喻 晶， 張 宜， 刁 波

(中國人民解放軍武漢總醫(yī)院醫(yī)學實驗科，湖北 武漢 430070)

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JAK-STAT信號通路、IL-1β和IL-6在X射線輻照誘導PC12細胞損傷中的調控作用

喻 晶， 張 宜△， 刁 波

(中國人民解放軍武漢總醫(yī)院醫(yī)學實驗科，湖北 武漢 430070)

目的： 探究JAK-STAT信號通路及炎癥因子IL-1β、IL-6是否參與X射線誘導的PC12細胞輻射損傷。方法: 采用X射線分別以2、4和8 Gy劑量照射PC12細胞，照射后24 h通過酶聯(lián)免疫法檢測IL-1β和IL-6的表達水平；Western blot檢測p-JAK1、p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3和p-STAT5的蛋白水平。結果: 與正常對照組相比，細胞經(jīng)不同劑量X射線照射24 h后，IL-1β和IL-6的表達水平均升高，且與輻照劑量呈劑量依賴性；p-JAK1、p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3和p-STAT5的蛋白水平均升高，且上調程度與輻照劑量呈劑量依賴性。結論: JAK-STAT信號通路、IL-1β和IL-6可能參與X射線照射誘導PC12細胞的損傷調控。

X射線； PC12細胞； JAK-STAT信號通路； IL-1β； IL-6

隨著現(xiàn)代科學技術的迅猛發(fā)展，核能和核技術在能源、軍事、醫(yī)療衛(wèi)生等國民生活生產中的大量運用，人體受到電離輻射的機會日益增多。其中在醫(yī)療領域，放射治療已經(jīng)成為大腦原發(fā)性、繼發(fā)性腫瘤和腦轉移瘤等頭部腫瘤不可或缺的非手術治療手段，其療效顯著，明顯延長患者的生存期，但射線在對臨床疾病進行診斷與治療的同時，也使接受輻照的患者經(jīng)受不同程度的輻射后遺效應[1]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)是電離輻射暴露的主要靶器官，腦部在受到射線輻照后會出現(xiàn)頭痛、頭暈、疲勞乏力、學習記憶能力減退[2]、急性和慢性認知功能缺陷[3]等精神癥狀。

腦經(jīng)輻照后神經(jīng)細胞的損害多由于繼發(fā)性炎癥反應所致[4]。白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)作為一種炎性介質參與中樞神經(jīng)內分泌活動。Janus激酶-信號轉導子與轉錄激活子(Janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT)信號通路在免疫功能調節(jié)[5]以及神經(jīng)炎癥[6-7]等過程中發(fā)揮著特異且多效性的生物學功能，是細胞信號轉導的一個重要途徑。炎癥因子IL-1β、IL-6和JAK-STAT信號通路在輻照誘導神經(jīng)系統(tǒng)損傷中的調控作用未見報道。本實驗選取PC12細胞作為輻射的模型細胞，考察X射線暴露對PC12細胞輻照后的損傷效應，觀察輻照對炎癥因子IL-1β和IL-6以及JAK-STAT信號通路的影響，為進一步研究輻射對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷機制提供參考及實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 藥品、試劑與儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基購自HyClone；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自NQBB；胰蛋白酶購自Amersco；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量測定試劑盒購自碧云天生物公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)鼠抗人多克隆抗體購自杭州賢至生物有限公司；抗p-JAK1、p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3、p-STAT5、JAK1、JAK2、STAT1、STAT3和STAT5抗體購自Abcam；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記羊抗兔抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；IL-1β和IL-6酶聯(lián)免疫試劑盒購自Perprotech；TRIzol試劑購自Gibco；其它試劑購于國藥試劑，均為分析純。

醫(yī)用直線加速器(Electa-Precise e1293)；熒光化學成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；酶標分析儀(中國深圳雷杜生命科學股份有限公司)；超純水系統(tǒng)(Millipore)；DYCZ-40電泳儀和DYCZ-24DN垂直電泳槽(北京六一儀器廠)；水平搖床(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) PC12細胞由本院醫(yī)學實驗科保存。細胞用含10% FBS、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液，以1.0×108/L密度接種于培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱內常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

2.2 照射條件 采用6 MeV X射線，照射劑量為2、4和8 Gy，劑量率為200 cGy/min，皮靶距為60 cm，照射野為20 cm×20 cm。

2.3 IL-1β和IL-6的檢測 各劑量組細胞經(jīng)照射后24 h收集細胞上清液，使用酶聯(lián)免疫法測定，具體步驟參照IL-1β和IL-6酶聯(lián)免疫試劑盒進行。

2.4 Western blot實驗 將各組細胞分別經(jīng)2、4、8 Gy劑量輻照，24 h后棄去培養(yǎng)液，PBS洗3次，裂解液裂解細胞，以12 000 r/min離心15 min。收集細胞裂解物，蛋白濃度用BCA法進行測定。取40 μg總蛋白在十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)緩沖液中煮7 min，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)并電轉移至硝酸纖維素膜上。硝酸纖維素膜用含50 g/L脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫封閉90 min，然后依次滴加(1∶500～1∶1 000)的抗JAK1、JAK2、STAT1、STAT3、STAT5、p-JAK1、p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3、p-STAT5和GAPDH抗體，4 ℃過夜后TBST緩沖液洗滌 10 min、3次，然后用1∶5 000的HRP-羊抗兔或鼠IgG孵育2 h，然后用TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min。最后用增強化學發(fā)光(enhanced chemiluminescence, ECL)液進行曝光顯影，熒光化學成像系統(tǒng)進行照相并用其附帶的軟件分析蛋白的相對表達量。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0軟件處理，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 X射線輻照對PC12細胞IL-1β和IL-6含量的影響

