蔣苑++劉莉++呂春芳++陳國(guó)祥+++高志萍+++呂川根

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.031

摘要：以水稻葉色突變體812HS與野生型812S為材料，利用藍(lán)綠溫和膠電泳技術(shù)和生理方法對(duì)葉尖端類囊體膜蛋白質(zhì)復(fù)合物含量以及葉綠素合成前體物質(zhì)進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，和野生型812S相比，水稻葉色突變體812HS在分蘗盛期葉綠素含量開始明顯減少，葉綠素a/葉綠素b比值增加，突變體的類囊體膜蛋白質(zhì)復(fù)合物如光系統(tǒng)Ⅱ捕光色素蛋白（LHCⅡ）含量、光系統(tǒng)Ⅰ核心復(fù)合體（PSⅠcore）含量和F1-ATP合酶復(fù)合體和細(xì)胞色素b6/f復(fù)合體（F1-ATPase&Cy tb6/f）含量顯著減少。突變體812HS葉片葉綠素合成代謝中間產(chǎn)物5-氨基酮戊酸（ALA）、膽色素原（PBG）、尿卟啉原Ⅲ（Urogen Ⅲ）含量均顯著高于野生型812S，而原卟啉Ⅸ（ProtoⅨ）、鎂原卟啉Ⅸ（Mg-ProtoⅨ）、原脫植基葉綠素（Pchlide）、Chla、Chlb含量卻顯著低于野生型812S。即水稻葉色突變體812HS的葉綠素含量明顯減少，一方面是由于囊體膜蛋白質(zhì)復(fù)合物的減少影響了其對(duì)光的吸收和傳遞；另一方面通過(guò)測(cè)定葉綠素合成的前體物質(zhì)初步認(rèn)為是由于葉綠素合成過(guò)程中UrogenⅢ到ProtoⅨ合成過(guò)程受阻所致。

關(guān)鍵詞：水稻葉色突變體812HS；類囊體膜蛋白質(zhì)復(fù)合物；葉綠素前體合成物質(zhì)；水稻

中圖分類號(hào)： S511.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）10-0127-05

收稿日期：2015-10-08

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31271621）；江蘇省普通高校自然科學(xué)研究計(jì)劃（編號(hào)：14KJB180011）；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程（編號(hào)：PAPD）；江蘇省自然科學(xué)青年基金（編號(hào)：BK20140916）；江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心資助。

作者簡(jiǎn)介：蔣苑（1992—），女，江蘇徐州人，碩士研究生，主要從事植物光合生理生化研究。E-mail：jiangyuan_2016@163.com。

通信作者：高志萍，女，博士，講師，主要從事植物光合生理生化研究。E-mail：ketty.gao@gmail.com 。綠色植物吸收光能同化二氧化碳和水，制造有機(jī)物質(zhì)并釋放氧氣的過(guò)程稱為光合作用。植物通過(guò)光合作用將光能轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)能儲(chǔ)藏在有機(jī)物中，葉綠素作為光合作用的重要色素，它的功能不僅是構(gòu)成光系統(tǒng)及光系統(tǒng)反應(yīng)中心[1]，吸收大量光能[2]，也是大多數(shù)植物葉片呈現(xiàn)綠色的主要原因，因此它對(duì)植物的生長(zhǎng)及農(nóng)作物產(chǎn)量具有極其重要的作用。正常葉色是植物長(zhǎng)期進(jìn)化的結(jié)果，而葉色突變也是植物界中發(fā)生頻率相對(duì)較高的一種突變類型，在20世紀(jì)初就已經(jīng)有關(guān)于葉色突變體的報(bào)道[3]。目前已經(jīng)在多個(gè)植物中獲得了葉色突變體，如水稻[4]、小麥[5]、煙草[6]、玉米[7]等。葉色突變體有著極為重要的作用，在育種工作中，葉綠素突變體既可以作為標(biāo)記性狀進(jìn)行雜交生產(chǎn)[8]，又可以作為特殊的優(yōu)良性狀提供資源[9]，在基礎(chǔ)研究工作中，葉色突變體是研究植物光形態(tài)建成[10]、植物激素生理[11]、光合作用[12]等研究的理想材料。

