錢荷英++李剛++何慶玲++羅旭芳++徐安英

摘要：首先在GenBank中下載蓖麻蠶核型多角體（PhcyNPV）全基因組序列，通過生物信息學(xué)的方法預(yù)測表明，PhcyNPV 基因組中有142條miRNA成熟體分子；再用miRanda、RNAhybird 2個軟件預(yù)測miRNAs對病毒自身的靶基因，提取有共同交集的33條miRNA。用PhcyNPV感染蓖麻蠶，取感病蓖麻蠶的脂肪體組織，提取總RNA；用逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR，簡稱RT-PCR）驗證有共同交集的33條miRNA，確定其中6條為miRNA成熟體序列，分別是Phcy-miR-996_5p、Phcy-miR-696-5P、Phcy-miR-664_3p、Phcy-miR-30_5p、Phcy-miR-217_5p、Phcy-miR-1483_3p。這6條可能的miRNA對應(yīng)的靶基因涉及病毒的融合蛋白、多角體蛋白等結(jié)構(gòu)蛋白，以及一些蛋白激酶包括激活解旋酶表達(dá)的極早期基因等，推測其潛在的靶基因參與病毒復(fù)制及侵染的重要過程。

關(guān)鍵詞：蓖麻蠶；核型多角體病毒；miRNA；生物信息學(xué)

中圖分類號： S885.25文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）10-0053-09

收稿日期：2015-09-02

基金項目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（編號：CARS-22）。

作者簡介：錢荷英（1971—），女，江蘇溧陽人，博士，副研究員，主要從事家蠶遺傳育種與分子生物學(xué)研究。E-mail：qianheying123@163.com。

通信作者：徐安英，研究員，主要從事家蠶遺傳育種與種質(zhì)資源研究。E-mail：srixay@126.com。

[ZK）]

miRNA是一類大小約22 nt的單鏈小分子RNA，由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的長約70～90個堿基的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工得到，能夠和互補(bǔ)或部分互補(bǔ)的靶mRNA的3′末端非翻譯區(qū)（3′-UTR）結(jié)合，選擇性降解mRNA或抑制基因翻譯[1]。自miRNA被發(fā)現(xiàn)以來，迅速成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點，因此開展miRNA的研究將對轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控領(lǐng)域的發(fā)展產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。

病毒miRNA產(chǎn)生過程與其他生物類似，其成熟miRNA大小和結(jié)構(gòu)也與其他生物的miRNA一致。病毒miRNA不僅可調(diào)節(jié)自身基因的表達(dá)，利于病毒復(fù)制及潛伏感染，還能調(diào)節(jié)宿主基因的表達(dá)并因此逃避宿主的免疫作用[2]。目前有關(guān)病毒miRNA的研究主要是關(guān)于哺乳動物的病毒，在昆蟲病毒方面鮮有研究，僅有棉鈴蟲夜蛾囊泡病毒（HvAV）和家蠶核型多角體病毒（BmNPV）有報道，前者編碼的miRNA可以抑制病毒DNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄從而調(diào)控病毒自身的復(fù)制[3]，后者的miRNA功能尚未得到確鑿的試驗驗證[4-5]。

蓖麻蠶是我國的三大絹絲昆蟲之一，其核型多角體病毒病是生產(chǎn)中最常見的傳染病，具有發(fā)病快、傳染性強(qiáng)的特點，是制約蓖麻蠶產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一大因素。蓖麻蠶核型多角體病毒（PhcyNPV）基因組已被解析[6]，但尚未見關(guān)于PhcyNPV的miRNA報道。本研究以期通過生物信息學(xué)方法對PhcyNPV編碼的miRNA進(jìn)行預(yù)測，并進(jìn)行試驗驗證，為探索PhcyNPV的感染機(jī)制及建立相關(guān)的診斷、治療方法提供一定的分子生物學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1蓖麻蠶及其核型多角體病毒蓖麻蠶品種B21、蓖麻蠶核型多角體病毒（PhcyNPV）均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所保存。