PC12細胞經(jīng)2、4和8 Gy X射線輻照后，IL-1β的含量由正常對照組的(83.471±17.109) ng/L，分別增加到(139.975±16.420) ng/L、(225.378±21.007) ng/L和(301.674±23.415) ng/L。與正常對照組比較，PC12細胞經(jīng)X射線照射后IL-1β的含量升高均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖1。

PC12細胞經(jīng)2、4和8 Gy X射線照射后，IL-6含量由正常對照組的(115.585±7.783) ng/L，分別增加到(153.030±15.462) ng/L、(195.174±10.461) ng/L和(227.356±14.257)ng/L。與正常對照組比較，PC12細胞經(jīng)X射線照射后IL-6的含量升高均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖1。

2 X射線輻照對PC12細胞p-JAK1、p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3和p-STAT5蛋白水平的影響

PC12細胞經(jīng)2、4和8 Gy X射線照射后：p-JAK1的相對蛋白水平由0.359±0.0340分別上調到0.563±0.0573、0.0828±0.0404和0.972±0.0440；p-JAK2的相對蛋白水平由0.449±0.0404分別上調到0.569±0.0380、0.752±0.0358和0.891±0.0421；p-STAT1的相對蛋白水平由0.084±0.0273分別上調到0.252±0.0291、0.530±0.0521和0.711±0.0262；p-STAT3的相對蛋白水平由0.217±0.0510分別上調到0.490±0.0450、0.711±0.0528和0.961±0.0492；p-STAT5的相對蛋白水平由0.424±0.0535分別上調到0.620±0.0392、0.728±0.0401和0.872±0.0399。與正常對照組比較，PC12細胞經(jīng) X射線照射后p-JAK1、p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3和p-STAT5蛋白的水平上調均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖2。

Figure 1.The effect of X-ray irradiation on the levels of IL-1β and IL-6 in the PC12 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsnormal group.

圖1 X射線輻射對PC12細胞中IL-1β和IL-6含量的影響

Figure 2.The effect of X-Ray irradiation on the protein levels of p-JAK1, p-JAK2, p-STAT1, p-STAT3 and p-STAT5 in the PC12 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsnormal group.

圖2 X射線輻射誘導對PC12細胞中p-JAK1、p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3和p-STAT5的蛋白表達水平的影響

討 論

近年來，電離輻射已滲透到人類生產生活中的許多領域，如惡性腫瘤患者接受的放療、職業(yè)性工作者經(jīng)受的輻射性損害和航天飛行中人員受到的空間輻射等。輻射技術的高速發(fā)展帶來收益的同時也不可避免地給人們造成了輻射損害。電離輻射對中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響已成為國際放射防護委員會和聯(lián)合國原子輻射效應科學委員會非常關注的重要內容[8]。如何減少輻射帶來的損傷，保護人體的健康，已經(jīng)成為輻射防護研究人員和相關預防醫(yī)學工作者重要的研究課題[9]。

放射性的腦損傷是中樞神經(jīng)系統(tǒng)或臨近器官病變接受放療后經(jīng)過一段潛伏期，所產生的神經(jīng)系統(tǒng)損傷疾病，是放射性治療后最嚴重的并發(fā)癥，常為進行性，甚至是致死性[10]，目前仍沒有有效的治療手段。電離輻射引起生物活性分子的電離和激發(fā)是輻射生物效應的基礎，一般來說，照射劑量越大，劑量率越高，效應越顯著。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，電離輻射損傷可以引起機體一些細胞因子、酶類和基因表達的改變[11]，而一些分子的改變與機體的損傷程度和輻射劑量相關。本實驗發(fā)現(xiàn)，X射線輻照PC12細胞后，隨著輻照劑量的增加，細胞的損傷效應越嚴重，表現(xiàn)為釋放過量的炎癥因子，激活JAK-STAT信號通路。

