莫煒鈺，羅　均，莫梅君，趙　靜，張　瓊，朱盛和，陳　昊，林穎儀，郭霄峰

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

兩株豬流行性腹瀉野毒的確證及N基因的分析

莫煒鈺，羅均，莫梅君，趙靜，張瓊，朱盛和，陳昊，林穎儀，郭霄峰

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

將發(fā)病豬場仔豬小腸內(nèi)容物病料經(jīng)胰酶處理后接種Vero細(xì)胞，經(jīng)觀察CPE和特異性RT-PCR確認(rèn)分離得到兩株P(guān)EDV野毒株，并命名“CH/GDZH01/1311”（簡稱“ZH01”）、“CH/GDZH02/1401”（簡稱“ZH02”）。經(jīng)擴(kuò)增和測定N基因，分析得知它們屬于G2-1亞群流行毒株。將ZH01和ZH02及其中連續(xù)傳代的ZH02-f57毒株進(jìn)行3日齡仔豬的回歸試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)它們均有100%致死率，但ZH02-f57毒株引起的發(fā)病癥狀相對遲緩。該研究為PED變異毒株的弱毒疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。

豬流行性腹瀉病毒；分離鑒定；N基因；進(jìn)化分析；致病性

豬流行性腹瀉（PED）主要發(fā)生于10日齡內(nèi)的仔豬，臨床癥狀為嘔吐、腹瀉及脫水，死亡率高達(dá)100%。該病最早于1971報道英國和比利時的養(yǎng)豬場［1］。我國于2010年底大規(guī)模暴發(fā)PED，且近年來一直未得到有效控制，對我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。當(dāng)2013年4月在美洲國家首次暴發(fā)，及后來在亞洲和歐洲部分國家再次暴發(fā)PED疫情，使該病再次在世界范圍內(nèi)給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的危害［2-3］。PEDV為有囊膜，核酸為單股正鏈不分節(jié)段的RNA病毒，屬于α-冠狀病毒屬的成員。在病毒侵染的細(xì)胞中N蛋白的含量比較多，可作為早期診斷［4］。ORF3作為PEDV基因組中的惟一輔助基因，與病毒毒力有關(guān)［5］。同時，我國境內(nèi)病毒性腹瀉主要為PEDV、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和豬輪狀病毒（PRV），而以PEDV的危害為最大［6］。

1　材料

1.1病料2013年底及2014年初從華南地區(qū)豬場采集仔豬腸段組織病料。

1.2病毒及細(xì)胞TGEV、PEDV二聯(lián)活疫苗，購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司。TGEV、PRV和Vero細(xì)胞由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3試劑RNA提取試劑盒，購自Magen公司；高保真酶PrimerSTAR Max，載體pMD18-T，購自TaKaRa公司；DMEM培養(yǎng)基和胰酶，購自GIBCO公司；胎牛血清，購自BI公司。

1.4仔豬12頭未吃初乳新生仔豬，購自華南地區(qū)某種豬場。

2　方法

2.1病料處理陽性病料經(jīng)研磨，凍融，離心后用0.22 μm濾膜過濾，凍存于-80℃。

2.2引物設(shè)計(jì) 參考GenBank公布的PEDV序列，以Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)N基因引物，上游引物：5′-ATTCAGCTGTGAGTAATCCGA-3′，下游引物：5′-ACCGTTGTGTGCAAGACCAA-3′，擴(kuò)增片段大小1 542 bp。參照張坤［9］的報道設(shè)計(jì)PEDV、TGEV、PRV三重RT-PCR檢測引物。參考Park，S.J［10］的研究設(shè)計(jì)PEDV野毒株和疫苗株二重RT-PCR鑒別診斷引物。

2.3PEDV的培養(yǎng)及鑒定Vero細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌3次，加入含有胰酶的細(xì)胞培養(yǎng)液和1.1方法得到的病料濾液，孵育1.5 h后棄液，并添加新培養(yǎng)液。37℃培養(yǎng)4 d，收集培養(yǎng)物，-80℃凍融3次。以三重檢測引物對培養(yǎng)物中的病毒進(jìn)行鑒定。

2.4病毒滴度測定96孔培養(yǎng)板單層Vero細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌3次，加入待測病毒及含胰酶的培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)4～5 d，按Reed-Muech氏法計(jì)算病毒的滴度。