水稻葉色突變類型是葉色突變體中比較豐富的一種，主要特征是其葉色表型發(fā)生了變異，表現(xiàn)為不正常的綠色，如白化、黃化、黃葉尖、斑馬葉等。其產(chǎn)生方法除了自發(fā)突變外，其他突變來(lái)源主要為物理化學(xué)誘變[13]、T-DNA插入突變[14]和轉(zhuǎn)座子插入突變[15]。水稻葉色突變類體的突變基因遍及水稻整個(gè)基因組中，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，已定位的葉色突變基因有70多個(gè)[16]。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，對(duì)于水稻葉色突變相關(guān)基因的克隆也逐漸成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，如編碼高等植物的葉綠素合成途徑中酶的基因已經(jīng)被全部克隆[17]。

本研究所用的水稻葉色突變體812HS是秈稻兩用不育系水稻812S的一個(gè)自然突變體，該突變體812HS在秧苗期葉片正常綠色，分蘗盛期—拔節(jié)期，特別是梅雨期過(guò)后，葉片尖端出現(xiàn)非常明顯的發(fā)黃現(xiàn)象，但是下面的葉子表現(xiàn)為正常的綠色，之后812HS新出的葉片尖端發(fā)黃現(xiàn)象減弱，比正常水稻葉片顏色稍淡，但之前發(fā)黃的葉片尖端不再恢復(fù)綠色，這種現(xiàn)象不同于以往的葉片早衰現(xiàn)象。但是它也導(dǎo)致葉片的光合效率下降，進(jìn)而影響水稻光合生產(chǎn)和產(chǎn)量形成。因此本研究以水稻葉色突變體812HS與野生型812S為材料，對(duì)其類囊體膜蛋白質(zhì)復(fù)合物和葉綠素合成代謝中間產(chǎn)物進(jìn)行比較研究，揭示此突變體葉片尖端變化的機(jī)理及其對(duì)光系統(tǒng)色素蛋白的影響，為進(jìn)一步深入探索葉色變異的生化和分子調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

水稻葉色突變體812HS和野生型812S由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所提供，5月初播種，6月上旬栽插，按照水稻常規(guī)的種植方法進(jìn)行管理。待劍葉全展后，每隔10 d左右采集功能葉，只采發(fā)黃的尖端葉片，采樣從2014年7月14日開始，到8月24日結(jié)束，共采樣5次，每次測(cè)定重復(fù)3次。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1葉綠素含量的測(cè)定光合色素含量測(cè)定參照Arnon的方法[18]稍作修改，稱取去脈的新鮮水稻尖端葉片 0.1 g，加入80%的丙酮和少許石英砂提取，離心2次后定容至10 mL，利用Thermo GENESYS 10UV紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定其在D663 nm、D645 nm處的吸光度，用于計(jì)算葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量。

1.2.2藍(lán)綠溫和膠電泳

1.2.2.1類囊體膜蛋白的制備取去除中脈的水稻劍葉剪碎，加入適量預(yù)冷的提取緩沖液（400 mmol/L蔗糖，50 mmol/L Tris-HCl，pH值7.6，10 mmol/L NaCl），用高速組織搗碎機(jī)進(jìn)行5次3 s搗碎，4層紗布過(guò)濾，200 g離心3 min去除細(xì)胞碎片；取上清6 000 g離心10 min，棄上清，將沉淀懸浮于50 mmol/L Tris-HCl、pH 值7.6、10 mmol/L NaCl溶液中5 min以去除蔗糖；6 000 g離心10 min，棄上清，沉淀加入適量樣品緩沖液（25 mmol/L BisTris-HCl，20% Glycerol，pH 值7.0）懸浮，6 000 g離心10 min，得到的沉淀加入少量樣品緩沖液懸?。?5 mmol/L BisTris-HCl，20% Glycerol，pH 值 7.0）即得到類囊體膜蛋白溶液。用Bradford法測(cè)定蛋白濃度，然后分裝進(jìn)行處理或者-80 ℃保存?zhèn)溆谩?

