曾敬思 李宏杰 毛葉紅 連昕 鄭岳臣

(1.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院皮膚性病科,武漢 430022；2.武漢市醫(yī)療救治中心感染科，武漢 430023)

·論著·

繼發(fā)型肺結(jié)核患者下呼吸道內(nèi)賽多孢子菌定植初探

曾敬思1李宏杰2毛葉紅1連昕1鄭岳臣1

(1.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院皮膚性病科,武漢 430022；2.武漢市醫(yī)療救治中心感染科，武漢 430023)

目的 初步了解賽多孢子菌 (Scedosporium)在繼發(fā)型肺結(jié)核患者下呼吸道內(nèi)感染或定植狀況。方法 收集101例繼發(fā)型肺結(jié)核患者的支氣管肺泡灌洗液，分別使用真菌鏡檢、選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)及擴增部分β-微管蛋白基因的聚合酶鏈式反應(yīng)-反轉(zhuǎn)線狀點雜交 (PCR-RLB)方法，檢測常見的5種賽多孢子菌病的致病菌，即S.apiospermum、S.boydii、S.minutispora、S.aurantiacum及S.dehoogii。結(jié)果 101份受檢標本均未檢測到上述5種賽多孢子菌。結(jié)論 在繼發(fā)型肺結(jié)核患者中未見常見5種賽多孢子菌呼吸道感染或定植，提示繼發(fā)型肺結(jié)核患者并發(fā)賽多孢子菌病的可能性不大。

肺結(jié)核;賽多孢子菌;下呼吸道;定植

賽多孢子菌屬 (Scedsporium)為一類腐生真菌，廣泛分布于世界各地，存在于土壤、富含腐敗物的淤泥、污水排放溝渠、污染水體等處。在人類活動導致污染嚴重的環(huán)境中分布的密度更高。目前基于分子系統(tǒng)發(fā)生學確立的種有6個[1]。引起人類感染賽多孢子菌病 (Scedosporiosis)的主要為尖端賽多孢子菌 (Scedosporiumapiospermum)和Scedosporiumboydii。臨床上還偶見S.minutispora、S.aurantiacum和S.dehoogii感染。

賽多孢子菌為條件致病菌，主要經(jīng)呼吸道吸入和經(jīng)皮膚黏膜外傷侵入人體。在健康人群多表現(xiàn)為局部感染，免疫異?；颊邉t可發(fā)生播散性感染。常見受累器官為皮膚、眼、肺和腦。由于賽多孢子菌對目前常用抗真菌劑大多耐藥，所以播散感染或重要臟器受累時，預后不良，常危及生命。

結(jié)核病是嚴重危害人類健康的慢性傳染病，其主要經(jīng)呼吸道傳播，肺結(jié)核的主要類型為繼發(fā)型肺結(jié)核。我國近年來每年報告的肺結(jié)核患者數(shù)約100萬，位居甲乙類傳染病的前列[2]，有高患病率、高感染率、高耐藥率、青壯年結(jié)核和死亡比例高等流行病學特點[3]。結(jié)核患者多見于細胞免疫功能低下患者，Scedosporium是否在這些特定人群中定植，成為潛在威脅值得關(guān)注。

為此，我們選取繼發(fā)型肺結(jié)核患者為研究對象，對賽多孢子菌在呼吸道中的定植及感染狀況進行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

2014年12月～2015年3月期間，收集臨床和 (或)實驗室診斷繼發(fā)型肺結(jié)核及合并支氣管結(jié)核的住院患者的支氣管肺泡灌洗液。共收集到101例患者標本，其中男61例，女40例。患者多有程度不等咳嗽、咳痰、午后低熱、夜間盜汗、咯血、胸痛、胸悶、活動后氣促等癥狀。其中，痰結(jié)核菌涂片陽性病例8例；其余痰結(jié)核菌涂片陰性，病例診斷均符合我國2001年版《肺結(jié)核診斷和治療指南》[4]中肺結(jié)核診斷標準。病例均為初治患者。其中處于2個月強化期內(nèi)的病例68例 (治療方案為HRZE)；鞏固期內(nèi)的病例33例 (治療方案為HRE或HRZ)，總療程6～15個月。伴發(fā)基礎(chǔ)疾病的有：糖尿病3例，胸腺瘤合并重癥肌無力1例，血吸蟲病1例。標本來自左側(cè)肺部33例，右側(cè)57例，雙側(cè)3例，不詳8例。

