黃荷鳳 陳露婷

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國(guó)際和平婦幼保健院（200030），上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院胚胎源性疾病研究所，生殖遺傳教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

·專家論壇·

輔助生殖與表觀遺傳

黃荷鳳 陳露婷

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國(guó)際和平婦幼保健院（200030），上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院胚胎源性疾病研究所，生殖遺傳教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

表觀遺傳（Epigenetics）是近年來(lái)生命科學(xué)的重大發(fā)現(xiàn)和研究熱點(diǎn)之一。大量用經(jīng)典遺傳學(xué)無(wú)法解釋的現(xiàn)象說(shuō)明：相同的基因組完全可以具有不同的表型。例如，已公認(rèn)同卵雙生的孿生子具有完全相同的基因組，如果這兩個(gè)孿生子在同樣的環(huán)境下成長(zhǎng)，按照經(jīng)典遺傳學(xué)理論，兩人的氣質(zhì)和體質(zhì)應(yīng)該非常相似。但研究者發(fā)現(xiàn)，同卵孿生子隨著年齡的增長(zhǎng)，會(huì)患有不同的成年性疾病，并不符合預(yù)期理論。經(jīng)典遺傳學(xué)明確指出，遺傳的分子基礎(chǔ)是核酸，生命的遺傳信息儲(chǔ)存在核酸的堿基序列上。但近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，在不影響DNA序列的情況下改變基因組的修飾，不僅可以影響個(gè)體發(fā)育，而且還可以遺傳至其子代，甚至子二代。這類遺傳變異就被稱為表觀遺傳修飾，并被認(rèn)為是導(dǎo)致遺傳物質(zhì)一致的孿生子出現(xiàn)個(gè)體差異的主要原因。由此可見，生殖與表觀遺傳密切相關(guān)。由于干預(yù)時(shí)間和措施的特殊性，輔助生殖技術(shù)（ART）與生殖遺傳，特別是表觀遺傳具有密不可分的聯(lián)系。本文將從表觀遺傳與基因印記、ART與表觀遺傳以及ART子代安全性三方面進(jìn)行闡述。

1 表觀遺傳與基因印記

生殖遺傳是指通過兩性生殖細(xì)胞內(nèi)染色體上的基因，將遺傳信息一代一代傳遞下去，使子代具有親代的表型特征，生殖遺傳遵循孟德爾定律。表觀遺傳則是指DNA序列不發(fā)生變化，但基因表達(dá)卻發(fā)生了可遺傳的改變。表觀遺傳具有后成修飾、不遵循孟德爾遺傳定律、獲得遺傳改變表觀遺傳、可逆性的基因調(diào)節(jié)4個(gè)特點(diǎn)，從DNA修飾、蛋白修飾和非編碼RNA調(diào)控3個(gè)層面調(diào)控基因的表達(dá)。表觀遺傳學(xué)研究主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、X染色體失活和基因印記等方面。DNA甲基化是一種主要的表觀遺傳修飾形式，調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)，目前表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域的研究大多從甲基化狀態(tài)入手。組蛋白修飾指核小體游離在外的N－端可以受到乙?；?、甲基化、磷酸化、泛素化和ADP核糖基化等各種各樣的修飾。X染色體失活使哺乳動(dòng)物保持了體內(nèi)染色體的平衡和性別的平衡，即劑量補(bǔ)償效應(yīng)，X染色體失活中心（XIC）是X染色體失活的關(guān)鍵作用元件。

