范軍振呂亞莉宋欣鐘梅王瓊朱鳳偉石懷銀(通訊作者)

100853中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院病理科(北京)

外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的研究進(jìn)展

范軍振呂亞莉宋欣鐘梅王瓊朱鳳偉石懷銀(通訊作者)

100853中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院病理科(北京)

目的：外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)在腫瘤預(yù)后評(píng)估、療效評(píng)價(jià)、腫瘤分期、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移檢測(cè)方面具有重要臨床價(jià)值。CTCs臨床應(yīng)用的研究主要集中于腫瘤早篩、治療方案及預(yù)后評(píng)估、基因分析、體外培養(yǎng)。本文針對(duì)CTCs檢測(cè)方法及臨床應(yīng)用進(jìn)行綜述。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞；液體活檢分子；病理；免疫組化

目前惡性腫瘤的確診及靶向治療前的檢測(cè)均依賴(lài)于病理活檢，但病理活檢是依賴(lài)于外科手術(shù)或影像學(xué)引導(dǎo)的有創(chuàng)操作，其操作流程耗時(shí)較長(zhǎng)，過(guò)程繁瑣，成本也相對(duì)較高。對(duì)于疑似病例、部位特殊、體積較小、腫瘤晚期等不易活檢的患者，病理活檢的應(yīng)用也受到了一定的限制。多年來(lái)，人們一直致力于通過(guò)外周血檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物進(jìn)行惡性腫瘤的篩查和預(yù)后判斷，但由于其敏感度和特異度并不理想，其參考意義也受到一定限制。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞定義及性質(zhì)

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)是指從腫瘤患者外周血中檢測(cè)到的，來(lái)源于實(shí)體腫瘤逃離宿主免疫殺傷后存活的異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞。腫瘤原發(fā)灶形成或增長(zhǎng)過(guò)程中進(jìn)入外周血循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞，大部分由于免疫識(shí)別機(jī)制或者細(xì)胞自身未能獲得新的生存機(jī)制而被清除，只有少量細(xì)胞由于發(fā)生尚未完全認(rèn)識(shí)的變化而在外周血循環(huán)中存活下來(lái)，這類(lèi)細(xì)胞即稱(chēng)為CTCs。不僅如此，CTCs還有可能相互聚集，形成微小的多細(xì)胞聚集體，這類(lèi)結(jié)構(gòu)被稱(chēng)為循環(huán)腫瘤微栓(CTM)。CTCs和CTM的存在被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要原因和標(biāo)志物[1]。

CTCs與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)：在CTCs與腫瘤轉(zhuǎn)移的研究中，EMT是一項(xiàng)關(guān)鍵內(nèi)容，腫瘤在轉(zhuǎn)移過(guò)程中會(huì)發(fā)生上皮型向間質(zhì)型的轉(zhuǎn)換，在這個(gè)過(guò)程中細(xì)胞上皮標(biāo)記物(EpCAM)表達(dá)量下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)記物(如Vimentin)表達(dá)量上調(diào)，從而使腫瘤細(xì)胞侵襲性增強(qiáng)[2]。雖然目前EMT在CTCs的研究并不充分，但已得到證實(shí)：?jiǎn)为?dú)依靠上皮標(biāo)記進(jìn)行CTCs分離和鑒定，有可能僅捕獲那些帶有上皮標(biāo)記的CTCs，而那些與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)性更高的間質(zhì)型CTCs可能未被捕獲[3]。