賽多孢子菌選擇培養(yǎng)基 (SceSel+培養(yǎng)基)根據(jù)Rainer等[5]的方法配制，4℃保存待用，保存時間不超過2周。痰消化液為Sputasol (Thermo Fisher Oxoid,Basingstoke,England)。真菌DNA提取試劑盒為Biopsin Fungus Genomic DNA Extraction Kit (Bioer Technology Co.,Ltd,P.R.China)。聚合酶鏈式反應(yīng) (PCR)所用dNTP及GoTaq flexi Master mix為Promega,U.S.A產(chǎn)品。用于擴增賽多孢子菌編碼β-微管蛋白基因的部分片段的通用引物及檢測S.apiospermum、S.boydii、S.minutispora、S.aurantiacum以及S.dehoogii的特異性探針參見Lu等的文獻[5]，由生工生物工程 (上海)股份有限公司合成。反轉(zhuǎn)線狀點雜交 (RLB)所用加樣板為miniblotter MN45 (Immunetics,Manifold,Australia)。過氧化物酶標記的鏈霉親和素偶聯(lián)物 (peroxidase labeled streptavidin conjugate)為EMD Biosciences,Inc.La Jolla,U.S.A.產(chǎn)品，過氧化物酶化學發(fā)光結(jié)合底物 (HRP Chemiluminescence Blotting Substrate)來自Millipore Corporation,Billerica,USA。X線感光膠片為富士公司產(chǎn)品。

1.2 方法

每一病例留取5 mL支氣管肺泡灌洗液，經(jīng)痰消化液消化后洗滌、離心，取沉渣 (參考廠家建議方法)。沉渣分為3份，1份直接10%KOH涂片鏡檢，判斷有無真菌菌絲及孢子；1份50 μL接種到賽多孢子菌選擇培養(yǎng)基 (SceSel+培養(yǎng)基)，30℃培養(yǎng)2～4周，并同時接種參考株S.boydiiCBS101.22于一平皿中作為陽性對照，挑取疑似菌落鏡檢并轉(zhuǎn)種培養(yǎng)，形態(tài)學初步鑒定是否為賽多孢子菌；剩余1份用于提取真菌DNA (依據(jù)廠家建議方案)，并參照Lu等[6]的方法行聚合酶鏈式反應(yīng) (PCR)-反轉(zhuǎn)線狀點雜交 (RLB)，檢測S.apiospermum、S.boydii、S.minutispora、S.aurantiacum以及S.dehoogii的編碼β-微管蛋白基因的部分DNA片段。每次檢測試驗均設(shè)立陽性及陰性對照。

2 結(jié) 果

101份標本中，真菌直接鏡檢均未見菌絲及孢子。除8例未接種培養(yǎng)外，其余均未培養(yǎng)分離出賽多孢子菌，對照接種的參考株生長良好。培養(yǎng)出非賽多孢子菌菌落有27例 (2種菌落混合存在2例)：大量酵母樣菌落 (>5個/平皿)2例；少量酵母樣菌落 (<5個/平皿)5例；大量暗色霉菌菌落 (>5個/平皿)1例；少量霉菌菌落 (<5個/平皿)20例，其中暗色霉菌1例；細菌菌落1例。101例標本均予以了PCR-RLB檢測，也未檢測到賽多孢子菌β-微管蛋白基因的部分DNA片段。

3 討 論

近幾十年來賽多孢子菌病病譜發(fā)生著變遷。在歐美國家20世紀五六十年代，患者多無基礎(chǔ)疾病，感染主要為足菌腫。70年代后，危險致病因素主要為使用糖皮質(zhì)激素、實體器官移植、惡性血液病、肺囊性纖維化病及溺水，而90年代后實體器官移植后出現(xiàn)的感染增長最快。肺、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、眼、鼻竇感染逐步增多，其中最常見的為肺賽多孢子菌病[7]。在一項對實體器官移植受體的賽多孢子菌定植或感染的調(diào)查研究中發(fā)現(xiàn)，59%的受體有肺賽多孢子菌定植，且均為肺移植受體；其余41%的受體為賽多孢子菌感染，其中肺移植受體占55%[8]。另外，在肺囊性纖維化病患者呼吸道內(nèi)賽多孢子菌的定植比例也較正常人群高。賽多孢子菌在呼吸道中定植情況增加，與賽多孢子菌病在這些特定人群中發(fā)病率高度相關(guān)[9-10]。

