孟玲寧 劉錦燕 李文靜 趙悅 項明潔

(1.上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院檢驗科，上海 200025；2.上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院盧灣分院放免檢驗科，上海 200020)

·綜述·

白念珠菌與生物膜相關的耐藥機制

孟玲寧1,2劉錦燕2李文靜1,2趙悅1,2項明潔1,2

(1.上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院檢驗科，上海 200025；2.上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院盧灣分院放免檢驗科，上海 200020)

白念珠菌在醫(yī)療植入材料上形成生物膜,導致高死亡率感染。成熟的生物膜具有強耐藥性,使得生物膜相關感染難以治愈。文章主要從白念珠菌生物膜外排泵基因、細胞外基質以及壓力應答等3個方面探討白念珠菌生物膜的耐藥機制,綜述該研究方向的最新進展,為白念珠菌的臨床防治策略制定提供參考。

白念珠菌；生物膜；耐藥機制；細胞外基質

白念珠菌是最常見的院內條件致病菌且經常導致血液感染，侵襲性念珠菌病最常見的危險因素是醫(yī)用材料的植入[1]。常用于白念珠菌的抗真菌藥物有唑類、多烯類、嘧啶類和棘白菌素類。近年來，臨床抗真菌治療失敗的病例屢見不鮮，究其原因主要是白念珠菌對藥物的耐藥率增多和耐藥性增強。

有研究發(fā)現(xiàn),能夠形成生物膜的白念珠菌,可以更有效地抵御抗真菌藥物,使治療更加困難。生物膜是由包裹在細胞外基質中的真菌細胞和假菌絲黏附于載體或者有機體表面而構成的立體結構，其作為一種屏障，可以避免內部菌落受到免疫系統(tǒng)的攻擊，躲避抗真菌藥物的殺傷作用，導致真菌耐藥性的產生[2]?，F(xiàn)就白念珠菌的生物膜對抗真菌藥物的耐藥機制作簡單歸納。

1 外排泵基因

臨床發(fā)現(xiàn)的唑類耐藥分離株常常高表達相關外排泵基因CDR1、CDR2、MDR1，所以早期時研究者推測生物膜耐藥表型是否也和外排泵活性增強有關。Mukherjee等[3]將早期、中期和成熟生物膜的耐藥性進行了對比，實驗發(fā)現(xiàn)，和親本菌株相比，敲除了外排泵基因的突變株在成熟生物膜存在的情況下對于氟康唑的敏感性沒有明顯的變化，但在早期生物膜存在的情況下藥物敏感性明顯增強。劉東妹等[4]研究了在白念珠菌生物膜形成的不同時期，鋅族轉錄因子TAC1以及外排泵基因MDR1、CDR1、CDR2與白念珠菌生物膜耐藥的關系，結果發(fā)現(xiàn)TAC1和外排泵基因可能在白念珠菌生物膜形成的早中期對氟康唑的耐藥發(fā)揮了一定作用。近年來發(fā)現(xiàn)FLU1基因編碼的外排泵與人富組蛋白 (Hst5)的外排有關，Hst5是對白念珠菌有毒性作用的抗菌肽，最新研究發(fā)現(xiàn)，flu△/△突變株在Hst5存在的情況下生物膜的生成量明顯減少，從而對藥物的敏感性增加，但其中的機制還需要進一步的研究[5]。

2 環(huán)境壓力

在白念珠菌黏附以及生物膜生長的過程中激活了一些應激反應，從而提高了真菌的耐藥性。最早研究的是應對細胞壁壓力而激活的信號轉化通路MAPK。實驗表明黏蛋白Msb2可以調控Cek1 MAPK通路，msb2△/△菌株能夠形成正常的菌絲但是卻有生物膜缺陷[6]。章珍珍等[7]發(fā)現(xiàn)Ras1是MAPK通路中重要的結合蛋白，RAS1基因缺陷株形成菌絲的能力下降，從而影響了生物膜群體的發(fā)展。隨后的研究關注了細胞壓力調節(jié)通路對生物膜耐藥的影響，鈣調磷酸酶屬于Ca2+-鈣調蛋白活化蛋白磷酸酶，有研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)孢霉素A作為鈣調磷酸酶的抑制劑，作用于含有生物膜的白念珠菌后，可以提高菌株對氟康唑的敏感性，由此可以猜測鈣調磷酸酶在生物膜耐藥的過程中發(fā)揮了一定作用[8]。白念珠菌壓力應答通路中的成分熱休克蛋白90 (Hsp90)，被認為是生物膜分散和耐藥的關鍵調節(jié)因子。Robbins等[9]通過實驗發(fā)現(xiàn)無論是體外還是動物模型中，通過基因或者藥理水平破壞Hsp90的功能都能使生物膜由氟康唑耐藥轉變?yōu)槊舾校荋sp90功能破壞后只是在很小的程度上影響生物膜的成熟，并不會破壞生物膜的形成。此外，Hsp90基因敲除會減少細胞外基質中葡聚糖的生成，主要通過影響β-1,3-葡聚糖合酶Fks1來調節(jié)葡聚糖的水平。Hsp90可以選擇性地影響Zap1或者它下游的Gca1和Gca2從而調節(jié)細胞外基質的生成。