1.1.2質(zhì)粒與菌種T克隆質(zhì)粒載體pMD18-T、大腸桿菌受體菌株購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3工具酶及相關(guān)試劑T4 DNA連接酶、蛋白酶K、高保真Taq酶、DNaseⅠ （RNase free）、DNA marker、PrimeScriptTM RT Enzyme Mix Ⅰ、質(zhì)粒提取試劑盒，均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；QIAEXⅡGel Extraction Kit，購自 TaKaRa 公司；TRIzol Reagent，購自Promege公司；其他化學(xué)試劑均為分析純，購自生工生物工程（上海）股份有限公司或國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.4主要分析軟件及網(wǎng)站本研究所用分析軟件及網(wǎng)站如下：RNAhybird，http：//bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/welcome.html；miRanda，http：//www.microrna.org/；miR Base，http：//www.mirbase.org/；Mfold，http：//mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py？#forms：：mfold；Oligo 6.0、DNAMAN、DNAStar。

1.1.5引物設(shè)計與合成利用引物分析軟件Oligo 6.0設(shè)計引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列見表1，此處反轉(zhuǎn)錄引物為5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC******-3′，后6個堿基用“*”表示，根據(jù)成熟體序列設(shè)計，下游引物為5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3′。

1.2試驗方法

1.2.1預(yù)測PhcyNPV可能的編碼miRNA前體序列下載PhcyNPV全基因組序列（GenBank號：JX404026.1）（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/427378890？report=fasta）導(dǎo)入vMir軟件，設(shè)定窗口大小為500 nt，遞進(jìn)單位10 nt，最小發(fā)

夾結(jié)構(gòu)長度50 nt，對PhcyNPV 全基因組中可能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列進(jìn)行初步篩選。隨后，設(shè)定每條序列最低得分為115分，窗口最低為35，去除G+C含量不在30%～70%之間的序列以及那些位于蛋白編碼區(qū)的序列[7]，得到PhcyNPV 全基因組中可能編碼的miRNA前體序列。

1.2.2預(yù)測PhcyNPV可能編碼的成熟miRNA序列根據(jù)預(yù)測到的PhcyNPV miRNA前體序列的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，預(yù)測成熟的miRNA序列。成熟miRNA序列的長度平均為22 nt，位于前體發(fā)夾結(jié)構(gòu)的3′端或者5′端臂上。還要參照的數(shù)據(jù)是成熟miRNA中A+U含量應(yīng)在30%～70%以及發(fā)夾結(jié)構(gòu)中miRNA與其互補(bǔ)的序列差異不能大于6 bp，推測每條miRNA前體序列上可能有的成熟體miRNA序列。

1.2.3預(yù)測成熟miRNA作用的病毒自身靶基因根據(jù)成熟體 miRNA序列5′端2～8位上的核苷酸與靶基因的mRNA序列的非編碼區(qū)（3′-UTR）互補(bǔ)的原理來預(yù)測靶基因[8]。為了提高預(yù)測的準(zhǔn)確度，使用RNAhybird（http：//bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/welcome.html）和 miRanda（http：//www.microrna.org/）2個軟件分別進(jìn)行靶基因預(yù)測，然后提取2個軟件預(yù)測的交集作為最終的預(yù)測結(jié)果，即可能的miRNA靶基因。

1.2.4成熟miRNA序列的逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR，簡稱RT-PCR）驗證

1.2.4.1試驗組與對照組蓖麻蠶脂肪體總RNA的提取病毒接種及取材：取用正常蓖麻葉飼養(yǎng)的4齡蓖麻蠶（B21）起蠶100頭，分為試驗組、對照組，每組50頭。試驗組用移液槍取1.3×108個/mL多角體的PchyNPV病毒液，經(jīng)口添飼蓖麻蠶，每頭喂8 μL，對照組喂8 μL蒸餾水。然后用蓖麻葉正常飼育，至試驗組蠶有發(fā)病癥狀（約飼養(yǎng)96 h）。收集對照組、試驗組蓖麻蠶的脂肪體組織，立即于-80 ℃保存、備用。

提取蓖麻蠶脂肪體組織總RNA，方法如下：（1）取冷凍的脂肪體組織，加液氮，充分研磨；（2）研缽中加入1 mL TRIzol，繼續(xù)研磨，至透明后轉(zhuǎn)移至離心管中；（3）室溫靜置5 min，加入200 μL三氯甲烷，倒置混勻15 s；（4）室溫靜置5 min，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min；（5）取上清，加入等體積的異丙醇（500 μL），倒置混勻；（6）室溫靜置10 min，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min；（7）棄上清，在沉淀中加入乙醇洗滌；（8）4 ℃、12 000 r/min 離心5 min后，輕輕倒掉乙醇，倒扣于超凈工作臺中控干乙醇；（9）加入40 μL DEPC水，溶解 10 min，測D260 nm/D280 nm，檢驗提取質(zhì)量；（10）將溶解的樣品置于 -80 ℃ 保存、待用。