基因印記（genomic imprinting）是表觀遺傳修飾的一種特殊形式，是指某些基因不遵守孟德爾定律（親代來(lái)源不改變等位基因的行為），而根據(jù)來(lái)源于親代的不同，在等位基因上發(fā)生的差異性表達(dá)，一般表現(xiàn)為某一等位基因不表達(dá)或表達(dá)極弱。具有印記的等位基因稱為印記基因。印記基因不遵循孟德爾遺傳定律的表達(dá)規(guī)律，而是親緣性相關(guān)的差異性表達(dá)或抑制，即單等位基因表達(dá)或抑制。若印記在母源性等位基因位點(diǎn)，則該印記基因的母源性等位基因位點(diǎn)多表現(xiàn)為抑制（不表達(dá)），而該印記基因?qū)?yīng)的父源性等位基因位點(diǎn)不抑制（多表達(dá)），這種印記基因稱為母系印記；反之則稱為父系印記。如定位于人類染色體11p.15.5上的胰島素樣生長(zhǎng)因子2（IGF－2）為母源性印記基因，甲基化印記在母源性等位基因位點(diǎn)上，表現(xiàn)為母源抑制，父源表達(dá)。印記基因在有絲分裂中能穩(wěn)定傳遞給子細(xì)胞，而在生殖細(xì)胞中，配子形成過程中擦除上一代的印記，建立新的印記并傳遞給子代；因此，在配子和胚胎發(fā)育過程中，印記基因經(jīng)歷擦除、重建、維持三個(gè)階段。母系印記的建立始于出生后的卵母細(xì)胞生長(zhǎng)期，直到受精后才全部完成；父系印記的建立早于卵子，開始于出生前，主要發(fā)生在減數(shù)分裂之前的精原細(xì)胞階段，到出生時(shí)基本結(jié)束。

印記基因多成群存在，功能上多相互關(guān)聯(lián)。每個(gè)子代個(gè)體的基因組印記在親代配子發(fā)育成熟階段重新形成，形成的基因組印記在配子形成受精卵后保持穩(wěn)定，影響子代個(gè)體（含胎盤）的生殖發(fā)育和出生后的生物學(xué)行為，與個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育、胎盤發(fā)育、腫瘤發(fā)生和神經(jīng)缺陷疾病及其他人類遺傳病的發(fā)生密切相關(guān)。印記基因的存在反映了性別的競(jìng)爭(zhēng)，從目前發(fā)現(xiàn)的印記基因來(lái)看，父系表達(dá)基因促進(jìn)子代生長(zhǎng)發(fā)育、增大胎兒的體型，而母系表達(dá)基因則是限制子代的無(wú)限生長(zhǎng)，避免消耗過多資源。因此沉默父系表達(dá)基因?qū)е绿簩m內(nèi)生長(zhǎng)遲緩，而沉默母系表達(dá)基因則引起胎兒過度生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)需求增多。父母系基因在后代發(fā)育中相互拮抗，以維持發(fā)育的平衡，即為“父母印記基因矛盾假說(shuō)（Parent Conflict Hypothesis）”。

2 輔助生殖技術(shù)與表觀遺傳

ART包括體外受精－胚胎移植（IVF－ET）、卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）、宮腔內(nèi)人工授精（IUI）以及植入前遺傳學(xué)診斷（PGD）等。關(guān)于ART與印記基因疾病的相關(guān)性隨著表觀遺傳學(xué)的發(fā)展已成為生殖安全研究的前沿和熱點(diǎn)。大量研究顯示，在患者不孕不育影響下，超促排卵（COS）、卵子體外成熟（IVM）、體外受精（IVF）、胚胎操作等非生理性干預(yù)可從不同角度、不同程度對(duì)子代表觀遺傳造成干擾，從而引發(fā)印記基因疾病。自2002年Cox等［1］報(bào)道ICSI可增加Angelman綜合征（AS）風(fēng)險(xiǎn)以來(lái)，多項(xiàng)研究指出，ART出生子代中由基因印記缺陷導(dǎo)致Beckwith－Wiedemann綜合征（BWS）和AS患病率明顯升高。BWS和AS是兩種最常見的印記基因疾病，在自然妊娠子代中罕見。AS與ICSI相關(guān)性明顯，已證實(shí)其與染色體15q11－q13上SNRPN基因印記異常有關(guān)，而非DNA基因序列改變引起，而BWS與IVF和ICSI都有相關(guān)性，部分患者存在LIT1和H19基因印記異常，也有部分患者母源性等位基因KvDMR1區(qū)域存在甲基化丟失。