CTCs的特性：①稀有性：每克腫瘤每日有大量腫瘤細(xì)胞脫落入血，但只有極少數(shù)存活，每105～107個(gè)有核細(xì)胞中才有一個(gè)CTCs，每10mL血液中可能僅含有幾個(gè)到幾十個(gè)CTCs[4]。②異質(zhì)性：腫瘤在轉(zhuǎn)移過(guò)程中會(huì)發(fā)生EMT，在這個(gè)過(guò)程中細(xì)胞的上皮標(biāo)記物表達(dá)量下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)記物表達(dá)量上調(diào)，從而使腫瘤細(xì)胞侵襲性增強(qiáng)，蛋白表達(dá)具有不穩(wěn)定性，而且不同實(shí)體瘤來(lái)源CTCs、不同患者CTCs表面抗原表達(dá)、分布也存在差異。③非典型形態(tài)：CTCs入血后隨血液快速流動(dòng)，與其他細(xì)胞碰撞，受到血管壁的擠壓，受機(jī)體免疫系統(tǒng)以及藥物的攻擊，導(dǎo)致CTCs形態(tài)有別于腫瘤組織，細(xì)胞大小、形態(tài)及表型發(fā)生改變。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離富集和鑒定

CTCs的分離富集：目前CTCs的富集方法理論依據(jù)主要包括兩種：①利用CTCs和正常血液細(xì)胞在大小、形態(tài)等物理學(xué)差異以及腫瘤細(xì)胞特有的核型等特征分離和鑒定CTCs，這種以細(xì)胞大小差異為基礎(chǔ)的方法稱(chēng)為ISET方法[5]。②以檢測(cè)CTCs特異的表面標(biāo)志物為基本原理，大部分CTCs表達(dá)CK、EpCAM等上皮細(xì)胞標(biāo)記，因此可以通過(guò)這些特異性標(biāo)志物進(jìn)行免疫識(shí)別，在此核心原理的基礎(chǔ)上結(jié)合納米、微流、磁珠等技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)CTCs的分離和鑒定[6]。由于CTCs的異質(zhì)性，臨床研究表明很多種類(lèi)腫瘤患者檢測(cè)到不表達(dá)EpCAM等標(biāo)記的CTCs，因此根據(jù)CTCs的表面標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)可能遺漏了具有轉(zhuǎn)移能力的CTCs，從而降低了其富集率[7]。

CTC的鑒定：循環(huán)腫瘤細(xì)胞的鑒定方法有很多種，如免疫組化-免疫熒光、Fish、免疫熒光-Fish、抗原抗體的鑒定技術(shù)，以及目前的葉酸受體鑒定技術(shù)等。免疫熒光標(biāo)記技術(shù)可以同時(shí)使用多種熒光染料對(duì)目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記[8]。Fish技術(shù)鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞，采用基于免疫磁珠微粒原理的前處理富集方法及熒光原位雜交原理的腫瘤細(xì)胞鑒別方法，用于定量檢測(cè)惡性腫瘤患者外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞[9]。免疫熒光-Fish技術(shù)是在Fish技術(shù)的基礎(chǔ)上，對(duì)分離的CTCs進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記，從而更加準(zhǔn)確地鑒定CTCs。當(dāng)形態(tài)學(xué)特征中包含腫瘤細(xì)胞特征并顯示出顯型EPCAM+、CK-PE+、DAPI+、CD45-時(shí)，細(xì)胞被分為CTCs[10]。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞的相關(guān)研究方向

CTCs與腫瘤早篩：目前CTCs檢測(cè)用于早篩實(shí)體腫瘤還未有足夠的臨床數(shù)據(jù)支持。目前關(guān)于CTCs用于早篩的理論依據(jù)主要來(lái)源于動(dòng)物模型的研究結(jié)果，對(duì)乳腺癌小鼠模型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，CTCs可以在原發(fā)灶形成的早期開(kāi)始出現(xiàn)[11]。在胰腺癌小鼠模型中，實(shí)體瘤形成前存在CTCs進(jìn)入血液循環(huán)。這些動(dòng)物模型中的發(fā)現(xiàn)提示CTCs可能用于腫瘤的早期篩查。Ilie等2014年發(fā)表于PLoSOne關(guān)于慢性阻塞性肺疾病CTCs的研究便是最有代表性的一項(xiàng)，這項(xiàng)研究中168例COPD患者和77例非COPD對(duì)照樣本進(jìn)行CTCs檢測(cè)，對(duì)照組中沒(méi)有CTCs檢出，而168位COPD患者中有5例檢出CTCs，后續(xù)跟蹤發(fā)現(xiàn)這5例檢出CTCs的患者在1～4年內(nèi)均通過(guò)CT查見(jiàn)肺部結(jié)節(jié)，且經(jīng)病理活檢診斷為早期肺癌[12]。

