鞏志金，車程川，楊 革，劉金鋒，梁光杰，梁鑫鑫，劉勝格

（曲阜師范大學 生命科學學院，山東 曲阜 273165）

銅綠假單胞菌發(fā)酵產鼠李糖脂生物表面活性劑的方式及條件研究

鞏志金，車程川，楊 革，劉金鋒，梁光杰，梁鑫鑫，劉勝格

（曲阜師范大學 生命科學學院，山東 曲阜 273165）

該文綜述了銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）生成鼠李糖脂的相關發(fā)酵技術的研究概況，包括液態(tài)發(fā)酵、半固態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵等。重點介紹了影響液態(tài)發(fā)酵的相關因素，如碳源、氮源、無機鹽、溫度、pH、消泡方法及分批補料發(fā)酵等的研究現狀，以期為今后利用銅綠假單胞菌發(fā)酵生產鼠李糖脂生物表面活性劑提供研究思路和技術參考。

銅綠假單胞菌；鼠李糖脂；發(fā)酵；生物表面活性劑

表面活性劑具有增加潤濕性、乳化性、起泡性等優(yōu)良性能，是日常生活和工業(yè)生產中重要的化工原料，素有“工業(yè)味精”之稱[1]。生物表面活性劑是微生物次級代謝產生的新型表面活性劑，其化學結構一般包括由酸類、離子肽類及糖類等物質組成的親水基團和由飽和或不飽和的脂肪鏈或脂肪酸組成的疏水基團，如脂肪酸、脂多糖、磷脂及脂蛋白質等[2-4]。與傳統(tǒng)化學合成的表面活性劑相比，生物表面活性劑具有無毒、可再生、易生物降解等優(yōu)勢，在石油化工、環(huán)境工程、生物醫(yī)藥和農業(yè)生產等領域具有巨大的應用潛力，市場前景廣闊。如20世紀90年代在美國阿拉斯加發(fā)生的油船漏油事故中，通過向海面油層中加入了生物表面活性劑生產菌，幾周后油污中所含正烷烴基本被消耗掉[5]。

鼠李糖脂（rhamnolipid）是目前研究最深入、應用最廣泛的一種生物表面活性劑，其親水基團一般由1～2分子的鼠李糖環(huán)構成，疏水基團則由不同碳鏈長度的β-羥基烷酸構成[6]。銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是自然環(huán)境中常見的革蘭氏陰性細菌[7]，由于其卓越的生產能力，已經成為鼠李糖脂發(fā)酵的主要生產菌株，也是唯一實現工業(yè)化的菌株。目前，通常采用銅綠假單胞菌液態(tài)發(fā)酵技術生產鼠李糖脂。發(fā)酵過程受培養(yǎng)基組分及培養(yǎng)條件等的影響，并存在一些諸如發(fā)酵過程中起泡嚴重等無法有效解決的技術問題。近年來也有研究者嘗試采用半固態(tài)發(fā)酵[8]或固態(tài)發(fā)酵[9-10]的方式生產鼠李糖脂，以期更好的解決鼠李糖脂發(fā)酵過程中存在的問題。

本文擬從目前研究最深入、技術最成熟的銅綠假單胞菌發(fā)酵產鼠李糖脂為切入點，以液態(tài)發(fā)酵、半固態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵3種鼠李糖脂發(fā)酵技術為線索，整理國內外相關的研究報道、總結相關發(fā)酵條件并分析存在的技術問題，以期為改進鼠李糖脂的生產工藝和提高鼠李糖脂的發(fā)酵生產水平提供技術參考。

1 液態(tài)發(fā)酵生成鼠李糖脂

從1949年JARVIS F G等[11]通過液態(tài)發(fā)酵首次獲得鼠李糖脂以來，經過幾十年的發(fā)展，液態(tài)發(fā)酵已經成為鼠李糖脂生產的主要技術，也是目前唯一實現鼠李糖脂工業(yè)化生產的發(fā)酵技術。銅綠假單胞菌液態(tài)發(fā)酵生產鼠李糖脂受培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件的影響，準確的掌握各影響因素及合理的選擇發(fā)酵條件可以有效的提高鼠李糖脂的發(fā)酵產量，降低生產成本。

1.1 碳源

碳源可為微生物生長和產物合成提供所需的碳架和能量，是菌體生長和產物代謝的主要營養(yǎng)物質。銅綠假單胞菌可以利用的碳源非常廣泛（如親水性的甘油、葡萄糖和乙醇等[12-13]及疏水性的石蠟、烷烴和植物油等[14]）。此外，還有研究者為了降低原料成本、增加鼠李糖脂的經濟性，選擇利用廉價的工業(yè)廢棄物（如糖蜜廢水[15]和豆油煉油廠廢棄物[16]等）作為發(fā)酵的碳源。