超促排卵階段與配子發(fā)育階段高度重合，這個(gè)階段正是印記基因的甲基化等表觀遺傳修飾的主要階段，因此更有可能干擾基因組印記的建立和維持。母系印記基因較父系印記基因更易受到外界環(huán)境影響。研究表明，ART引起的BWS和AS都是母源基因低表達(dá)或不表達(dá)引起的，而由于父源基因表達(dá)受抑制引起的類AS疾病Prader－Willi綜合征（PWS）卻未與ART顯著相關(guān)，這印證了母源等位基因印記異常時(shí)ART相關(guān)印記基因疾病的重要發(fā)病機(jī)制。眾多排除了不孕癥背景干擾的動(dòng)物促排卵模型研究表明，體內(nèi)授精的促排卵組小鼠在2細(xì)胞胚胎時(shí)整體基因組甲基化異常概率更高［2］，在促排卵小鼠不同時(shí)期的胚胎和胎盤中，Igf2／H19、Kcnq1lot1和Snrpn等多個(gè)重要的印記基因表達(dá)水平與甲基化狀態(tài)都有明顯改變［35］。

卵子體外成熟（IVM）以及卵子或卵巢組織冷凍技術(shù)，在保存生育力方面發(fā)揮了重要作用，為手術(shù)后、化療后卵巢功能損傷較大的女性患者提供了生育機(jī)會(huì)。在ART中，為避免卵巢過度刺激，IVM有時(shí)也充當(dāng)了替代促排卵以獲得成熟卵子的手段。雖然由于IVM技術(shù)尚未廣泛應(yīng)用于臨床，目前還未發(fā)現(xiàn)由IVM造成的ART相關(guān)印記基因疾病，但已有研究證據(jù)表明，人和小鼠卵子經(jīng)過IVM后，H19、Mest／Peg1等印記基因均出現(xiàn)異常甲基化［67］。但關(guān)于IVM對(duì)卵子基因印記的獲得、擦除及重建是否有干擾及干擾機(jī)制仍存在爭(zhēng)議，有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

IVF不僅使受精這一妊娠重要環(huán)節(jié)脫離了母體環(huán)境，并伴隨著大量對(duì)受精卵的體外操作，這兩個(gè)因素均可能引起印記異常。而ICSI更是繞過了人類天然的優(yōu)勝劣汰選擇，讓活力不足、質(zhì)量低下的精子獲得使卵子受精的機(jī)會(huì)，更有可能引起表觀遺傳學(xué)異常。與體內(nèi)授精相比，IVF的胎盤和臍帶血中有7000多個(gè)基因的平均甲基化程度發(fā)生明顯改變，相應(yīng)的基因表達(dá)也隨之出現(xiàn)差異［8］。也有證據(jù)提示，到囊胚期為止，ICSI與常規(guī)IVF的表觀遺傳學(xué)異常改變，包括基因組總甲基化程度與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變是相似的［9］。不過，與ICSI相比，未成熟精子卵漿內(nèi)注射（ROSI）胚胎存在更多的表觀遺傳修飾異常，可能導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常。

胚胎培養(yǎng)與移植等胚胎體外操作應(yīng)用甚廣，因此非自然環(huán)境下成長(zhǎng)的胚胎能否保持正常的表觀遺傳修飾，ART相關(guān)印記基因疾病是否與胚胎操作有關(guān)，得到廣大學(xué)者的密切關(guān)注。胚胎體外培養(yǎng)不僅會(huì)引起印記基因甲基化異常［10］，更可能產(chǎn)生遠(yuǎn)期的健康損害［11］。由于臨床中的胚胎體外培養(yǎng)必定伴隨著對(duì)胚胎的人工操作，所以單純研究體外培養(yǎng)對(duì)胚胎印記基因的影響較難實(shí)現(xiàn)。也有研究表明，僅進(jìn)行胚胎收集、胚胎移植而基本不進(jìn)行胚胎培養(yǎng)也會(huì)引起多個(gè)印記基因的表達(dá)水平異常和甲基化異常，甚至“大胎綜合征”（Large Offspring Syndrome，LOS）等印記基因疾病。

