色試劑瓶中，置于4 ℃冰箱備用。

制備具有一定濃度梯度的不同IAA溶液，按照所選擇的色譜條件進(jìn)樣20 μL，獲得不同濃度時(shí)IAA的峰面積。根據(jù)峰面積（y）和對(duì)應(yīng)的IAA標(biāo)準(zhǔn)品濃度（x，mg/kg）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得出線性方程、相關(guān)系數(shù)。

1.5.2.2菌液中IAA濃度的測(cè)定活化待測(cè)菌株，接種于LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后取出，8 000 r/min離心 15 min，然后取各上清液過微孔濾膜，待儀器穩(wěn)定后，用微量進(jìn)樣器進(jìn)樣，進(jìn)樣量為20 μL。根據(jù)標(biāo)樣中各組分的保留時(shí)間確定樣品中的IAA組分，并根據(jù)峰面積計(jì)算IAA含量。

1.6產(chǎn)IAA菌株白菜盆栽試驗(yàn)

1.6.1試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)試驗(yàn)于2015年1—3月在山東金正大生態(tài)工程集團(tuán)股份有限公司研發(fā)中心的智能玻璃溫室中進(jìn)行。

1.6.2試驗(yàn)材料供試白菜（Brassica campestris L.）品種為蘇州青，種子由山東昌邑市蔬菜研究所提供；供試底肥為氮 ∶磷 ∶鉀=15 ∶15 ∶15的硝基復(fù)混肥；供試土壤為棕壤，有機(jī)質(zhì)含量12.3 g/kg。

1.6.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)共5個(gè)處理（表1），每個(gè)處理4盆，每盆裝土5 kg，硝基復(fù)混肥作為底肥1次性施入土壤，每盆施入1.33 g。白菜2葉1心時(shí)間苗，每盆保留生長一致、均勻分布的4株作為試驗(yàn)株，管理措施一致?？瞻捉M接種清水為對(duì)照（CK1），處理組接種菌株的發(fā)酵液（108 CFU/mL）。處理1在盆栽中接種0.5 mL滅活菌株發(fā)酵液（T1），處理2接種 0.5 mL 未滅活菌株發(fā)酵液（T2），處理3在盆栽中接種 1.0 mL 滅活菌株發(fā)酵液（T3），處理4接種1.0 mL未滅活菌株發(fā)酵液（T4）。每組設(shè)4個(gè)重復(fù)試驗(yàn)，重復(fù)接種2次，間隔為15 d，其間適時(shí)定量澆水，試驗(yàn)周期58 d。收獲時(shí)測(cè)定葉片SPAD值、葉片數(shù)和鮮質(zhì)量、干質(zhì)量[6-7]。

1.6.4葉片數(shù)、生理指標(biāo)測(cè)定葉片數(shù)的統(tǒng)計(jì)只選擇綠色可食用部分；SAPD值測(cè)定采用SPAD-502Plus型葉綠素儀；干質(zhì)量測(cè)定按常規(guī)方法進(jìn)行[8]。

1.6.5數(shù)據(jù)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行處理，利用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及差異顯著性分析。

1.716SrDNA序列分析鑒定

IAA產(chǎn)生細(xì)菌16S rDNA PCR擴(kuò)增參考謝永麗等的方法[9]。將16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后測(cè)序，測(cè)序所得序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)。

2結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)IAA細(xì)菌的分離和篩選

分離純化得到細(xì)菌共計(jì)38株，初篩12株產(chǎn)IAA的菌株，經(jīng)過定性初篩和定量復(fù)篩，獲得1株具有較好的產(chǎn)IAA能力的細(xì)菌，其發(fā)酵24 h產(chǎn)IAA水平達(dá)到48 mg/L以上，將其命名為HB-1。

2.2菌株HB-1的室內(nèi)促生試驗(yàn)

