湯文天， 王 靜， 劉 駿 △， 陸曉華， 王國(guó)光， 姜玉新

(1蕪湖市第一人民醫(yī)院心血管內(nèi)一科， 安徽 蕪湖 241000； 皖南醫(yī)學(xué)院 2機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心，3病理生理教研室， 4生理教研室， 安徽 蕪湖 241002)

?

牛磺酸減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的大鼠心肌損傷*

湯文天1， 王 靜1， 劉 駿1△， 陸曉華2， 王國(guó)光3， 姜玉新4

(1蕪湖市第一人民醫(yī)院心血管內(nèi)一科， 安徽 蕪湖 241000； 皖南醫(yī)學(xué)院2機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心，3病理生理教研室，4生理教研室， 安徽 蕪湖 241002)

目的： 探討?；撬釋?duì)內(nèi)毒素(即脂多糖, LPS)誘導(dǎo)的大鼠心肌損傷的影響。方法: 健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠30只隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組、內(nèi)毒素模型組及?；撬崽幚斫M。正常對(duì)照組和內(nèi)毒素模型組大鼠尾靜脈注射生理鹽水，?；撬崽幚斫M大鼠尾靜脈注射?；撬?100 mg/kg)，2 h后，內(nèi)毒素模型組和牛磺酸處理組大鼠腹腔注射LPS(10 mg/kg)，正常對(duì)照組大鼠腹腔注射生理鹽水。注射內(nèi)毒素6 h后，采集血樣品和心肌組織，檢測(cè)血清超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、腫瘤壞死因子α(TNF-α)及白細(xì)胞介素6(IL-6)水平；光鏡下觀察心肌形態(tài)學(xué)變化；Western blot檢測(cè)心肌組織磷酸化核因子κB(p-NF-κB)、環(huán)氧合酶2(COX-2)、TNF-α、IL-6及血紅素加氧酶1(HO-1)的表達(dá)。結(jié)果: 與正常對(duì)照組比較，內(nèi)毒素模型組大鼠血清SOD活性及心肌組織HO-1表達(dá)明顯降低(P<0.01)，血清MDA、TNF-α和IL-6水平明顯升高(P<0.01)，心肌組織p-NF-κB、 COX-2、TNF-α及IL-6水平明顯升高(P<0.01)。與內(nèi)毒素模型組比較，牛磺酸處理組大鼠血清MDA、TNF-α和IL-6水平明顯降低(P<0.01)，?；撬崽幚砻黠@降低心肌組織COX-2、TNF-α、IL-6及p-NF-κB水平(P<0.01)，血清SOD活性及心肌組織HO-1表達(dá)明顯提高(P<0.01)。組織學(xué)觀察顯示內(nèi)毒素模型組大鼠心肌組織有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌纖維排列疏松不規(guī)則，而正常對(duì)照組和?；撬崽幚斫M大鼠心肌纖維排列整齊規(guī)則。結(jié)論: ?；撬犷A(yù)處理能減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的心肌損傷，其機(jī)制可能通過(guò)HO-1/CO信號(hào)下調(diào)p-NF-κB/COX-2而發(fā)揮作用。

?；撬?； 脂多糖； 心肌損傷

內(nèi)毒素亦稱脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的組成成分之一。由感染引起的內(nèi)毒素血癥(endotoxemia)或膿毒血癥為臨床上常見(jiàn)的一種全身炎癥反應(yīng)綜合征，心肌損傷是其重要的病理學(xué)變化。心肌損傷而導(dǎo)致的心功能障礙成為膿毒血癥患者死亡的重要原因[1-2]。?；撬崾?taurine, TAU)一種非蛋白含硫氨基酸，廣泛存在于各種動(dòng)物體內(nèi)，有許多重要的生物學(xué)功能，研究表明，牛磺酸有抗氧化及抗炎作用[3-4]。本研究旨在評(píng)價(jià)牛磺酸在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的心肌損傷中的心肌保護(hù)作用。