3 輔助生殖技術(shù)子代安全性

ART解決了大量不孕夫婦的生育問題，且其中很多技術(shù)都與優(yōu)生密切相關(guān)，特別是PGD和胚胎植入前遺傳學(xué)篩查（PGS）技術(shù)，可以從根本上阻止某些遺傳病和先天性疾病的發(fā)生，但大量流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，ART子代不良健康風(fēng)險(xiǎn)增加，且罕見遺傳病和表觀遺傳疾病發(fā)生率增加。因此ART的子代安全性問題已經(jīng)日益引起人們的廣泛關(guān)注。ART子代健康風(fēng)險(xiǎn)，又稱為胚胎源性疾病（EFOD）［12］，是指配子發(fā)生和胚胎發(fā)育異常引發(fā)的子代出生后不良健康狀態(tài)，既可表現(xiàn)為發(fā)育遲緩和出生缺陷，也可表現(xiàn)為兒童和成人期糖尿病、心血管病等慢性疾病，甚至可能影響生育及出現(xiàn)隔代不良遺傳風(fēng)險(xiǎn)。胚胎源性成人疾病主要包括四大類：①代謝性疾病，如糖尿病；②心血管疾病，如高血壓、冠心??；③精神類疾病，如自閉癥、腦癱；④腫瘤性疾病。胚胎源性成人疾病具有傳代效應(yīng)，甚至隔代傳代效應(yīng)，如宮內(nèi)高糖環(huán)境能引起雄性子代生殖細(xì)胞Igf2／H19基因印記異常，并通過父系遺傳引起子二代的出生體重增加［13］。

ART的遺傳風(fēng)險(xiǎn)是ART子代安全性研究的主要內(nèi)容。ART子代安全性主要受到以下兩方面的威脅：一是ART技術(shù)實(shí)施過程中發(fā)生的突變基因和DNA修飾異常通過生殖細(xì)胞直接影響子代，二是通過IVF和胚胎移植技術(shù)將父母生殖障礙相關(guān)致病因子或?qū)⒓易逍赃z傳病基因傳遞給子代。所以，對(duì)不孕遺傳背景的深入分析、對(duì)ART操作安全性的全面評(píng)估均是我們關(guān)注的重點(diǎn)問題。在遺傳學(xué)背景方面，生育年齡（特別是女性高齡）、生殖系統(tǒng)疾病、遺傳病等均為子代遺傳安全性的關(guān)鍵影響因素。研究表明，女性妊娠前高雄激素癥可增加子代糖代謝異常的風(fēng)險(xiǎn)，而表觀遺傳改變的傳代效應(yīng)可能是其分子機(jī)制之一［14］。中重度少精癥患者精子印記基因DNA發(fā)生差異甲基化區(qū)域（DMR）甲基化異常，精子發(fā)生異?；颊叽嬖贒NA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）表達(dá)異常和MEST基因甲基化異常，少精癥患者H19甲基化水平下降。在ART本身操作安全性方面，超促排卵、配子體外成熟、胚胎體外培養(yǎng)、顯微操作、胚胎凍融等干預(yù)都有可能對(duì)配子和胚胎的發(fā)育造成影響。對(duì)ART子代胎盤的蛋白表達(dá)譜的全面篩查結(jié)果顯示，ART子代胎盤中存在差異表達(dá)蛋白，這些蛋白涉及胎盤功能的多個(gè)方面；對(duì)ART子代的Y染色體微缺失的篩查結(jié)果顯示，ART子代Y染色體的新發(fā)微缺失發(fā)生率增高；對(duì)ART子代的基因組學(xué)研究結(jié)果顯示，ART子代存在差異表達(dá)基因，且部分為印記基因，并伴隨基因印記修飾的改變。因此，ART可能會(huì)增加子代不良健康的風(fēng)險(xiǎn)，其影響涉及到基因、蛋白表達(dá)等多個(gè)層次，從而影響子代表型。在臨床上，可以從以下幾方面不斷改進(jìn)ART技術(shù)，以減少可能產(chǎn)生的ART子代風(fēng)險(xiǎn)：①個(gè)體化的促排卵方案；②接近人類正常體液和宮內(nèi)環(huán)境的培養(yǎng)基；③克服體外操作損傷；④適時(shí)的胚胎移植策略。