一般來說在銅綠假單胞菌可利用的眾多種碳源中，疏水性碳源特別是以植物油為代表的脂類碳源比親水性碳源更適合用于鼠李糖脂的發(fā)酵。其原因可能是當以植物油等疏水性碳源為底物時，銅綠假單胞菌為了利用這類底物需要產生具有一定的表面活性物質來增加其溶解度，從而促進了鼠李糖脂的生成[17]。因此，在銅綠假單胞菌發(fā)酵生產鼠李糖脂的研究中，多以植物油作為發(fā)酵的碳源。目前，國際上鼠李糖脂分批發(fā)酵的最高產量的報道是GIANI C等[18]以豆油為主要碳源并采取氮源限制的方法得到112g/L的鼠李糖脂。ZHU L等[19]也是以豆油為主要碳源得到70.56 g/L的鼠李糖脂。

1.2 氮源

培養(yǎng)基中的氮源可分為兩大類：有機氮源和無機氮源。銅綠假單胞菌可利用蛋白胨、尿素、硝酸鈉和硫酸銨等多種氮源合成鼠李糖脂，但大多數的研究表明，硝酸鈉為最適的發(fā)酵氮源[20-21]。這其中的原因可能是以硝酸鈉為氮源時，鼠李糖基轉移酶基因（rhlAB）的表達量明顯高于硫酸銨等其他氮源[22]，或者是高濃度的NH4+等會降低細胞中谷氨酰胺的濃度，從而影響鼠李糖脂的合成[23]。

發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源的含量對調節(jié)菌體代謝和產物生成具有重要作用。研究表明，鼠李糖脂是一種在菌體生長穩(wěn)定期才大量合成的次級代謝產物，氮源過量會導致菌體生長過于迅速從而影響產物的生成。因此，在發(fā)酵過程中通常會采用限制氮源的發(fā)酵方式來提高鼠李糖脂的產量。如ARINO S等[21]考察了氮源過量和控制氮源兩種培養(yǎng)條件對鼠李糖脂發(fā)酵的影響，發(fā)現氮源過量時菌株生長迅速，在35h時就達到峰值并停止增長，鼠李糖脂產量為2.1g/L；在限制氮源的條件下菌體生長相對緩慢，至50 h才停止生長，鼠李糖脂的產量達到5.8 g/L。MARKUS M M等[24]以銅綠假單胞菌PAO1為生產菌株，并控制硝酸鈉的質量濃度為1.5 g/L，得到了36.7 g/L的鼠李糖脂產量。

另外，培養(yǎng)基中的碳源和氮源的比例（C/N）對鼠李糖脂的發(fā)酵也有重要影響，合理的優(yōu)化培養(yǎng)基中C/N可以有效提高鼠李糖脂的發(fā)酵產量。LUIS G S等[20]評價了C/N為8～30時的鼠李糖脂發(fā)酵情況，發(fā)現當C/N為18時鼠李糖脂的產量最高，當C/N低至9時生物量和產量會隨之減少。RAMANA K V等[25]發(fā)現當以硝酸鈉、硫酸銨和硝酸銨為氮源時，C/N處于低水平時均有利于菌體生長但不利于鼠李糖脂生產，而當C/N逐漸升高至38時鼠李糖脂的產量也都逐漸增加并達到最大。

1.3 無機鹽

發(fā)酵培養(yǎng)基中除碳源和氮源外，無機鹽元素如鎂鐵磷等也對銅綠假單胞菌發(fā)酵生成鼠李糖脂有較大影響，并且伴有低濃度時促進、高濃度時抑制鼠李糖脂合成的現象。如LUIS G S等[20]發(fā)現鼠李糖脂的產量會隨著碳元素與鐵離子質量比（C/Fe）的增大而逐漸升高，但卻基本不受鉀離子、鈣離子和鈉離子的影響；鎂離子在低濃度時比高濃度時更有利于鼠李糖脂的合成[26]。RAMANA K V等[25]也通過實驗證明了低濃度的鎂離子對發(fā)酵具有促進作用，高濃度時有抑制作用。但是，卻發(fā)現無鐵離子的培養(yǎng)基中鼠李糖脂的產量要明顯高于有鐵離子的培養(yǎng)基，這與LUIS G S等[20]報道的現象正好相反。這可能是由于實驗中所使用的菌株或培養(yǎng)基的差異造成的。