3 細胞外基質

生物膜內的細胞被包裹在自身產生的細胞外基質中，這是和浮游細胞的主要區(qū)別。細胞外基質的主要成分是碳水化合物、蛋白質和核酸[10]。雖然細胞外基質的作用還沒有研究透徹，但先前的研究表明它在維持細胞環(huán)境穩(wěn)態(tài)、防止生物膜分散以及逃避抗真菌藥物等方面發(fā)揮了一定作用[11]。

有研究表明，細胞外DNA (eDNA)是細胞外基質中的一個重要組成部分，且隨著時間總量在增加，使用脫氧核糖核酸酶I (DNAse)治療后，生物膜總量隨著時間在下降[12]。中性粒細胞針對浮游的白念珠菌可以分泌一些毒性物質NETs，如DNA、組蛋白來阻止白念珠菌的生長與擴散，Joohnson等[13]研究表明生物膜可以很大程度上抑制NETs的釋放從而導致耐藥，通過構建老鼠導管模型，發(fā)現(xiàn)編碼細胞外基質甘露聚糖的基因PMR1的敲除可以引起NETs的大量釋放，所以能夠推測白念珠菌的生物膜可以通過細胞外基質抑制中性粒細胞釋放毒性物質，從而介導多重耐藥。

Nett等[14]研究表明，β-1,3-葡聚糖不僅存在于細胞壁中，也存在于細胞外基質中，同時總量會隨著生物膜的成熟而增多。β-1,3-葡聚糖可以和氟康唑結合，從而阻止藥物作用于生物膜相關的細胞。Nett等發(fā)現(xiàn)1 000 μg/mL氟康唑和1.25 U/mL溶細胞酶 (一種葡聚糖酶)混合作用于白念珠菌后可以降低生物膜的生存能力，而兩者單獨作用卻沒有這種效果。之后發(fā)現(xiàn)β-1,3-葡聚糖也可以和兩性霉素B特異性結合而產生耐藥?；谶@些發(fā)現(xiàn)，此過程中的相關基因也受到了關注。首先是編碼β-1,3-葡聚糖合酶的基因FKS1，實驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)KS1基因的雜合缺失突變株中β-1,3-葡聚糖的含量減少了30%，在經過250 μg/mL的氟康唑治療48 h后，生物膜內細胞的生存能力下降了80%，而在浮游細胞中觀察不到相關現(xiàn)象。Nett等[15]對FKS1基因進行調節(jié)，發(fā)現(xiàn)不論是抑制表達還是過度表達，都會影響生物膜對兩性霉素B、棘白霉素和氟胞嘧啶的藥物敏感性，聯(lián)系之前FKS1基因與氟康唑的耐藥關系，推測生物膜細胞中FKS1基因對于各類抗真菌類藥物的作用機制是相同的，且此耐藥機制可能是生物膜所特有的，因為破壞浮游細胞的FKS1基因對耐藥沒有任何影響。此外，控制細胞壁葡聚糖含量的PKC通路中的兩個相關基因SMI1和RLM1，也被證實與細胞外基質中葡聚糖的含量有關，Smi1p調節(jié)FKS1的表達很可能是通過上游的轉錄因子Rlm1p[16]。Taff等[17]發(fā)現(xiàn)存在于細胞外基質中的兩種葡聚糖轉移酶 (分別為BGL2和PHR1基因編碼)以及一種外切葡聚糖酶 (為XOG1基因編碼)對于傳遞β-1,3-葡聚糖至基質中以及在基質中的聚集非常重要，缺少這些基因的生物膜相關突變株對于氟康唑的敏感性明顯增加，而類似的現(xiàn)象卻沒有在浮游細胞中發(fā)現(xiàn)，實驗觀察到，bgl2△/△、xog1△/△、phr1△/△缺陷株和對照株相比，阻止放射性氟康唑進入的能力明顯下降，這之中phr1△/△缺陷株對于氟康唑的藥物敏感性增加最為明顯 (近4倍增加)，這些缺陷株出現(xiàn)不同藥物敏感性的原因還不是很清楚，仍需要進一步的研究。最新的研究表明，細胞外基質中的β-1,3-葡聚糖除了可以調控白念珠菌的耐藥，還可以在大腸桿菌/白念珠菌聯(lián)合的生物膜中使得大腸桿菌對于氧氟沙星的耐藥性大幅度增加，而其中具體的機制還在研究中[18]。

