高穎

（河北省正定縣農(nóng)牧產(chǎn)品檢測檢驗(yàn)中心，河北 正定 050800）

澤瀉對脂肪變性肝細(xì)胞的影響

高穎

（河北省正定縣農(nóng)牧產(chǎn)品檢測檢驗(yàn)中心，河北 正定 050800）

為研究澤瀉對脂肪變性肝細(xì)胞的影響，以DL-乙硫氨酸處理大鼠原代肝細(xì)胞為模型對照組，不同劑量的澤瀉粗提物為處理組作為試驗(yàn)材料。采用油紅O染色，光學(xué)顯微鏡400倍下觀察肝細(xì)胞的脂質(zhì)變化，拍照，分析生化指標(biāo)數(shù)據(jù)變化。結(jié)果顯示：添加澤瀉粗提物的各組載脂蛋白B含量升高，甘油三酯含量明顯降低，病理觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯縮小，說明澤瀉粗提物對脂肪變性肝細(xì)胞有調(diào)節(jié)作用，明顯加強(qiáng)肝細(xì)胞對脂質(zhì)的代謝能力，從而為臨床上合理地利用和篩選保肝藥物提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。

細(xì)胞培養(yǎng)；脂肪肝；澤瀉

澤瀉（Alisma orientale）的化學(xué)成分以萜類為主，其中澤瀉醇A及其乙酸酯、澤瀉醇B及其乙酸酯、澤瀉醇C單乙酸酯，是其主要活性成分，不僅能促進(jìn)脂肪分解，抑制腸道膽固醇的吸收，提高高密度脂蛋白水平，促進(jìn)膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)與清除［1-2］。水提物和醇提物能明顯調(diào)節(jié)血清中脂質(zhì)代謝平衡，升高高密度脂蛋白-膽固醇的濃度，降低總膽固醇和甘油三酯的濃度，能抑制肝內(nèi)脂肪堆積，肝功能得到改善。研究還發(fā)現(xiàn)，低蛋白飲食、乙基硫氨酸等原因引起的動(dòng)物脂肪肝，澤瀉有良好的抑制作用［3-4］。本文通過體外培養(yǎng)肝細(xì)胞、添加藥物、生化指標(biāo)測定等方法來檢測肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯（TG）和載脂蛋白B（apoB）的含量變化，說明澤瀉粗提物對調(diào)節(jié)載脂蛋白含量的積極意義，從新的角度展開創(chuàng)新藥物在體內(nèi)是否發(fā)生代謝性相互作用的研究，也提供了更方便的試驗(yàn)手段。

1　材料與方法

1.1材料來源

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的健康清潔級(jí)SD大鼠，1～2月齡，雄性。

1.1.2主要試劑和儀器參照參考文獻(xiàn)［5］配制二步灌流法需要的洗液，試驗(yàn)設(shè)備和試驗(yàn)材料由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2材料的處理藥店購買澤瀉加工成2 mm飲片，與水1∶10，普通中藥煎制方法，16層紗布過濾；二煎加水比例1∶8，煮沸，換文火煎0.5 h，過濾［6-7］。將兩次濾液混在一起，靜置，取上清液高速離心30 min，取上層，用冷凍干燥機(jī)凍干（真空100 MT，溫度-40℃），得粉末狀澤瀉粗提物，培養(yǎng)基溶解過濾使用。

1.3培養(yǎng)與檢測

1.3.1分離培養(yǎng)原代肝細(xì)胞［8-11］二步灌流法獲取肝細(xì)胞，血清與肝細(xì)胞混合液鋪于培養(yǎng)板中，置于二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

1.3.2添加澤瀉粗提物將肝細(xì)胞分為2.0 mmol/ L DL-乙硫氨酸作用的模型對照組（A組），澤瀉粗提物與2.0 mmol/L DL-乙硫氨酸共同作用處理組，添加濃度分別是1.0（B組），5.0（C組），10.0（D組），20.0（E組），50.0（F組）μg/mL，24 h換液一次。

1.3.3肝細(xì)胞染色10%中性甲醛浸泡被冷的磷酸緩沖鹽溶液（pH值7.2）沖掉雜質(zhì)的蓋玻片30 min，油紅O用于脂滴染色，蘇木精用于細(xì)胞核染色，明膠封片，拍照。

1.3.4生化指標(biāo)測定吸去洗液，加入裂解液，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，與裂解液一并轉(zhuǎn)入離心管，震蕩混勻，12 000 r/min離心10 min，吸取上清液。利用生化分析儀分別測定A，B，C，D，E，F(xiàn)組24 h和48 h細(xì)胞裂解液中的TG和apoB，方法參照試劑盒。所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均用SPSS 13.0軟件，采用One-Way ANOVA檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，P＜0.01為差異極顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1油紅O染色觀察見中插彩版圖1、圖2顯示，對照組細(xì)胞內(nèi)分布有多個(gè)顏色濕潤濃深的橘紅色脂滴，細(xì)胞核變小，有的地方脂滴匯聚成團(tuán)，將細(xì)胞核壓向一邊（見中插彩版圖1）；處理組細(xì)胞內(nèi)脂滴正常分布，脂滴數(shù)量與體積逐漸減少，澤瀉粗提物添加量5.0 μg/mL時(shí)，處理組形態(tài)變化最大（見中插彩版圖2）。