CTCs與治療方案及預(yù)后評(píng)估：CTCs計(jì)數(shù)是否能用于臨床治療方案的指導(dǎo)，也是目前的研究方向之一。Smerage等2014年報(bào)道了CTCs計(jì)數(shù)用于臨床治療方案評(píng)估的一項(xiàng)臨床研究，這項(xiàng)研究中CTCs數(shù)量仍表現(xiàn)為一個(gè)良好的預(yù)后指標(biāo)，基線(xiàn)和一線(xiàn)化療21 d后CTCs數(shù)量較多的患者，其PFS和OS較差，而基線(xiàn)CTCs數(shù)量較少的患者預(yù)后較好[13]。

在轉(zhuǎn)移性難治性前列腺癌雙盲Ⅲ期臨床試驗(yàn)中，CTCs數(shù)量與患者基線(xiàn)PSA水平、骨痛、肝臟疾病、血紅蛋白以及堿性磷酸酶水平顯著關(guān)聯(lián)，并與PSA以及RECIST的變化關(guān)聯(lián)性顯著。CTCs超過(guò)5個(gè)的患者整體總生存期顯著縮短。

CTCs與基因分析：目前CTCs在靶向治療過(guò)程中的療效監(jiān)控也是一項(xiàng)研究熱點(diǎn)，靶向治療過(guò)程中CTCs檢出及CTCs群體組成的變化可能用于快速評(píng)估靶向治療過(guò)程療效的動(dòng)態(tài)變化。如2012年P(guān)unnoose等發(fā)現(xiàn)CTCs可用于評(píng)價(jià)晚期NSCLC患者接受靶向治療的預(yù)后，同時(shí)對(duì)患者ctDNA的分析發(fā)現(xiàn)，ctDNA的突變檢測(cè)比CTCs更靈敏，查出的突變結(jié)果與腫瘤的突變情況相關(guān)。其ALK及EGFR突變情況、ROS1重排與腫瘤組織高度一致[14]，且靶向治療過(guò)程中CTCs檢測(cè)到的EGFR突變丟失與治療效果及復(fù)發(fā)相關(guān)。

CTCs與體外培養(yǎng)：以上研究主要基于CTCs的捕獲及鑒定，而通過(guò)捕獲有活性CTCs的微流控技術(shù)，使CTCs培養(yǎng)并進(jìn)行其功能研究是另一個(gè)重要的潛在應(yīng)用方向。培養(yǎng)CTCs獲得細(xì)胞系可以用于基因測(cè)序、藥敏實(shí)驗(yàn)等一系列研究[15]。但目前CTCs培養(yǎng)的研究尚不夠成熟，主要面臨兩個(gè)方面的問(wèn)題：①CTCs培養(yǎng)條件并不完善，CTCs成功培養(yǎng)的效率目前仍然較低；②CTCs培養(yǎng)依賴(lài)于捕獲的CTCs數(shù)量。這是CTCs培養(yǎng)在臨床應(yīng)用中需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

小結(jié)

目前關(guān)于CTCs的研究主要可以分為兩個(gè)方向：①CTCs生物學(xué)特性的研究；②CTCs在臨床應(yīng)用的研究。CTCs的生物學(xué)特性研究的主要內(nèi)容包括不同類(lèi)型CTCs(EMT、腫瘤干細(xì)胞特征、CTM)的生物學(xué)特征、CTCs的來(lái)源研究以及CTCs的分子分型的意義。這些方面的研究成果可以為CTCs的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

對(duì)于CTCs在臨床應(yīng)用的研究，其關(guān)鍵點(diǎn)在于CTCs富集和鑒定方法的標(biāo)準(zhǔn)性、可靠性以及高效性。目前臨床應(yīng)用方面的研究結(jié)論主要是由CellSearch系統(tǒng)取得?？傮w而言，CTCs在乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胃癌等實(shí)體腫瘤中預(yù)后評(píng)估方面的臨床意義已經(jīng)得到充分的證實(shí)，而在臨床研究的跟蹤指標(biāo)、治療方案評(píng)估以及腫瘤早篩這三個(gè)方面的臨床意義尚未明確和充分證實(shí)。

[1]Hanahan D,Weinberg R A.Hallmarks of cancer:the next generation[J].Cell,2011,144 (5):646-674.