1.2.4.2反轉(zhuǎn)錄體系用試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄試驗，10 μL的逆轉(zhuǎn)錄體系：2 μL 5×PrimerScript buffer，0.5 μL PrimerScripTM RT Enyme Mix Ⅱ，0.5 μL OligdT引物，0.5 μL Random 6 mers，RNase free H2O 6 μL，0.5 μL模板；RT程序：56 ℃ 25 min，95 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min。

PCR反應(yīng)體系如下：13.2 μL ddH2O，2.5 μL Buffer，4.0 μL dNTP，1.5 μL引物F，1.5 μL引物R，2.0 μL cDNA溶液，0.3 μL Taq DNA聚合酶，總體積25 μL；PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4.3回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物將擴(kuò)增的單一條帶且大小與目的條帶相符的PCR產(chǎn)物重新用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在紫外燈下切膠，稱質(zhì)量，放入RNA專用的EP管中。加入3倍膠塊質(zhì)量的Buffer B2，50 ℃水浴5～10 min，再加入1/3 Buffer B2體積的異丙醇；將融化的膠溶液移入吸附柱中，8 000 r/min 離心30 s，棄上清；沉淀中加入500 μL洗滌液，9 000 r/min 離心30 s，棄上清，重復(fù)洗1次；吸附柱于 9 000 r/min 離心1 min；將吸附柱置于干凈的1.5 mL離心管中，在吸附膜中加入30 μL無菌水溶解DNA，9 000 r/min 離心1 min，-20 ℃保存上清液。

1.2.4.4目的片段與PMD 18-T 載體的連接先將割膠回收的DNA重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢驗產(chǎn)物，將符合條件的DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化。10 μL轉(zhuǎn)化體系：1 μL PMD 18-T 載體，4 μL回收的目的片段DNA，5 μL T4連接酶溶液，在連接儀中，于 16 ℃過夜。

1.2.4.5質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化在DNA連接產(chǎn)物的全量混合液中加入100 μL感受態(tài)細(xì)胞（大腸桿菌E.coli DH10B），混勻至于冰上30 min（其間每隔15 min，手指彈勻1次），42 ℃ 熱激60 s，迅速置冰上2 min；再加入890 μL LB培養(yǎng)基（不含Amp），37 ℃振蕩1.0～1.5 h，12 000 r/min離心5 min，棄上清，加入含Amp的液體培養(yǎng)基，涂布于LB平板培養(yǎng)基上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜（約10～12 h）。

1.2.4.6重組質(zhì)粒的鑒定及測序挑取多個白色單菌落轉(zhuǎn)化子于1.5 mL含有Amp的液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)過夜（12 h），然后于4 ℃保存。取菌液進(jìn)行PCR驗證，20 μL PCR反應(yīng)體系：13.2 μL ddH2O，2.0 μL buffer，0.4 μL dNTP，1.0 μL引物F，1.0 μL引物R，2.0 μL菌液，0.4 μL Taq E。PCR反應(yīng)程序與“1.2.4.2”節(jié)的方法一致，PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將鑒定正確的菌液倒入EP管中，另加Amp與甘油，制成甘油菌，委托生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.4.7預(yù)測的成熟miRNA序列與測序結(jié)果比對成熟體的序列一般為22 nt，位于前體序列的5′端或3′端，與其互補(bǔ)序列的差異不能多于6個堿基。將測序結(jié)果、成熟體序列與病毒基因組進(jìn)行一一比對。

2結(jié)果與分析

2.1vMir 軟件預(yù)測PhcyNPV可能編碼的miRNA前體序列

將PhcyNPV全基因組序列（JX404026.1 ）導(dǎo)入分析軟件vMir，根據(jù)文獻(xiàn)介紹，預(yù)測參數(shù)如下：Window size，500 nt；Step size，10 nt；Min HP size，50 nt。

預(yù)測得到4 836個可能的小RNA前體序列，包括miRNA前體序列、長度、方向、分值信息，從而得到前體序列。

然后設(shè)置相應(yīng)的參數(shù)，利用vMir軟件分析PhcyNPV基因組，產(chǎn)生所有PhcyNPV基因組中可能形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)（圖1）。