材 料 和 方 法

1 試劑

?；撬岷蚅PS購(gòu)自Sigma； SOD和MDA試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；TNF-α及IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自合肥博美生物工程有限公司；HO-1、TNF-α、IL-6、COX-2及NF-κB多克隆抗體購(gòu)自上海生物工程有限公司。

2 動(dòng)物分組及模型復(fù)制

雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠30只，體重260～300 g，購(gòu)自南京青龍山動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)(許可證號(hào)：SCXK2009-0001)。大鼠自由飲水、進(jìn)食，在1周的適應(yīng)后，隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照(control, CON)組、LPS模型組及TAU處理組，每組各10只。大鼠以戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉，正常對(duì)照組大鼠尾靜脈注射生理鹽水2 h后，腹腔注射生理鹽水；內(nèi)毒素模型組大鼠尾靜脈注射生理鹽水2 h后，腹腔注射LPS(10 mg/kg)；牛磺酸處理組大鼠尾靜脈注射?；撬?100 mg/kg)2 h后,腹腔注射LPS(10 mg/kg)。各組腹腔注射生理鹽水和LPS 6 h后，動(dòng)脈采集血樣品，處死，取心肌組織。

3 抗氧化作用分析

血樣品于1 200×g離心分離血清，血清SOD活性以黃嘌呤氧化酶法檢測(cè),血清MDA含量以硫代巴比妥酸比色法測(cè)定，操作過(guò)程嚴(yán)格按試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。SOD活性以×103U/L表示，MDA含量表示為μmol/L。

4 血清炎癥因子檢測(cè)

血清中TNF-α和IL-6以商業(yè)試劑盒檢測(cè)，操作過(guò)程嚴(yán)格按試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。血清TNF-α和IL-6濃度均表示為ng/L。

5 組織形態(tài)學(xué)觀察

取心肌置于10%中性甲醛中固定，石蠟包埋，切5 μm切片，以蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色，光學(xué)顯微鏡觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)，并拍照。

6 Western blot分析

取心肌0.2 mg于冰冷的PBS中洗去血跡，置入有2 mL冰冷的裂解液的勻漿器中，加20 μL新配苯甲基磺酰氟勻漿、裂解。裂解液在4 ℃下，以13 000 ×g轉(zhuǎn)速離心15 min。取含等量蛋白的裂解液以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離后，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，取出膜以含5%脫脂奶粉TBST液封閉，加HO-1、TNF-α、IL-6、COX-2及NF-κB多克隆抗體，在4 ℃下孵育過(guò)夜，加堿性磷酸酶標(biāo)記的Ⅱ抗孵育2 h后，洗膜后，DAB顯色。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 16．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間相互比較采用單因素方差分析及SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 ?；撬釋?duì)抗氧化作用的影響

與正常對(duì)照組比較，內(nèi)毒素組大鼠血清抗氧化酶SOD活性明顯降低(P<0.01)，脂質(zhì)過(guò)氧化標(biāo)志物MDA含量升高(P<0.01)；與內(nèi)毒素組比較，牛磺酸處理組大鼠血清SOD活性明顯升高(P<0.01)，MDA含量明顯降低(P<0.01)，見(jiàn)圖1。?；撬崽幚砻黠@提高SOD活性，降低MDA含量。

2 ?；撬岬目寡鬃饔?/p>

為評(píng)估牛磺酸的抗炎作用，檢測(cè)血清炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的變化。結(jié)果表明，內(nèi)毒素組大鼠血清炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-6水平較對(duì)照組明顯升高(P<0.01)，?；撬崽幚斫M大鼠血清TNF-α和IL-6水平較內(nèi)毒素組明顯降低(P<0.01)，提示?；撬峥赡苡幸种苾?nèi)毒素誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生，具有抗炎作用，見(jiàn)圖2。

3 心肌形態(tài)學(xué)變化

組織學(xué)觀察顯示，內(nèi)毒素組大鼠心肌有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌纖維排列疏松且不規(guī)則，并伴有斷裂及空泡化出現(xiàn)；?；撬崽幚斫M大鼠心肌纖維排列較為緊密而有規(guī)則，見(jiàn)圖3(圖中箭頭所示為炎癥細(xì)胞浸潤(rùn))。

Figure 1.Effects of taurine on SOD activity and MDA content in serum. Mean±SD.n=10.**P<0.01vsCON;##P<0.01vsLPS.