4 其他機制

最新研究表明，凝集素樣序列 (agglutinin-like sequence ALS)基因家族在生物膜早期形成和黏附中發(fā)揮重要作用，其中ALS1、ALS3基因的過表達可以使白念珠菌對氟康唑耐藥性增加，但具體的機制仍需進一步研究[19]。Truong等[1]發(fā)現(xiàn)AHP1基因可以通過持續(xù)性的抗氧化作用來介導白念珠菌對兩性霉素B的耐藥，在二倍體的白念珠菌菌株中敲除AHP1基因后可以增加其對兩性霉素B的藥物敏感性。Mathe等[20]在研究中發(fā)現(xiàn)，白念珠菌在游離階段對標準劑量藥物反應敏感，但在附著和生物膜形成階段對藥物敏感性降低，在生物膜形成后，用PCR檢測超氧化物歧化酶1 (SOD1)和過氧化氫酶1 (CAT1)的表達量都較之前增高，所以推測生物膜的耐藥性與高抗氧化能力有關。Nobile等[21]現(xiàn)組蛋白脫乙酰酶復合物中的核心組成部分Set3復合物與白念珠菌生物膜耐藥有關，Set3復合物突變株耐藥機制既不是細胞膜完整性的改變，也不是上調了ABC轉運蛋白超家族的表達，可能是生物膜內一些特有物質作用而產生的，特別是β-1,3-葡聚糖，但具體機制還沒有被證實，需要進一步的研究。近幾年的研究表明，免疫系統(tǒng)和生物膜相關白念珠菌細胞的關系與浮游細胞大有不同。Xie等[22]提出生物膜相關細胞的保護機制是由成熟生物膜完成的。實驗發(fā)現(xiàn)，形成3 h的生物膜暴露于HL-60細胞 (一種人類中性粒細胞相似的細胞株)時，會失去80%的活性，而形成24 h和48 h的生物膜活性僅僅降低不到30%，與此同時，成熟生物膜的存在會抑制機體發(fā)生強烈的氧化應激反應，這通常是中性粒細胞殺傷致病菌的主要機制，而培養(yǎng)3 h的生物膜則相反，分散的生物膜也會產生氧化應激反應，引發(fā)人們對于細胞外基質在免疫系統(tǒng)中作用的研究。實驗發(fā)現(xiàn)，細胞外基質并不會單獨觸發(fā)氧化應激反應，而葡聚酶作用后，細胞外基質抑制氧化應激反應的作用就消失了，而熱滅活的葡聚酶以及DNA酶則不會出現(xiàn)此現(xiàn)象，這些結果提示白念珠菌細胞外基質中的β-1,3-葡聚糖在削減氧化應激反應中發(fā)揮一定的作用。

白念珠菌生物膜是臨床上醫(yī)療植入物發(fā)生血源性感染傳播的主要誘因,也是真菌耐藥形成的重要因素,它的形成和耐藥機制的復雜性決定了生物膜相關性感染的治療極為困難。相對于其他耐藥機制研究,生物膜相關研究起步較晚,仍然存在很多問題有待解決?；蛐酒头肿由飳W為其進一步研究提供了新的研究方法,為徹底治療難治性感染和醫(yī)院內感染帶來新希望。

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[本文編輯] 衛(wèi)鳳蓮

The resistance mechanisms of the biofilm relatedCandidaalbicans

MENG Ling-ning1,2,LIU Jin-yan2,LI Wen-jing1,2,ZHAO Yue1,2,XIANG Ming-jie1,2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,RuijinHospital，ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200025,China;2.RadioimmunologyandClinicalLaboratory,LuwanBranch,RuijinHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200020,China)

Candidaalbicanscan form biofilms on medical implant materials,leading to high mortality infection.Mature biofilm relatedC.albicansinfections are difficult to cure because of multi-drug resistance.This review discusses the resistance mechanisms of biofilm relatedC.albicansfrom efflux pump genes and matrix and stress response,summarizing the research advance of the mechanism and providing reference for clinical prevention strategies.

Candidaalbicans;biofilm;resistance mechanism;matrix

124-127]

上海市科委基金 (15ZR1426900)；上海市醫(yī)學重點專科 (ZK2012A21)；上海市黃浦區(qū)優(yōu)秀青年人才 (RCPY1407)

孟玲寧，女 (漢族)，碩士研究生在讀.E-mail:yimln16@163.com

項明潔,E-mail:mjxiang123456@126.com

R 379.4

A

1673-3827(2017)12-0124-04

2016-11-15