此外，CATHERINE N M等[27]的研究表明限制磷酸鹽的蛋白胨/葡萄糖/銨鹽培養(yǎng)基（phosphate-limited proteose peptone glucose ammonium saltsmedium，PPGAS）中鼠李糖脂的產量明顯高于磷含量較高的磷酸鹽基礎培養(yǎng)基和磷酸鹽肉湯培養(yǎng)基，說明低濃度的磷可促進鼠李糖脂的合成，高濃度的磷則具有抑制作用。

1.4 pH

pH可對微生物培養(yǎng)環(huán)境中的細胞膜的透性、膜上的帶電性以及酶活性等產生影響，從而影響發(fā)酵生產。根據相關文獻報道，在鼠李糖脂的發(fā)酵過程中合理的控制培養(yǎng)基的pH值可有效的提高產物的產量。有研究者以葡萄糖為碳源，考察了pH5.75～7.50范圍內對發(fā)酵的影響。發(fā)現鼠李糖脂發(fā)酵最適pH值為6.25，高于這個值時鼠李糖脂產量和菌體濃度均下降，而低于pH 5.75時則很難保持恒定的培養(yǎng)狀態(tài)無法進行恒化培養(yǎng)[26]。還有研究者發(fā)現當起始pH值為6～7時鼠李糖脂的產量較高且基本不變，但是高于或低于這個范圍時鼠李糖脂產量明顯下降[21]。

通常人們會根據菌株和培養(yǎng)基組分的差異，將培養(yǎng)基的起始pH值控制在6～7之間來提高發(fā)酵的產量。如CHEN S Y等[28]在分批發(fā)酵和補料連續(xù)發(fā)酵中均將發(fā)酵pH值控制在6.8，得到了理想的發(fā)酵結果。此外，ZHU L等[19]還認為根據菌體生長代謝的需要在不同生長階段分別控制發(fā)酵的pH，將有助于提高發(fā)酵的產量。將接種初期（0～24 h）的pH值控制在有助于菌體生長的中性偏堿的范圍（7.0～7.5），發(fā)酵中后期（24 h后）的pH值控制在有利于鼠李糖脂合成的中性偏酸的生長環(huán)境（6.0～6.5），最終得到了28.8 g/L的鼠李糖脂產量。這與未采取分段控制pH的分批發(fā)酵方式相比，產量提高了19.7%[19]。

1.5 溫度

銅綠假單胞菌可在多種溫度條件下合成鼠李糖脂，但最適發(fā)酵溫度一般為30～37℃。低至28℃或高于39℃時，菌體的生長和產物的生成都會受到較大影響[26]。目前在鼠李糖脂的發(fā)酵研究中，人們通常會根據培養(yǎng)體系和菌株的差異選擇30℃或37℃作為發(fā)酵的溫度。如MARKUS M M等[24]在對目前已報道的3種非常優(yōu)異的鼠李糖脂生產菌—銅綠假單胞菌PAO1、DSM 7108和DSM 2874進行了評價時，所選的發(fā)酵溫度即為30℃和37℃。

1.6 消泡

銅綠假單胞菌液態(tài)發(fā)酵生產鼠李糖脂是一個好氧過程，發(fā)酵過程中大量的通氣和快速攪拌會導致起泡嚴重，不利于發(fā)酵生產。傳統(tǒng)的消泡方式如流加消泡劑和機械消泡等，僅適用于鼠李糖脂產量較低的發(fā)酵過程，當產量較高時則無法滿足消泡要求。為此，THITIMA S等[29]開發(fā)了發(fā)酵偶聯泡沫分離的消泡技術，實現了鼠李糖脂的邊發(fā)酵邊泡沫分離。但是泡沫被分離液化后會含有大量的菌體和未利用的培養(yǎng)基，既浪費了發(fā)酵基質又增加了后續(xù)鼠李糖脂分離純化的難度，不利于鼠李糖脂的發(fā)酵生產。CHAWALAC等[30]為了避免在鼠李糖脂發(fā)酵過程中進行大量通氣和快速攪拌，提出了一種在厭氧狀態(tài)下進行鼠李糖脂生物合成的全新策略，通過銅綠假單胞菌ATCC10145實現了鼠李糖脂的厭氧發(fā)酵，并優(yōu)化了培養(yǎng)基中碳、氮、磷、硫、鎂、鈣和鐵等離子的濃度得到了在厭氧條件下進行鼠李糖脂發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基配方，實現了鼠李糖脂的無泡沫產生。但是，目前該技術得到的鼠李糖脂產量還較低，僅為好氧發(fā)酵的1/3，限制了其進一步的應用。