輻射可以引起機體的炎癥反應，這種炎癥反應是通過自分泌或旁分泌產生的炎癥細胞因子介導的，炎癥因子是細胞對外界損傷刺激產生正常免疫反應的產物[12]。IL-1作為一種炎性介質參與中樞神經(jīng)內分泌活動，通過下丘腦-垂體-腎上腺軸，調節(jié)垂體前葉細胞的生長。IL-1有2種結構不同的分子：IL-1α和IL-1β，而以IL-1β為主要的分泌形式。IL-1發(fā)揮生物學作用是通過與位于其靶細胞膜上的高親和性受體結合來實現(xiàn)的，介導腦損傷后的許多病理生理反應，如發(fā)熱、白細胞聚集、血管內皮滲透性增加等，從而與腦水腫的形成及顱內壓的增高密切相關。正常情況下，腦組織中的IL-1活性較低，而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病理情況下，IL-1的活性則明顯增高。有研究發(fā)現(xiàn)，輻射可誘導大鼠腦組織局部炎癥因子IL-1β的明顯升高[13]。IL-1還可誘導中樞神經(jīng)系統(tǒng)中某些重要的神經(jīng)毒性分子的釋放，如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-6、IL-8等。其中，IL-6是炎癥反應和機體免疫的多向性細胞因子[14]，參與多種疾病的病理過程如免疫應答、急性期反應等，在不同組織中通過復雜的細胞信號傳導途徑，調節(jié)細胞增殖、分化和凋亡等[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-6參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)炎癥，調節(jié)許多重要的神經(jīng)元和突觸功能，包括突觸傳遞和突觸可塑性的細胞機制[16]，其在正常中樞神經(jīng)系統(tǒng)中低表達，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染和損傷時表達水平升高[17]。本實驗發(fā)現(xiàn)，PC12細胞經(jīng)X射線輻照后，輻照組IL-1β和IL-6的含量較未輻照組明顯增加，且隨著輻照劑量的增加，細胞釋放的IL-1β和IL-6亦增加，炎癥反應越嚴重。

此外，炎癥反應可以同時激活細胞內多種不同的應激信號通路，并使其之間的平衡關系發(fā)生改變。JAK-STAT信號通路作為IL-6家族下游主要的信號轉導通路，參與多種細胞因子誘導的信號轉導，涉及細胞的生長、分化、炎癥、突變和凋亡等多種神經(jīng)功能[18]。以往JAK-STAT信號通路的研究主要集中在腫瘤、肝臟、造血系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，JAK-STAT參與神經(jīng)炎癥、神經(jīng)退行性病變等神經(jīng)系統(tǒng)疾病，在細胞損傷及應激狀態(tài)下，JAK-STAT信號通路能被激活[19]。研究顯示，炎癥因子IL-6的上調可以激活STAT3的磷酸化[20]，海馬神經(jīng)元細胞在炎癥反應中出現(xiàn)促炎性細胞因子IL-6的升高，JAK1、STAT3和STAT5磷酸化的過表達[21]。與本實驗的結果。

生命是一個復雜的系統(tǒng)，從分子水平的事件發(fā)展到可觀察到的生物學效應，需要經(jīng)歷細胞、組織器官和系統(tǒng)等不同層次的信號傳導、調節(jié)和放大，發(fā)生在任一層級的任何效應都要經(jīng)歷一個時間過程且受許多環(huán)境因素的影響和多維空間的調節(jié)。本實驗發(fā)現(xiàn)，X射線輻照PC12細胞，誘導其釋放過量的炎癥因子IL-1β和IL-6，激活JAK-STAT信號通路的磷酸化，繼而進一步啟動損傷。炎癥因子IL-1β、IL-6和JAK-STAT信號轉導通路的異常激活，可能是電離輻射致神經(jīng)系統(tǒng)損傷的機制之一。然而，JAK-STAT信號通路下游調控分子，JAK-STAT信號通路抑制劑是否對輻射損傷有效，以及JAK-STAT是否與其它信號通路共同調控輻射致神經(jīng)系統(tǒng)損傷機制還有待更深入的研究。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effects of JAK-STAT signaling pathway, IL-1β and IL-6 on injury of PC12 cells with X-ray irradiation

YU Jing, ZHANG Yi, DIAO Bo

(DepartmentofMedicalExperiments,WuhanGeneralHospitalofChinesePeople’sLiberationArmy,Wuhan430070,China.E-mail:fish0826@163.com)

AIM: To investigate the role of JAK-STAT pathway, IL-1β and IL-6 in the PC12 cells with X-ray irradiation.METHODS: The PC12 cells were irradiated with X-ray at doses of 2, 4 and 8 Gy. After 24 h, the levels of IL-1β and IL-6 were detected by ELISA. The protein levels of p-JAK1, p-JAK2, p-STAT1, p-STAT3 and p-STAT5 were measured by Western blot.RESULTS: Compared with control group, the levels of IL-1β and IL-6 increased. The protein levels of p-JAK1, p-JAK2, p-STAT1, p-STAT3 and p-STAT5 increased with the doses of X-ray exposed.CONCLUSION: JAK-STAT signaling pathway, IL-1β and IL-6 play a role in the injury of PC12 cells with X-ray irradiation.

X-ray; PC12 cells; JAK-STAT signaling pathway; IL-1β; IL-6

1000- 4718(2017)01- 0174- 05

2015- 07- 27

2016- 03- 11

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.030

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△通訊作者 Tel: 027-50772965; E-mail: fish0826@163.com