2.2澤瀉粗提物作用后的變化

2.2.1TG的含量變化表1結(jié)果顯示，添加澤瀉粗提物培養(yǎng)24 h后，處理組TG含量與模型對照組之間差異極顯著（P＜0.01），TG含量降低，添加量5.0 μg/mL時(shí)，降低TG效果最為顯著，隨之有上升趨勢。48 h后，處理組與模型對照組之間，TG含量降低不明顯，表明澤瀉在最佳用量和最佳用藥時(shí)間時(shí)，降脂效果顯著（見表1）。

表1　澤瀉粗提物作用24 h與48 h后TG的含量

2.2.2apoB的含量表2結(jié)果顯示，添加澤瀉粗提物培養(yǎng)24～48 h后，處理組apoB含量都高于對照組，24 h比48 h顯著，添加量為5.0 μg/mL時(shí)，apoB含量達(dá)到最高，與表1降脂效果含量一致。

表2　澤瀉粗提物作用24 h與48 h后apoB的含量

3　討論

澤瀉是否對脂肪變性的肝細(xì)胞有調(diào)節(jié)作用，主要看其對肝細(xì)胞內(nèi)TG含量的調(diào)節(jié)。本研究肝細(xì)胞內(nèi)TG含量在澤瀉粗提物的作用下顯著降低，從中插彩版圖中紅色脂滴減小可以看出，直觀說明澤瀉粗提物能改善肝臟脂質(zhì)沉積。由此發(fā)現(xiàn)，澤瀉粗提物能促進(jìn)肝臟分泌apoB，apoB對脂蛋白的形成起著重要作用，參與極低密度脂蛋白的合成、分泌，當(dāng)含量增加時(shí)，就會(huì)加速肝內(nèi)甘油三酯、磷脂、膽固醇與載脂蛋白B，E等結(jié)合形成脂蛋白，降低低密度脂蛋白的同時(shí)，還可以提高高密度脂蛋白的含量，運(yùn)到肝外組織去貯存和利用，降低肝內(nèi)脂質(zhì)沉積，反映出澤瀉能多途徑調(diào)節(jié)脂質(zhì)吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)以及代謝的作用機(jī)制。過去，人們研究脂肪肝的方向大多從關(guān)注減少肝內(nèi)脂質(zhì)沉積出發(fā)，對于載脂蛋白研究較少，該試驗(yàn)旨在從載脂蛋白在脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的作用來說明澤瀉粗提物對調(diào)節(jié)載脂蛋白含量的積極意義，以此來為下一步利用澤瀉提高載脂蛋白分泌的有效成分提供科學(xué)依據(jù)，從根本上為改善肝細(xì)胞對脂質(zhì)的代謝指出了方向。經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)，非酒精性脂肪肝病變也能得到澤瀉的顯著改善，肝臟腫大以及轉(zhuǎn)氨酶升高能一定程度上受到抑制，顯示其對肝臟具有一定保護(hù)作用。

當(dāng)然，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)在細(xì)胞培養(yǎng)基中直接加入中藥粗提物，其藥理效應(yīng)的試驗(yàn)會(huì)存在著某些不確定因素。比如，由于細(xì)胞比活體脆弱，澤瀉的添加量不易掌握，還有細(xì)胞培養(yǎng)過程中自然損傷死亡，易造成每組細(xì)胞量不均，對試驗(yàn)造成誤差。因此，澤瀉的確切降脂機(jī)理與作用靶點(diǎn)，需要進(jìn)一步的試驗(yàn)來辨明澤瀉對載脂蛋白B起直接作用的化學(xué)成分，這有待下一步的試驗(yàn)改進(jìn)和深入研究，以便能更有效的利用其藥理成分。

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Effection ofRhizoma Alismatison AdiposeDegeneration Hepatocytes

GAO Ying
（Zhengding Agricultural and Forestry Animal Husbandry Bureau，Zhengding 050800，China）

To investigate the effect of Rhizoma Alismatis on adipose degeneration hepatocytes，rat primary cultured hepatocytes were treated with DL-ethionine to make model control group，treated with gradient concentration of Rhizoma Alismatis crude extract to make handle group for test material.Stained with oil red O and observed under microscope 400×，some biological indices were measured and analyzed.The results showed that the content of apolipoproteinB was obviously increased and triglyeride was sigrrficantly decreased in the groups treated with gradient concentration of Rhizoma Alismatis crude extract，and the lipid droplet was significantly diminuted.There was an accommodation effect for adipose degeneration on hepatocytes by Rhizoma Alismatis crude which obviously strengthens hepatocytes on lipid metabolic capability.

hepatocytes culture；fatty liver；Rhizoma Alismatis

S852.35

A

0529-6005（2016）09-0038-02

2015-05-25

國家“十一五”科技支撐計(jì)劃（2006BAD04A10-4）

高穎（1981-），女，獸醫(yī)師，碩士，主要從事動(dòng)物代謝病工作，E-mail：hbaugy1404@sohu.com