[FK（W14][TPQHY1.tif][FK）]

2.2vMir viewer 查看和過濾 miRNA前體序列

通過文獻(xiàn)推薦的過濾參數(shù)（Score：115；Max HP size，100 nt；Window count，35），對4 836個miRNA前體進(jìn)行過濾選擇，進(jìn)一步篩選可能編碼的miRNA前體序列。將預(yù)測到的可能前體序列再與PhcyNPV 基因組中的ORF序列比對，如果這些預(yù)測序列位于蛋白編碼區(qū)，則應(yīng)去除。由于病毒基因組中90%以上的序列都編碼蛋白，且ORF中幾乎不含內(nèi)含子，因此絕大部分的預(yù)測序列將被去除。最終得到71個miRNA前體（表2），其分布展示如圖2所示。

2.3提取成熟的miRNA序列

成熟的miRNA分別位于前體的3′或者5′臂端，平均長度為22 nt。通過對71個前體miRNA序列進(jìn)行分析，提取得到142個成熟的miRNA序列，詳見表3。

2.4預(yù)測結(jié)果與miRBase的同源性比對

將71條前體得到的142條成熟序列，與v20.0版本的miRBase（http：//www.mirbase.org/）數(shù)據(jù)庫的前體序列進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)共有134條成熟序列有同源性miRNA序列，其余8條則未見有同源序列，可能是PhcyNPV中特有的。

2.5PchyNPV可能編碼的成熟miRNA的靶基因預(yù)測

為了提高預(yù)測的準(zhǔn)確度，使用2個軟件（miRanda、RNAhybird）分別預(yù)測miRNA成熟體的靶基因，然后提取這2個軟件預(yù)測的交集作為最終的預(yù)測結(jié)果。有33條miRNA成熟體序列預(yù)測到61個ORF（即病毒自身的靶基因）上，見表5?？梢钥闯觯墒祗wmiRNA可能調(diào)控的靶基因涉及PchyNPV基因組中各類基因，從時間上看有極早期基因（[WTBX][STBX]PE 38、pnk/pnl[WTBZ][STBZ]）、早期基因（[WTBX][STBX]ME53/hr2、P12、HE65）、滯早期基因（p31）、晚期表達(dá)基因（lef-3、lef-8、lef-9[WTBZ][STBZ]）；從功能上看，有與病毒復(fù)制相關(guān)基因、能影響病毒包埋相關(guān)基因、與經(jīng)口感染相關(guān)因子、與宿主域相關(guān)基因、抑制宿主細(xì)胞凋亡基因、編碼合成與病毒復(fù)制及感染相關(guān)的酶與調(diào)節(jié)蛋白基因等，有的是核心基因，有的則是桿狀病毒的非必需基因。由此可見，在PchyNPV基因組中可能編碼的成熟體miRNA在蓖麻蠶核型多角體病毒侵染宿主蓖麻蠶的過程中，從侵染的起始到后期各個階段都可能通過調(diào)控病毒自身基因來實現(xiàn)病毒侵染寄主細(xì)胞的作用。

2.6預(yù)測的miRNA成熟體的RT-PCR驗證

根據(jù)“2.5”節(jié)中用miRanda、RNAhybird2個軟件分別預(yù)測成熟體miRNA的靶基因，有33條成熟體miRNA在2個軟件中都預(yù)測到相關(guān)的靶基因。選取這33條miRNA為研究對象，用RT-PCR驗證這些miRNA成熟體的序列。

根據(jù)成熟體序列設(shè)計相應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄引物以及PCR上游引物，將對照組和試驗組的蓖麻蠶脂肪體總RNA反轉(zhuǎn)錄成特異性的cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，有8條序列是單一條帶且序列的大小與理論預(yù)測值相符，部分電泳結(jié)果如圖3所示。

分別挑出這8條單一且大小接近64 bp的條帶，重新進(jìn)行PCR驗證，依然呈現(xiàn)單一條帶，且大小符合理論值。由圖4可見，這8條帶對應(yīng)的成熟體miRNA從1～8分別是Phcy-miR-177_3p、Phcy-miR-996_5p、Phcy-miR-696-5P、Phcy-miR-664_3p、Phcy-miR-30_5p、Phcy-miR-217_5p、Phcy-miR-1483_3p、Phcy-miR-177_5p。