1.2.2.2樣品增溶類囊體膜蛋白溶液緩慢滴加等體積質(zhì)量濃度為3%的DM，充分混勻黑暗下冰上增溶30 min，16 000 g 離心20 min去除不溶物質(zhì)，取上清加入1/10體積的溶液（5% 考馬斯亮藍(lán)G-250，100 mmol/L BisTris-HCl，pH值 7.0，30%蔗糖，500 mmol/L 6-aminon-caproicacid）后混勻，上樣進(jìn)行電泳。

1.2.2.3溫和電泳采用北京六一生物科技有限公司DYCZ-23A型電泳槽，配制厚度1.0 mm凝膠，5%～13%梯度的分離膠和4%的濃縮膠，凝膠中含有50 mmol/L BisTris，pH 值7.0，500 mmol/L 6-aminon-caproicacid，4 ℃保存過(guò)夜，第2天進(jìn)行電泳。電泳開始時(shí)電極緩沖液為含0.01%考馬斯亮藍(lán)G-250、50 mmol/L Tricine、15 mmol/L BisTris的陰極緩沖液和含 50 mmol/L BisTris-HCl、pH 值7.0的陽(yáng)極緩沖液。在4 ℃條件下，當(dāng)前端考馬斯亮藍(lán)G-250走至分離膠的1/2處時(shí)，陰極端換為不含考馬斯亮藍(lán)的陰極緩沖液。

1.2.3葉綠素前體物質(zhì)的測(cè)定

1.2.3.15-氨基酮戊酸（ALA）的測(cè)定參照Dei的方法[19]略有改動(dòng)，稱取0.5 g尖端葉片，在液氮中研磨，加入質(zhì)量濃度為4%的三氯乙酸，定容至20 mL，18 000 g離心 15 min，取5 mL上清液加入2.35 mL乙酸鈉（1 mol/L）和015 mL乙酰丙酮，沸水10 min后冷卻至室溫。取其中的 2 mL 加入2 mL顯色液（Ehrlich-Hg試劑），黑暗下15 min后，測(cè)D553 nm值，ALA含量以D553 nm的摩爾消光系數(shù)7.2×104 L/（mol·cm）計(jì)算。

1.2.3.2膽色素原（PBG）的測(cè)定參考Bogorad的方法[20]提取，取0.5 g尖端葉片用液氮研磨后，加入5 mL提取緩沖液（0.6 mol/L Tris，0.1 mol/L EDTA，pH值 8.2），18 000 g離心10 min。取2 mL加入2 mL Ehrlich-Hg試劑，黑暗中顯色15 min，測(cè)D553 nm，PBG含量以D553 nm的摩爾消光系數(shù)6.1×104 L/（mol·cm）計(jì)算。

1.2.3.3尿卟啉原Ⅲ（Urogen Ⅲ）測(cè)定參考Bogorad的方法[20]提取，取0.5 g尖端葉片用液氮研磨后，加入10 mL提取緩沖液，過(guò)濾或18 000 g離心10 min。取5 mL加入0.25 mL 1%的Na2S2O3溶液，再用強(qiáng)光照射20 min。加入1 mol/L甲酸（或乙酸）至pH值3.5。用10 mL乙醚萃取3次，分層后測(cè)水相的D405.5 nm，得Urogen Ⅲ。Urogen Ⅲ含量以D405.5 nm的摩爾消光系數(shù)5.48×105 L/（mol·cm）計(jì)算。

1.2.3.4原卟啉Ⅸ（ProtoⅨ）、鎂原卟啉Ⅸ（Mg-ProtoⅨ）、原脫植基葉綠素（Pchlide）的測(cè)定采用Hodgins等的方法[21]略有改動(dòng)，取0.5 g去葉脈鮮葉，加25 mL 80%堿性丙酮，研磨提取后，分別在波長(zhǎng)D575 nm、D590 nm和D628 nm處測(cè)得吸光度，并以下列公式計(jì)算其含量。