綜上所述，ART技術(shù)與生殖遺傳密切相關(guān)，學(xué)習(xí)和掌握現(xiàn)代遺傳、表觀遺傳學(xué)知識(shí)是每個(gè)生殖醫(yī)學(xué)工作者所必需的。遺傳異常往往是導(dǎo)致不孕癥的一個(gè)重要原因，對(duì)不孕癥患者治療前進(jìn)行遺傳學(xué)分析，可有效防止遺傳缺陷的垂直傳遞。生殖醫(yī)學(xué)工作者需密切關(guān)注ART子代狀態(tài)，采取適當(dāng)措施控制不良風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生。同時(shí)，我們也必須認(rèn)識(shí)到，ART子代中遺傳與表觀遺傳異常風(fēng)險(xiǎn)尚需進(jìn)一步研究，并分析其與ART操作的具體關(guān)系，不斷提高技術(shù)水平，在利用ART為人類解決不孕問題的同時(shí)，重視生殖健康和生殖安全，提高人口素質(zhì)。

［1］ Cox GF，Burger J，Lip V，et al.Intracytoplasmic sperm injection may increase the risk of imprinting defects［J］.Am J Hum Genet，2002，71（1）：162－164.

［2］ Shi W，Haaf T.Aberrant methylation patterns at the two－cell stage as an indicator of early developmental failure［J］.Mol Reprod Dev，2002，63（3）：329－334.

［3］ Fauque P，Jouannet P，Lesaffre C，et al.Assisted Reproductive Technology affects developmental kinetics，H19Imprinting Control Region methylation and H19gene expression in individual mouse embryos［J］.BMC Dev Biol，2007，7：116.

［4］ Fortier AL，Lopes FL，Darricarrere N，et al.Superovulation alters the expression of imprinted genes in the midgestation mouse placenta［J］.Hum Mol Genet，2008，17（11）：1653－1665.

［5］ Market－Velker BA，Zhang L，Magri LS，et al，Dual effects of superovulation：loss of maternal and paternal imprinted methylation in a dose－dependent manner［J］.Hum Mol Genet，2010，19（1）：36－51.

［6］ Borghol N，Lornage JB，Sophie GA，et al.Epigenetic status of the H19locus in human oocytes following in vitro maturation［J］.Genomics，2006，87（3）：417－426.

［7］ Kerjean A.Couvert P T，Chalas C，et al，In vitro follicular growth affects oocyte imprinting establishment in mice［J］.Eur J Hum Genet，2003，11（7）：493－496.

［8］ Katari S，Turan，N，Bibikova M，et al，DNA methylation and gene expression differences in children conceived in vitro or in vivo［J］.Hum Mol Genet，2009，18（20）：3769－3778.

［9］ Santos F，Hyslop L，Stoj kovic P，et al.Evaluation of epigenetic marks in human embryos derived from IVF and ICSI［J］.Hum Reprod，2010，25（9）：2387－2395.

［10］ Market－Velker BA，F(xiàn)ernandes AD，MannM R，et al.Side－byside comparison of five commercial media systems in a mouse model：suboptimal in vitro culture interferes with imprint maintenance［J］.Biol Reprod，2010，83（6）：938－950.

［11］ Fernandez－Gonzalez R，et al.Suboptimal in vitro culture conditions：an epigenetic origin of long－term health effects［J］.Mol Reprod Dev，2007，74（9）：1149－1156.

［12］ Huang HF，Sheng JZ.Gamete and Embryo－fetal Origins of Adult Diseases［M］：Springer，2014.

［13］ Ding GL，Wang FF，Shu J，et al.Transgenerational glucose intolerance with Igf2／H19epigenetic alterations in mouse islet induced by intrauterine hyperglycemia［J］.Diabetes，2012，61（5）：1133－1142.

［14］ Tian S，Lin XH，Xiong YM，et al.Prevalence of Prediabetes Risk in Offspring Born to Mothers with Hyperandrogenism［J］.EBioMedicine，2017，16：275－283.

［責(zé)任編輯：張 璐］

10.3969／j.issn.1004－8189.2017.04.001

2017－03－15