2.5ORF3基因檢測參照Park，S.J［10］二重RTPCR方法進(jìn)行ORF3基因完整性檢測。

2.6N基因克隆及序列分析高保真酶擴(kuò)增N基因，經(jīng)連接轉(zhuǎn)化，挑取若干單菌落送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。使用Lasergene 7.10軟件進(jìn)行序列拼接及同源性分析。運(yùn)用MEGA 6.06構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。

2.7動物回歸試驗(yàn)未吃初乳的新生仔豬，試驗(yàn)前先隔離觀察2 d，并以三重RT-PCR檢測仔豬直腸拭子。攻毒方法為先口服1 mL病毒液（1×105.0TCID50/mL），再口服5 mL DMEM飲漱，Mock組2頭仔豬口服6 mL DMEM。攻毒后，每天喂食時觀察記錄。攻毒后死亡仔豬經(jīng)剖檢記錄，并取腸段內(nèi)容物進(jìn)行PEDV、TGEV、PRV檢測。

3　結(jié)果

3.1病毒的分離及滴度測定18份病料在Vero細(xì)胞中經(jīng)過4～5代次連續(xù)盲傳，其中2份可以引起細(xì)胞產(chǎn)生明顯的CPE（圖1）。病毒適應(yīng)細(xì)胞后，按Reed-Muech氏法測定ZH01-f7、ZH02-f6、ZH02-f57滴度分別為1×105.50，1×106.25，1×106.75TCID50/mL。

圖1　PEDV在Vero細(xì)胞中的病變

3.2病毒的鑒定以三重RT-PCR引物對ZH01-f7、ZH02-f6、ZH02-f57進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物中只能獲得663 bp的DNA片段，表明病毒分離物中只含有PEDV。

3.3野毒與疫苗毒鑒定以二重RT-PCR引物對ZH01-f7、ZH02-f6、ZH02-f57和PEDV商品化弱毒毒株CV777進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示，ZH01-f7、ZH02-f6、ZH02-f57的擴(kuò)增片段為245 bp，弱毒CV777的擴(kuò)增片段為194 bp，表明它們均為野毒株。

3.4N基因擴(kuò)增及測序以ZH01-f0、ZH02-f0為模板進(jìn)行N基因擴(kuò)增。結(jié)果顯示，兩株分離病毒均擴(kuò)增出片段約為1 550 bp的片段，與理論值大小相符。

將N基因測序得知，ZH01與ZH02毒株相互間核苷酸同源性為98.7%，氨基酸同源性為99.5%。存在17核苷酸的差異及4個氨基酸的不同，由此認(rèn)為它們是不同的毒株。在參考序列中，構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹顯示PEDV可分為4個亞群，兩個新分離毒株分布在近年較活躍的流行毒株區(qū)域，均屬于G2-1亞群。從參考毒株中選擇2010年開始得到的毒株作為流行株比較，兩個新分離毒株與我國流行毒株的核苷酸同源性為99.8%～94.6%同源性，與經(jīng)典G1亞群的CV777毒株核苷酸同源性只有95.7%和95.6%。而ZH01毒株與2012年江蘇、杭州JS-HZ2012毒株同源性最高，為99.6%，ZH02毒株與2014年德國GERL00721-2014同源性最高，為99.9%（圖2）。

圖2　PEDV N基因系統(tǒng)發(fā)育樹分析

3.5動物回歸試驗(yàn)

3.5.1仔豬外源病源檢測攻毒前對仔豬混合糞便樣品進(jìn)行三重RT-PCR檢測。結(jié)果顯示，所有仔豬均未感染PEDV、TGEV和PRV。

3.5.2仔豬臨床發(fā)病特征及剖檢病變仔豬在攻毒前健康狀況良好。按2.7法攻毒后，有的弱仔豬呈急性發(fā)病。其他攻毒仔豬出現(xiàn)嘔吐、腹瀉和脫水癥狀。隨著病情加重，精神沉郁，食欲下降但不廢絕，排便腥臭。發(fā)病后期邊吃邊拉，嚴(yán)重脫水，消瘦，共濟(jì)失調(diào)，排便失禁，肛門紅腫。最后脫水衰竭而死亡。Mock組未見嘔吐及腹瀉癥狀。對病死仔豬進(jìn)行剖檢，眼觀可見仔豬胃部膨大脹氣，有未完全消化的凝乳，偶見消化物起泡沫，胃黏膜容易脫落。腸道變脆變薄，嚴(yán)重充血出血，內(nèi)容物呈水樣。

3.5.3攻毒后仔豬檢測攻毒后對Mock組仔豬取直腸拭子而對每只死亡仔豬的小腸段內(nèi)容物進(jìn)行三重RT-PCR檢測。結(jié)果顯示，所有攻毒仔豬均只感染PEDV，而Mock組仔豬無感染。