ProtoⅨ含量=0.180 16×D575 nm-0.040 36×D628 nm-0.045 15×D590 nm；

Mg-ProtoⅨ含量=0.060 77×D590 nm-0.019 37×D575 nm -0003 423×D628 nm；

Pchlide含量=0.035 63×D628 nm+0.007 225×D590 nm-0003 423×D628 nm。

2結(jié)果與分析

2.1葉色表型及葉綠素含量的變化

和野生型812S相比，水稻突變體812HS劍葉的尖端從7月24日（水稻分蘗盛期）開始出現(xiàn)顯著的尖端發(fā)黃現(xiàn)象（圖1），并且在后期發(fā)黃現(xiàn)象更加明顯。由圖2葉綠素含量可以看出，在7月14日突變體812HS和野生型812S總?cè)~綠素含量相差不大，而到7月24日，突變體812HS葉綠素含量比野生型少26.2%，差異顯著（P<0.05），以后各個(gè)時(shí)期突變體812HS葉綠素含量比野生型分別低35.4%、36.8%、27.9%，這和突變體的葉色表型相符。而圖2的葉綠素a/葉綠素b比值顯示在7月14日和7月24日期間，突變型812HS葉片葉綠素a/葉綠素b比值與野生型無(wú)顯著差異，8月4日、8月14日和8月24日，突變型812HS葉片葉綠素a/葉綠素b比值比野生型分別高26.9%、26.2%、31.6%，差異顯著 （P<0.05），這表明在突變體812HS中葉綠素b的降解速度較葉綠素a降解更快。

2.2藍(lán)綠溫和膠電泳分析突變體蛋白質(zhì)復(fù)合物的變化

利用藍(lán)綠溫和膠電泳技術(shù)，分別選取了7月14日、8月4日和8月24日的葉片尖端進(jìn)行電泳，并對(duì)不同時(shí)期突變體812HS和野生型812S的葉綠體類囊體膜蛋白復(fù)合物各亞基變化進(jìn)行了分析。結(jié)果從突變體812HS和野生型812S的葉綠體類囊體膜中分離出7條類囊體膜蛋白復(fù)合體帶。利用 Bio-Rad Quantity One V4.6.2對(duì)圖像預(yù)測(cè)分子量，參考Shao等的研究[22]鑒別各復(fù)合物條帶，分別為超級(jí)復(fù)合物（Supercomplexes）、光系統(tǒng)Ⅰ與捕光復(fù)合物Ⅰ（PSI core+LHC Ⅰ）、光系統(tǒng)Ⅰ核心復(fù)合體（PSⅠ core）、F1-ATP合酶復(fù)合體

&細(xì)胞色素b6/f復(fù)合體（F1-ATPase & Cytb6/f）、光系統(tǒng)Ⅱ核心（PSⅡ core）、三聚體捕光復(fù)合物Ⅱ（Trimeric LHC Ⅱ）、單體捕光復(fù)合物Ⅱ（Monomeric LHC Ⅱ）（圖3）。

將突變體812HS與野生型812S類囊體膜蛋白質(zhì)復(fù)合物含量經(jīng)過(guò)Bio-Rad Quantity One V4.6.2軟件分析條帶的光密度，以野生型812S水稻各時(shí)期的蛋白質(zhì)復(fù)合物含量為100%，換算出突變體812HS中各蛋白質(zhì)復(fù)合物含量的百分?jǐn)?shù)（圖4）。結(jié)果顯示和野生型812S相比，在7月14日突變體812HS含量下降顯著的是光系統(tǒng)Ⅰ核心復(fù)合體（PSⅠ core）、F1-ATP合酶復(fù)合體&細(xì)胞色素b6/f復(fù)合體（F1-ATPase & Cytb6/f）、三聚體捕光復(fù)合物Ⅱ（Trimeric LHCⅡ）和單體捕光復(fù)合物Ⅱ（Monomeric LHCⅡ），分別為野生型的 74.7%、70.5%、75.3%和69.5%。8月4日突變體812HS含量下降的顯著仍然是這4個(gè)，分別是野生型的73.9%、657%、72.6%、和75.7%。而8月24日，突變體812HS含量下降顯著的是F1-ATP合酶復(fù)合體&細(xì)胞色素b6/f復(fù)合體（F1-ATPase & Cytb6/f），是野生型的64.5%。