[2]Thiery J P.Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression[J].Nature ReviewsCancer,2002,2(6):442-454.

[3]Lin H K,Zheng S,Williams A J,etal.Portable filter-based microdevice for detection and characterization of circulating tumor cells[J]. Clinical Cancer Research,2010,16(20): 5011-5018.

[4]胡玉倩,謝圣高,鄭義,等.循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集與檢測(cè)研究進(jìn)展[J].腫瘤防治研究, 2014,(7):834-838.

[5]Vona G,Sabile A,Louha M,et al.Isolation by size of epithelial tumor cells:a new method for the immunomorphological and molecular characterization of circulating tumor cells[J]. The American journal of pathology,2000,156 (1):57-63.

[6]Zhang Q,Liu T,Qin J.A microfluidic-based device for study of transendothelial invasion of tumor aggregates in realtime[J].Lab on a chip,2012,12(16):2837-2842.

[7]Hyun K A,Jung H I.Advances and critical concerns with the microfluidic enrichments of circulating tumor cells[J].Lab on a Chip, 2014,14(1):45-56.

[8]Takao M,Takeda K.Enumeration,characterization,and collection of intactcirculating tumor cells by cross contamination-free flow cytometry[J].Cytometry Part A,2011,79(2): 107-117.

[9]Mayer J A,Pham T,Wong K L,et al. FISH-based determination of HER2 status in circulating tumor cells isolated with the microfluidic CEETMplatform[J].Cancer genetics,2011,204(11):589-595.

[10]Sieuwerts AM,Kraan J,Bolt J,etal.Anti-epithelial cell adhesion molecule antibodies and the detection of circulating normal-like breast tumor cells[J].Journal of the National Cancer Institute,2009,101(1):61-66.

[11]Podsypanina K,Du Y CN,Jechlinger M,etal. Seeding and propagation of untransformed mousemammary cells in the lung[J].Science, 2008,321(5897):1841-1844.

[12]IlieM,Hofman V,Long-Mira E,etal.“Sentinel”circulating tumor cells allow early diagnosis of lung cancer in patients with chronic obstructive pulmonary disease[J]. PLoSOne,2014,9(10):e111597.

[13]Van Poznak C,Somerfield M R,BastRC,etal. Use of biomarkers to guide decisionson systemic therapy for women with metastatic breast cancer:American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline[J]. Journal of Clinical Oncology,2015,(61): 1459.

[14]Pailler E,Auger N,Lindsay C R,et al.High level of chromosomal instability in circulating tumor cells of ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer[J].AnnalsofOncology,2015,26(7):1408-1415.

[15]Yu M,Bardia A,Aceto N,etal.Ex vivo culture of circulatingbreast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility[J].Science,2014,345(6193):216-220.

Research progressof circulating tumor cells in peripheralblood

Fan Junzhen,Lv Yali,Song Xin,ZhongMei,WangQiong,Zhu Fengwei,ShiHuaiyin(Correspondingauthor)
DepartmentofPathology,the GeneralHospitalofthe Chinese People's Liberation Army(Beijing City)100853

Circulating tumor cells(CTCs)in peripheralblood played an important role in the evaluation of tumor prognosis,effect evaluation,tumor staging and metastasis detection.The clinical application of CTCs was mainly focused on early screening, treatmentand prognosis evaluation,gene analysis and in vitro culture.This paper reviewed the detectionmethods of CTCs and its clinicalapplication.

Circulating tumor cells;Liquid biopsymolecules;Pathology;Immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1007-614x.2017.7.5