圖1 ?；撬釋?duì)大鼠血清SOD活性和MDA含量的影響

Figure 2. Effects of taurine on levels of TNF-α and IL-6 in serum. Mean±SD.n=10.**P<0.01vsCON;##P<0.01vsLPS.

圖2 ?；撬釋?duì)大鼠血清TNF-α和IL-6水平的影響

Figure 3. Effects of taurine on LPS-induced myocardial damage in rats (HE staining, ×400).

圖3 ?；撬釋?duì)心肌結(jié)構(gòu)的影響

4 ?；撬釋?duì)心肌組織蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較,內(nèi)毒素組大鼠心肌組織HO-1表達(dá)明顯降低，p-NF-κB、COX-2、TNF-α和IL-6表達(dá)明顯升高(P<0.01)；與內(nèi)毒素組相比，?；撬崽幚斫M大鼠HO-1表達(dá)明顯升高，p-NF-κB、COX-2、TNF-α和IL-6表達(dá)明顯降低(P<0.01)，見(jiàn)圖4。

討 論

由感染產(chǎn)生的大量?jī)?nèi)毒素進(jìn)入血液而引起的內(nèi)毒素血癥是臨床上非常常見(jiàn)的一種全身炎癥[5-6]。炎癥反應(yīng)的瀑布式爆發(fā)累及多種器官，導(dǎo)致重要器官功能障礙，累及心臟而發(fā)生心功能衰竭而使病情惡化，病死率提高[7-8]。因此，提高其防治是醫(yī)學(xué)研究的重要課題。

大量研究表明，炎癥反應(yīng)和炎癥細(xì)胞因子的釋放在內(nèi)毒素引起的心肌損傷中起著非常重要的作用[9]。內(nèi)毒素與細(xì)胞膜上Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)結(jié)合，進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄，表達(dá)增加。NF-κB通過(guò)磷酸化而被激活，進(jìn)一步上調(diào)COX-2的表達(dá)，COX-2可通過(guò)誘導(dǎo)前列腺素的產(chǎn)生參與炎癥及痛感[10]。炎癥細(xì)胞因子如TNF-α及IL-6等參與內(nèi)毒素引起的器官損傷，TNF-α可直接損傷心肌纖維[11]。本研究顯示，內(nèi)毒素處理大鼠血清及心肌炎癥細(xì)胞因子TNF-α及IL-6明顯升高，COX-2表達(dá)及NF-κB磷酸化水平提高，并且心肌有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。?；撬崾且环N內(nèi)源性非蛋白氨基酸，研究證明其具有許多生理功能，如有免疫調(diào)節(jié)作用[12]。?；撬嵩隗w內(nèi)可被轉(zhuǎn)化為牛磺酸氯胺，被認(rèn)為是一種低毒的炎癥調(diào)節(jié)物[13]。我們的研究結(jié)果顯示，?；撬犷A(yù)處理明顯改善內(nèi)毒素誘導(dǎo)的心肌形態(tài)學(xué)變化，降低內(nèi)毒素誘導(dǎo)的炎性因子水平，并降低COX-2表達(dá)及NF-κB磷酸化水平，提示?；撬峥赏ㄟ^(guò)抑制炎癥細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄信號(hào)，減少炎癥介質(zhì)釋放而起抗炎作用。

Figure 4. Effects of taurine on expression of HO-1, p-NF-κB, COX-2, TNF-α and IL-6 in myocardial tissues. Mean±SD.n=10.**P<0.01vsCON;##P<0.01vsLPS.