3.5.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)攻毒后，ZH01-f7和ZH02-f6可引起3日齡仔豬12 h～16 h內(nèi)出現(xiàn)嘔吐癥狀，16 h后出現(xiàn)劇烈腹瀉并出現(xiàn)死亡病例；而經(jīng)過57次傳代的ZH02-f57攻毒組在27 h時才出現(xiàn)嘔吐，37 h時才出現(xiàn)又拉又吐癥狀。最終所有攻毒仔豬最終在84 h后死亡，均表現(xiàn)100%死亡率（圖3），而Mock組仔豬沒有出現(xiàn)嘔吐和拉稀癥狀。

圖3　仔豬發(fā)病后死亡時間

4　討論

在2010年底暴發(fā)的全國性PED疫情表明，目前經(jīng)典商品疫苗對流行野毒株的保護(hù)力并不完全有效［7］。本試驗(yàn)在2013-2014年發(fā)病豬場采集的病料中，應(yīng)用在Vero細(xì)胞中添加胰酶的方法，且經(jīng)過三重和二重RT-PCR檢測方法及對其N基因測序表明，成功分離得到兩株P(guān)EDV流行野毒株，并可在細(xì)胞中穩(wěn)定傳代。進(jìn)化樹分析表明，兩株分離毒株均處于近年流行野毒株的G2-1亞群，且均與CV777毒株遺傳進(jìn)化距離較遠(yuǎn)。在近年活躍的G2-1亞群中，各國毒株均有分布。另外，我們亦在進(jìn)化樹中發(fā)現(xiàn)在2010年后，流行野毒在G1亞群也有出現(xiàn)，提示對經(jīng)典毒株的防控仍不可忽視。

雖然國內(nèi)研究人員從一些腹瀉病例中分離獲得野毒PEDV，但用動物回歸試驗(yàn)以驗(yàn)證病毒對仔豬的致病性還不多。本試驗(yàn)證實(shí)ZH01-f7和ZH02-f6毒株能夠引起新生仔豬發(fā)生典型的發(fā)病癥狀和致死過程，提示所分離PEDV為具有高致病性強(qiáng)野毒株。此結(jié)果與強(qiáng)毒株HN1303毒力相似［8］。我們亦在發(fā)病仔豬血清中檢測到PEDV，說明PEDV野毒株可以引起病毒血癥，此結(jié)果與Jung et al.［9］研究一致。雖然ZH02-f57毒株也誘導(dǎo)了同樣的臨床癥狀和致感染仔豬死亡，但出現(xiàn)臨床癥狀及死亡時間也較晚，說明ZH02毒株經(jīng)過細(xì)胞傳代，毒力已有所下降。這可能是開發(fā)PEDV弱毒疫苗的有效途徑。對新野毒株的生物學(xué)特性研究仍有待進(jìn)一步開展，以期制備出更安全有效的針對流行毒株的候選疫苗。

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Confirmation of thePathogenesis of Two Wild Porcine Epidemic Diarrhea Viruses and Analyses of theN genes

MO Wei-yu，LUO Jun，MO Mei-jun，ZHAO Jing，ZHANG Qiong，ZHU Sheng-he，CHEN Hao，LIN Ying-yi，GUO Xiao-feng
（College of veterinary Medicine，South China Agriculture University，Guangzhou 510642，China）

Via inoculating contents from small intestines of diarrhea piglets from infected hog farms to the Vero cell with trypsin，and then confirmed by the observation of CPE and specific RT-PCR，two strains of wild type PEDV were isolated and designated as"CH/GDZH01/1311"（"ZH01"for short）and"CH/GDZH02/1401"（"ZH02"for short）.They belong to the G2-1 subgroup based on phylogenetic analysis of N genes.While the two isolates and ZH02-f57 were inoculated to 3-day-old piglets，a 100% mortality was observed.However clinical symptoms and deaths caused by ZH02-f57 were the latest.This study provides the foundation for the attenuated PEDV vaccine based on variant strains.

PEDV；isolation and identification；N gene；phylogenetic analysis；animal regression experiment

GUO Xiao-feng

S852.65+1

A

0529-6005（2016）09-0010-03

2016-03-24

莫煒鈺（1991-），男，碩士生，主要從事動物微生物與免疫學(xué)研究，E-mail：weiyu_mo@163.com

郭霄峰，E-mail：xfguo@scau.edu.cn