曾報道一種采用在發(fā)酵罐排氣口處連接一個用于收集和液化泡沫的儲罐的方式，可有效解決鼠李糖脂的消泡問題[31]，具體的方法是將發(fā)酵產生的泡沫經尾氣出口進入儲罐，并在儲罐內進行液化，液化后的發(fā)酵液可被重新泵入發(fā)酵罐進行再次發(fā)酵。采用該發(fā)酵技術不僅減少了在消泡過程中造成的發(fā)酵基質損失，也可在儲罐上安裝消泡劑噴淋或壓力控制裝置等進行輔助消泡，是目前鼠李糖脂發(fā)酵中最有效的消泡方法。但是，這種發(fā)酵方式還不能解決發(fā)酵罐內部起泡的問題，無法對起泡后的發(fā)酵過程進行有效的監(jiān)測和調控，仍需要進一步優(yōu)化和改進。

1.7 補料分批發(fā)酵

補料分批發(fā)酵工藝可以使微生物在低濃度底物條件下持續(xù)發(fā)酵并可對產物進行一定的稀釋，有利于解除底物抑制和代謝產物阻遏等問題。但經研究者調查發(fā)現，對銅綠假單胞菌進行補料分批發(fā)酵的效果并不明顯（分批發(fā)酵鼠李糖脂產量范圍為6～112g/L，補料分批發(fā)酵為5～95g/L）。造成這種現象的原因可能是鼠李糖脂的發(fā)酵生產規(guī)律比較復雜，人們對此還缺乏理解[32]。此外，大多數高產的分批發(fā)酵都采用了較高濃度的植物油作為碳源，說明銅綠假單胞菌可在高初始油濃度的培養(yǎng)基中正常生長和代謝，不存在明顯的底物抑制現象。因此，有時單純通過補料來提高發(fā)酵的水平并不理想，還需要輔以其他調控方式來提高產量。如ZHU L等[19]通過在補料發(fā)酵中輔以分段控制pH的方式得到70.56 g/L的鼠李糖脂產量，比相同條件下的分批發(fā)酵產量提高了193%。

2 半固態(tài)發(fā)酵生成鼠李糖脂

半固態(tài)發(fā)酵是指在基質中含有部分游離水的體系中進行的發(fā)酵，一般常用于釀酒、泡菜等傳統(tǒng)釀造食品的生產中，在鼠李糖脂發(fā)酵中的報道較少[33-34]。王盼盼等[8]以菜籽粕和麩皮為固相載體、甘油為碳源，采用半固態(tài)發(fā)酵的方式得到18.7g/L的鼠李糖脂，并且乳化系數要高于同等條件下液態(tài)發(fā)酵的鼠李糖脂。半固態(tài)發(fā)酵所使用的固相載體一般為廉價的農業(yè)廢棄物，會導致發(fā)酵液中存在大量的固相載體及其浸出物，增加了后續(xù)分離純化的困難，不利于鼠李糖脂的提取純化。但是，半固態(tài)發(fā)酵法生產鼠李糖脂也有一定的存在價值，如采用廉價的農業(yè)廢棄物作為發(fā)酵的固相載體，既降低了原料成本又在一定程度上減少了泡沫的產生，增加了鼠李糖脂的經濟性。此外，半固態(tài)發(fā)酵得到的鼠李糖脂在土壤修復、生物農藥及葉面肥料等鼠李糖脂純度要求較低的領域也具有一定的應用潛力。

3 固態(tài)發(fā)酵生成鼠李糖脂

固態(tài)發(fā)酵是指在基質中不含有游離水的體系中進行的發(fā)酵，是一種發(fā)展已久的發(fā)酵技術?？墒请S著大規(guī)模深層液態(tài)發(fā)酵技術的廣泛應用和巨大成功，固態(tài)發(fā)酵逐漸被人們忽視了。但是與液態(tài)深層發(fā)酵相比，固態(tài)發(fā)酵仍具有一些自身的優(yōu)勢，如對基質要求低、設備占用空間小、通氣狀況良好和無需快速攪拌等。因此，為避免液態(tài)發(fā)酵起泡嚴重的問題，人們開始考慮利用固態(tài)發(fā)酵技術來生產鼠李糖脂。如DOUMIT C N等[9]以銅綠假單胞菌UFPEDA 614為生產菌株，利用甘蔗渣為固相載體進行鼠李糖脂的固態(tài)發(fā)酵得到了46 g/L的鼠李糖脂，并且整個發(fā)酵過程中無泡沫產生，后來通過進一步的優(yōu)化，得到了一種更低成本的鼠李糖脂固態(tài)發(fā)酵工藝，提高了固態(tài)發(fā)酵生產鼠李糖脂的經濟性[10]。此外，NALINI S等[35-36]也采用固態(tài)發(fā)酵技術成功的得到了鼠李糖脂。