圖4 ?；撬釋?duì)大鼠心肌組織HO-1、p-NF-κB、COX-2、TNF-α和IL-6表達(dá)的影響

內(nèi)毒素誘導(dǎo)的活性氧及自由基的釋放是其致器官損傷的重要環(huán)節(jié)。在內(nèi)毒素血癥中，內(nèi)毒素調(diào)控的巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)釋放的活性氧及自由基激活NF-κB信號(hào)[14]，進(jìn)而調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)。因此，提高機(jī)體的抗氧化作用，降低活性氧有利于對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)及減輕組織損傷。研究證實(shí)，?；撬崽岣邫C(jī)體抗氧化酶，增強(qiáng)抗氧化作用。有研究顯示?；撬嵩黾親O-1的表達(dá)[15]。HO-1是一種誘導(dǎo)型酶，催化血紅素轉(zhuǎn)化為一氧化碳(CO)、膽綠素及游離鐵離子，催化產(chǎn)物一氧化碳和膽綠素均有抗炎及抗氧化作用[16-17]。并有研究進(jìn)一步證實(shí)HO-1/CO信號(hào)通過(guò)調(diào)控NF-κB/COX-2而抑制炎癥細(xì)胞因子釋放[18-19]。本研究的結(jié)果顯示，牛磺酸預(yù)處理提高SOD活性及HO-1的表達(dá)，并降低MDA的血清含量。提示牛磺酸通過(guò)提高抗氧化酶改善抗氧化作用。

綜上所述，?；撬犷A(yù)處理減輕內(nèi)毒素所誘導(dǎo)的心肌損傷。結(jié)果提示其作用通過(guò)提高抗炎及抗氧化作用，其機(jī)制可能是?；撬嵴T導(dǎo)的HO-1/CO信號(hào)通過(guò)調(diào)控NF-κB/COX-2而發(fā)揮作用。關(guān)于其詳細(xì)機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Protective effects of taurine on LPS-induced myocardial damage in rats

TANG Wen-tian1, WANG Jing1, LIU Jun1, LU Xiao-hua2, WANG Guo-guang3, JIANG Yu-xin4

(1FirstDepartmentofCardiovascularInternalMedicine,WuhuFirstPeople’sHospital,Wuhu241000,China;2ExperimentalCenterforFunctionSubjects,3DepartmentofPathophysiology,4DepartmentofPhysiology,WannanMedicalCollege,Wuhu241002,China.E-mail: 13905533991@163.com)

AIM: To investigate the effects of taurine on lipopolysaccharide (LPS)-induced myocardial damage in rats. METHODS: Healthy male SD rats (n=30) were randomly divided into control group (CON), LPS model group (LPS) and taurine treatment group (TAU). The rats in CON group and LPS group were intravenously injected with normal saline, and the rats in TAU group were injected with taurine (100 mg/kg). After 2 h, the rats in LPS group and TAU group were intraperitoneally injected with LPS at 10 mg/kg, and the rats in CON group were injected with normal saline. Six hours after injection of LPS, the blood samples were collected for determination of superoxide dismutase (SOD) activity, malondialdehyde (MDA) content, and tumor necrosis factor α (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6) levels. The myocardial tissues were processed for histological examination and the analysis of Western blot. RESULTS: Compared with CON group, LPS significantly reduced SOD activity in the serum and heme oxygenase 1 (HO-1) protein expression in the myocardial tissues, increased the serum content of MDA and levels of TNF-α and IL-6. LPS also significantly elevated the levels of TNF-α and IL-6, and up-regulated the cyclooxygenase-2 (COX-2) expression and phosphorylation of nuclear factor kappa B (NF-κB) in the myocardial tissues. Taurine pretreatment significantly elevated SOD activity and HO-1 protein expression level, decreased the levels of COX-2, TNF-α, IL-6 and phosphorylated NF-κB. Histological observation showed that taurine reduced inflammatory response in the myocardial tissue. CONCLUSION: Taurine attenuates LPS-induced myocardial damage in rats. The beneficial effects of taurine may be associated with its reduction of p-NF-κB/COX-2 signaling by activation of HO-1/CO.

Taurine; Lipopolysaccharides; Myocardial damage

1000- 4718(2017)01- 0123- 05

2016- 07- 25

2016- 10- 07

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81172790)

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.020

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