2.3水稻葉色突變體812HS與野生型812S葉片葉綠素合成代謝中間產(chǎn)物含量比較

為進(jìn)一步探討突變體812HS葉片尖端葉綠素含量減少的生理原因，對(duì)尖端葉片的葉綠素前體物質(zhì)ALA、PBG、UrogenⅢ、Proto Ⅸ、Mg-Proto Ⅸ和Pchlide的相對(duì)含量進(jìn)行了測(cè)定（設(shè)野生型812S各物質(zhì)的含量為100%，突變體812HS中各物質(zhì)的含量換算成野生型各物質(zhì)的百分?jǐn)?shù)），結(jié)果見(jiàn)圖5。根據(jù)結(jié)果顯示，在各時(shí)期突變體812HS葉片葉綠素合成代謝中間產(chǎn)物ALA、PBG、Urogen Ⅲ含量均顯著高于野生型，而中間產(chǎn)物ProtoⅨ、Mg-Proto Ⅸ、Pchlide、Chla、Chlb含量卻顯著低于其野生型。這表明突變體812HS葉綠素的生物合成可能在UrogenⅢ到ProtoⅨ合成過(guò)程受到了阻抑，葉綠素生物合成代謝受阻導(dǎo)致了突變體812HS葉片的葉綠素含量減少。

3討論

葉綠素作為植物進(jìn)行光合作用的主要色素，含量的高低直接影響植物的光合速率[23]。葉綠素在植物體內(nèi)都不是單獨(dú)存在，都是以葉綠素-蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合于類囊體膜上，是進(jìn)行光合作用的光系統(tǒng)Ⅰ和光系統(tǒng)Ⅱ的重要組成部分。其中葉綠素a主要存在于光系統(tǒng)Ⅰ和光系統(tǒng)Ⅱ的核心復(fù)合體中，而葉綠素b是構(gòu)成捕光天線復(fù)合體的重要組成部分[24]。當(dāng)葉綠素缺乏時(shí)，會(huì)影響到各種色素蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)[25]，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致光系統(tǒng)受到破壞、電子傳遞效率降低[26]。本試驗(yàn)中突變體812HS的葉綠素含量在7月24日以后開始大幅減少，導(dǎo)致了突變體對(duì)于光能的吸收和傳遞能力下降從而降低了光合效率。葉綠素a/葉綠素b的結(jié)果表明突變體812HS葉綠素b在生育期更快速減少，可以推測(cè)在光合膜相關(guān)色素蛋白復(fù)合物中，捕光天線降解較多，在后來(lái)的分離類囊體膜蛋白復(fù)合物試驗(yàn)中驗(yàn)證了這種猜想。

試驗(yàn)利用溫和藍(lán)綠膠技術(shù)提取類囊體膜蛋白復(fù)合物，該技術(shù)能在不破壞蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)的前提下，將蛋白質(zhì)復(fù)合物以近似天然的狀態(tài)分開[27]，同時(shí)在試驗(yàn)技術(shù)方面進(jìn)行了一定的改良，一方面大大減少了水稻蛋白提取時(shí)間，同時(shí)采用小膠板配膠提高了效率。最終試驗(yàn)成功分離到了7條帶，并將突變體812HS和野生型812S尖端葉片的類囊體膜蛋白復(fù)合物和葉綠素含量進(jìn)行比較。發(fā)現(xiàn)在7月14日和8月4日，隨著葉綠素含量的減少，突變體蛋白復(fù)合物尤其是光系統(tǒng)Ⅰ核心復(fù)合體，F(xiàn)1-ATP合酶復(fù)合體&細(xì)胞色素b6/f復(fù)合體，三聚體捕光復(fù)合物Ⅱ和單體捕光復(fù)合物Ⅱ下降較為明顯。