目前對于固態(tài)發(fā)酵生產鼠李糖脂的研究較少，僅限于搖瓶發(fā)酵報道，而且鼠李糖脂產量相對較低、產物中雜質多、提純困難，再加上大規(guī)模固態(tài)發(fā)酵罐生產自身的技術問題，要實現鼠李糖脂的固態(tài)發(fā)酵生產還有很長的路要走。但是利用固態(tài)發(fā)酵技術生產鼠李糖脂為當前鼠李糖脂的發(fā)酵生產提供了另一種研究思路，具有一定的參考價值。

4 問題與展望

經過幾十年的研究，人們對銅綠假單胞菌發(fā)酵生產鼠李糖脂的認識已經越來越全面，并且實現了一定規(guī)模的工業(yè)化生產。但是仍然存在著發(fā)酵生產效率較低、原料的成本過高、下游的提純工藝復雜且昂貴等諸多問題，導致其在經濟上與廉價的化學合成的表面活性劑相比不占優(yōu)勢，限制了鼠李糖脂工業(yè)的進一步發(fā)展。為此，今后可在以下幾方面繼續(xù)加強研究：

（1）提高發(fā)酵生產的效率。加強銅綠假單胞菌的遺傳學研究，通過基因工程手段改良菌種，從而從源頭上提高發(fā)酵生產的效率；改進發(fā)酵工藝，解決諸如起泡嚴重帶來的生產問題，提高設備利用率。

（2）降低原料成本。尋找廉價的可替代原料為底物，改變現有的普遍以昂貴植物油為碳源的發(fā)酵現狀，對發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化和復配，減少昂貴培養(yǎng)基組分的用量，降低生產成本。

（3）改進下游提純工藝。整合優(yōu)化現有的提取方法，探索高效、簡便的提純工藝，并建立有效的廢液回收機制，降低生產成本。

（4）加快鼠李糖脂的應用研究，拓展應用范圍。鼠李糖脂生物表面活性劑作為一種新型的表面活性劑，其應用研究還處于起步階段，許多應用領域還待開發(fā)，很多應用技術還待完善。所以應重視并加快鼠李糖脂的應用研究，拓展應用范圍，增加市場需求。通過市場需求帶動鼠李糖脂相關產業(yè)的全面發(fā)展，近而反哺和推動相關技術的進步。

總之，隨著社會的進步和人們環(huán)保意識的增強，21世紀的表面活性劑正朝著安全、溫和及易生物降解的方向發(fā)展，以鼠李糖脂為代表的生物表面活性劑將會擁有更加廣闊的市場前景。銅綠假單胞菌發(fā)酵生產鼠李糖脂的研究，也將會迎來新的高速發(fā)展期。

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Fermentation method and condition of rhamnolipid biosurfactant byPseudomonas aeruginosa

GONG Zhijin,CHE Chengchuan,YANG Ge,LIU Jinfeng,LIANG Guangjie,LIANG Xinxin,LIU Shengge
(College of Life Science,Qufu Normal University,Qufu 273165,China)

Fermentation technology of rhamnolipid was reviewed byPseudomonas aeruginosain this paper,including liquid-state fermentation,semi-solid state fermentation and solid-state fermentation.In addition,influencing factors were specially summarized in liquid-state fermentation,such as carbon source,nitrogen source,inorganic salt,temperature,pH,defoaming method and batch-fed fermentation,which could provide a good idea and reference for the fermentation of rhamnolipid biosurfactant byPseudomonas aeruginosa.

Pseudomonas aeruginosa;rhamnolipid;fermentation;biosurfactant

Q93

0254-5071（2017）10-0130-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.027

2017-08-10

國家級“本科教學工程”專業(yè)綜合改革試點（ZG0293）；高校應用型人才培養(yǎng)專業(yè)發(fā)展支持計劃（魯教高字[2015]5號）；曲阜師范大學科技計劃（xkj201610）

鞏志金（1988-），男，助理實驗師，碩士，研究方向為代謝與發(fā)酵工程。