將這些PCR產(chǎn)物進(jìn)行割膠回收、連接轉(zhuǎn)化，菌液PCR后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序產(chǎn)物與PhcyNPV基因組比對，有6條帶在基因組內(nèi)有完全一致的序列，另外2條與基因組序列不一致。6條可能為PhcyNPV編碼的miRNA成熟體序列，分別為Phcy-miR-996_5p、Phcy-miR-5P、Phcy-miR-664_3p、Phcy-miR-30_5p、Phcy-miR-217_5p、Phcy-miR-1483_3p。PCR產(chǎn)物的電泳圖中顯示對照組的脂肪體cDNA也能擴(kuò)增出大小相似的條帶（圖5），但是這些條帶經(jīng)測序比對后發(fā)現(xiàn)與PchyNPV基因組不完全一致，因此認(rèn)為不是目的條帶。

3結(jié)論與討論

本試驗利用計算機(jī)預(yù)測PhcyNPV中可能編碼的miRNA分子，共得到142條miRNAs序列。通過比對miRBase數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)134條有同源序列，其余8條則沒有同源序列，可能是PhcyNPV特有的miRNA分子。目前大多數(shù)研究都將重點放在miRNAs在宿主與病毒互作中的功能研究上，但越來越多的證據(jù)表明，miRNAs通過直接靶向病毒基因或改變自身基因的表達(dá)在防御反應(yīng)中也起到重要作用。此外，由于本研究中預(yù)測的PhcyNPV的miRNAs數(shù)量較之前已研究的 BmNPV 的miRNA要多， 在試驗驗證miRNA成熟體序列之前，筆者先用miRanda、RNAhybird 2個軟件預(yù)測miRNA對病毒自身靶基因，然后選擇2個軟件均預(yù)測到相同靶基因的33條miRNA，再對這33條miRNA做試驗驗證，相對提高了驗證序列的可靠性。

從對BmNPV及其宿主家蠶的miRNA研究[4，9]看，miRNA的表達(dá)具有時間和空間的特異性，因此取什么組織作樣[CM（25]本和什么時間取樣就很重要。以往研究家蠶及

時，一般取病毒感染后的血液（或馬氏管）作為研究對象，因為這二者中病毒的復(fù)制數(shù)較高；考慮到病毒感染家蠶后，病毒和家蠶有個相互抗衡的過程，病毒需要有足夠的時間產(chǎn)生miRNA起作用，因此通常選擇感染后72 h取樣，希望獲得更多的miRNA分子序列。但是錢荷英等研究發(fā)現(xiàn)，在PhcyNPV感染蓖麻蠶后期的各組織中，脂肪體內(nèi)的病毒基因拷貝數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他組織，且直到120 h還保持增殖趨勢[10]，這可能也間接提示PhcyNPV、BmNPV在感染各自寄主時有其相對特殊的感染方式。

在用RT-PCR進(jìn)行PhcyNPV的miRNA成熟體序列驗證時，有的PCR產(chǎn)物出現(xiàn)并非專一的非目的條帶，可能是擴(kuò)增了蓖麻蠶基因組產(chǎn)物所致，因為所取試驗材料中蓖麻蠶的組織樣品含量遠(yuǎn)高于PhcyNPV，因此這些擴(kuò)增條帶沒有割膠回收驗證。至于對照組織中也擴(kuò)增出與目的片段大小相似且表達(dá)量相對較高的miRNA分子，可能是由于蓖麻蠶本身也會編碼產(chǎn)生相應(yīng)的miRNA，而且這些miRNA 在病毒感染過程中也起到抑制、調(diào)控病毒的復(fù)制和侵染作用，因此導(dǎo)致對照組織中有miRNA分子被擴(kuò)增出。鑒于目前沒有相對完整的蓖麻蠶基因組信息，因此對照組中擴(kuò)增出的成熟miRNA分子無法驗證，只好忽略。

從靶基因預(yù)測結(jié)果看，1個miRNA可能作用于多個靶基因，而1個基因又可能受多條miRNA的調(diào)控，可見miRNA對病毒自身的調(diào)控是個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，涉及多種基因及病毒侵染的各個階段。由于完善的蓖麻蠶細(xì)胞系尚沒有建立，而PhcyNPV對已經(jīng)成熟的幾個細(xì)胞系如Bm、sf等的感染性不理想，miRNA的生物學(xué)功能驗證試驗很難開展，這也是本研究的一大缺憾。

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