2.2.1菌株HB-1對(duì)白菜葉綠素含量、葉片數(shù)的影響從圖1看出，在SPAD值上，各菌劑處理均高于CK，最高的是T4處理，比CK高5.02%，且差異極顯著（P<0.01），其次是T2處理，比CK高2.97%，差異明顯。從葉片數(shù)來看，各處理均高于CK，且差異明顯，其中T4處理比CK高15.78%，且差異極顯著（P<0.01）。

2.2.2菌株HB-1對(duì)白菜鮮質(zhì)量、干質(zhì)量的影響圖2顯示，所有菌劑處理的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量較沖施清水的對(duì)照（CK）相比都增加，與CK相比，添加HB-1發(fā)酵液的各個(gè)處理鮮質(zhì)量增加1.54～17.98 g，增幅達(dá)到1.16%～13.55%，差異達(dá)到顯著水平，其中施加1.0 mL/盆等體積發(fā)酵液較滅活發(fā)酵液鮮質(zhì)量增加11%；添加HB-1發(fā)酵液的各個(gè)處理干質(zhì)量增加0.26～1.32 g，增幅達(dá)到2.97%～14.92%，其中未滅活的T4處理干質(zhì)量、鮮質(zhì)量增幅最高，與CK相比鮮質(zhì)量平均增加 17.98 g，增幅達(dá)到13.55%，差異達(dá)到極顯著水平，干質(zhì)量平均增加1.32 g，增幅達(dá)到14.92%，差異達(dá)到極顯著水平。滅活的發(fā)酵液處理T1、T3較清水對(duì)照也有不同程度的增產(chǎn)，分析原因，可能是發(fā)酵液中殘留養(yǎng)分促進(jìn)了白菜生長。結(jié)果表明，在施加底肥的基礎(chǔ)上施用HB-1發(fā)酵液，可以顯著提高白菜的生物產(chǎn)量。

2.316S rDNA測(cè)定結(jié)果

對(duì)菌株HB-1的16S rDNA基因部分序列進(jìn)行BLAST

比對(duì)，利用MEGA 4.1的Neighbor-Joining軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。由圖3遺傳距離可知，菌株HB-1與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的同源性最高（99.7%），與其他菌株的遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)，可以確定菌株HB-1是1株枯草芽孢桿菌。

3討論與結(jié)論

從番茄根際土壤中分離篩選獲得1株具有較好產(chǎn)IAA能力的革蘭氏陽性菌株HB-1，其發(fā)酵24 h產(chǎn)IAA水平達(dá)到48 mg/L以上。通過將其培養(yǎng)后的發(fā)酵液進(jìn)行白菜的促生試驗(yàn)表明，與沖施清水的處理相比，沖施滅活HB-1發(fā)酵液與未滅活發(fā)酵液對(duì)白菜均有促生作用，施加HB-1發(fā)酵液的處理葉綠素含量、葉片數(shù)均高于對(duì)照（CK）；鮮質(zhì)量、干質(zhì)量較CK相比都增加，鮮質(zhì)量增加1.54～17.98 g，增幅達(dá)到116%～13.55%，差異達(dá)到顯著水平；干質(zhì)量增加0.26～1.32 g，增幅達(dá)到2.97%～14.92%。沖施1.0 mL未滅活發(fā)酵液處理較空白處理鮮質(zhì)量可提高13.55%，差異達(dá)到極顯著水平；沖施0.5 mL未滅活發(fā)酵液處理較空白處理鮮質(zhì)量可提高6.48%，差異達(dá)到顯著水平。試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株HB-1具有較強(qiáng)的促生作用。通過對(duì)菌株的16S rDNA序列的測(cè)定和分析，鑒定菌株HB-1為枯草芽孢桿菌。

枯草芽孢桿菌HB-1具有較好的產(chǎn)IAA能力，因?yàn)榭莶菅挎邨U菌具有非常好的生產(chǎn)性能及抗逆、定植能力，因此該菌株篩選為功能微生物肥料的研發(fā)提供了較好的選擇。

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