光系統(tǒng)Ⅱ主要是由反應(yīng)中心、捕光復(fù)合體Ⅱ和放氧復(fù)合體等亞單位組成，分布在類囊體基粒片層的垛疊區(qū)[28]。捕光復(fù)合體Ⅱ結(jié)合了類囊體膜上50%的色素，天然生理狀態(tài)主要以三聚體存在，離體后會(huì)出現(xiàn)解聚[29]，主要功能是捕獲和傳遞光能，將產(chǎn)生的電子傳遞給脫鎂葉綠酸，最終還原質(zhì)醌[30]。突變體812HS的三聚體捕光復(fù)合物Ⅱ和單體捕光復(fù)合物Ⅱ都有不同程度的降解，這必然會(huì)影響葉片對(duì)光能的轉(zhuǎn)化效率。光系統(tǒng)Ⅰ核心復(fù)合體是組成光系統(tǒng)Ⅰ的重要部分，光系統(tǒng)Ⅰ催化光形成電子從質(zhì)體藍(lán)素經(jīng)過(guò)一系列電子傳遞體給鐵氧還蛋白Fd[31]。突變體光系統(tǒng)Ⅰ核心復(fù)合體的降解影響了葉片的光系統(tǒng)Ⅰ功能。F1-ATP合酶復(fù)合體對(duì)于葉綠體光能轉(zhuǎn)化和光系統(tǒng)Ⅱ有著密切關(guān)聯(lián)[32]，而細(xì)胞色素b6/f復(fù)合體是光能電子傳遞的重要蛋白復(fù)合體[33]。總之，這些類囊體膜蛋白復(fù)合物含量的減少意味著突變體的光合效率大大減少。陳熙等對(duì)水稻低葉綠素b突變體ZH249-Y的類囊體膜進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，突變體LHCⅠ的比野生型有顯著下降，同時(shí)突變體LHCⅡ各組分較野生型均有下降[34]。李光榮等對(duì)水稻高葉綠素突變體的類囊體膜蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，突變體LHCⅡ三聚體和LHCⅡ單體都明顯高度表達(dá)，具有更高水平的LHC蛋白[35]。

在高等植物葉綠素的合成依下列途徑進(jìn)行：Glu→ALA→PBG→UrogenⅢ→ProtoⅨ→Mg-protoⅨ→Pchlide→葉綠素a→葉綠素b[36]，這是一系列酶學(xué)催化過(guò)程，任何一個(gè)合成步驟受阻，受阻以前的物質(zhì)會(huì)積累，受阻步驟以后的物質(zhì)會(huì)減少，從而改變了葉綠體中各種色素的比例，引起了葉色的改變，不同的突變體阻礙的步驟不同。徐培洲等以葉綠素缺乏突變體水稻為材料研究其葉綠素的合成特性，發(fā)現(xiàn)突變體葉綠素缺乏的原因是原脫植基葉綠素到脫植基葉綠素的合成受阻所致[37]。本研究通過(guò)測(cè)定葉綠素合成前體物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)突變體812HS的ALA、PBG、UrogenⅢ含量明顯積累，而中間產(chǎn)物ProtoⅨ、Mg-ProtoⅨ、Pchlide、葉綠素a、葉綠素b含量卻顯著低于其野生型，因此初步認(rèn)定是UrogenⅢ到ProtoⅨ合成過(guò)程受阻導(dǎo)致葉綠素不能正常合成。葉綠素的降低導(dǎo)致類囊體膜蛋白復(fù)合物不能正常形成，而類囊體膜蛋白復(fù)合物的減少反過(guò)來(lái)又影響了葉片光系統(tǒng)Ⅰ和光系統(tǒng)Ⅱ?qū)τ诠獾牟东@和吸收。本研究結(jié)果表明，突變體812HS葉綠素含量的降低是由于糞卟啉原Ⅲ（UrogenⅢ）到原卟啉Ⅸ（ProtoⅨ）的合成受阻，并導(dǎo)致了類囊體膜蛋白復(fù)合物的降解，這將為進(jìn)一步深入探索突變體812HS葉色變異的生化和分子調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

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