1977～2015年間中國報道的賽多孢子菌病有24例，最多受累的為呼吸系統(tǒng) (7例)，其次為中樞神經(jīng)系統(tǒng) (6例)。已知誘發(fā)因素的有15例，分別為外傷 (7例)、手術(shù)并使用抗生素 (4例)、溺水 (3例)及骨髓移植 (1例)。從中可以初步看出這些誘因不同于歐美國家。除了我國對賽多孢子菌病認識不足或關(guān)注較晚，病例報道較少，不排除我國本病的易感人群不同于西方國家的可能。

肺結(jié)核在歐美國家少見，而在我國是主要的呼吸道感染性疾病之一。其治療一直以來都是一個難題，肺結(jié)核病嚴重影響著人們的健康和生活質(zhì)量。賽多孢子菌是否在這些特定人群中定植，成為潛在威脅值得關(guān)注。

本研究顯示，在肺結(jié)核患者呼吸道內(nèi)未發(fā)現(xiàn)常見的5種賽多孢子菌的定植或感染。這一結(jié)果初步提示，在我國肺結(jié)核患者中賽多孢子菌呼吸道定植或感染的可能性不大。目前尚未見肺結(jié)核合并賽多孢子菌感染的報道，此狀況與本研究結(jié)果相符。

本研究中，盡管使用的是賽多孢子菌的選擇培養(yǎng)基，但仍有2例標本培養(yǎng)出大量酵母樣菌落，1例培養(yǎng)出大量暗色毛樣菌落。雖然沒有將所得菌落做進一步的菌種鑒定，灌洗液沉渣直接鏡檢也未見菌絲及孢子，但不排除這些患者可能合并有真菌感染，或存在真菌定植，為患者二重感染的潛在威脅。國內(nèi)有研究表明肺結(jié)核患者合并真菌感染達4.77%[11]，在老年患者中高達21.88%[12]，最常見的為白念珠菌[11-12]。肺結(jié)核患者呼吸道內(nèi)真菌感染與患者死亡比例高是否有關(guān)，值得進一步觀察研究。

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[本文編輯] 衛(wèi)鳳蓮

Colonization or infection ofScedosporiumin lower respiratory tract of secondary pulmonary tuberculosis patients

ZENG Jing-si1,LI Hong-jie2,MAO Ye-hong1,LIAN Xin1,ZHENG Yue-chen1

(1.DepartmentofDermatologyandVenereology,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongScienceandTechnologyUniversity,Wuhan430022,China;2.DepartmentofInfectiousDisease,WuhanMedicalTreatmentCenter,Wuhan430023,China)

Objective Understanding colonization or infection ofScedosporiumin lower respiratory tract of secondary pulmonary tuberculosis.Methods Major pathogens of Scedosporiosis,5Scedosporiumspp.(S.apiospermum,S.boydii,S.minutispora,S.aurantiacumandS.dehoogii),were detected in bronchoalveolar lavage fluid from the patients with secondary pulmonary tuberculosis using direct microscope examination,fungal culturing and PCR-based reverse line blot (PCR-RLB) targeting the partial β-tubulin gene.Result NoScedosporiumspp.were found in 101 specimens of bronchoalveolar lavage fluid from secondary pulmonary tuberculosis patients.Conclusion RareScedosporiumspp.colonize or infect in lower respiratory tract of secondary pulmonary tuberculosis.It implies that secondary pulmonary tuberculosis complicated by Scedosporiosis due to increasing colonization ofScedosporiumspp.in the respiratory tract will be uncommon.

pulmonary tuberculosis;Scedosporium;lower respiratory tract;colonization

89-91]

湖北省自然科學基金 (2008CDZ014)

曾敬思，女 (漢族)，博士，副教授，副主任醫(yī)師，碩士研究生導師.E-mail:wuhanzjs@aliyun.com；李宏杰,男 (漢族)，本科，副主任醫(yī)師.E-mail:2465059569@qq.com

R 519.8

A

1673-3827(2017)12-0089-03

2016-12-07