朱立芬， 王 冰

(重慶市中醫(yī)院口腔科，重慶 400010)

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桔梗皂苷D防御口腔黏膜上皮細(xì)胞感染白色念珠菌的作用

朱立芬， 王 冰△

(重慶市中醫(yī)院口腔科，重慶 400010)

目的： 探討桔梗皂苷D對(duì)白色念珠菌黏附口腔黏膜上皮細(xì)胞的影響。方法: MTT法檢測(cè)不同桔梗皂苷D對(duì)口腔上皮KB細(xì)胞存活率的影響；將白色念珠菌、KB細(xì)胞以及不同濃度的桔梗皂苷D共同培養(yǎng)，革蘭染色檢測(cè)白色念珠菌黏附數(shù)，臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)檢測(cè)念珠菌活力和菌絲轉(zhuǎn)換率；ELISA法檢測(cè)上清液中IL-18與人β-防御素2 (HBD-2)的蛋白含量；實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot法分別檢測(cè)KB細(xì)胞中HBD-2 mRNA與蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果: 桔梗皂苷D對(duì)KB細(xì)胞存活率無(wú)影響；隨著桔梗皂苷D濃度的增加，白色念珠菌的黏附數(shù)、菌活力和菌絲轉(zhuǎn)換率逐漸下降，上清液中IL-18與HBD-2的蛋白含量以及KB細(xì)胞中HBD-2 mRNA表達(dá)與蛋白水平逐漸降低。結(jié)論: 桔梗皂苷D具有抑菌作用，并參與了口腔黏膜上皮細(xì)胞防御白色念珠菌感染的免疫反應(yīng)。

桔梗皂苷D； 口腔上皮細(xì)胞； 白色念珠菌

口腔念珠菌病是由于念珠菌屬感染所引起的口腔黏膜疾病。白色念珠菌(Candidaalbicans)是一種寄生在正常人群口腔、呼吸道、消化道以及生殖道等部分的機(jī)會(huì)性致病真菌。張程等[1]對(duì)118例口腔念珠菌進(jìn)行病理研究，發(fā)現(xiàn)白色念珠菌感染占73.7%。由于廣譜抗生素的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致許多患者的免疫力下降，破壞正常菌群平衡，使口腔中白色念珠菌的感染率明顯上升[2]。

桔梗皂苷D(platycodin D，PD)是從中藥桔梗提取分離的一種三萜單體，作為桔梗的主要有效成分之一，具有降血糖血脂、抗炎、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[3-4]。付凱等[5]對(duì)桔梗皂苷元進(jìn)行抑菌研究，發(fā)現(xiàn)其對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌均有一定的抑制作用，其中對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的抑制作用較強(qiáng)，但并未對(duì)白色念珠菌進(jìn)行相關(guān)的研究。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外觀察不同濃度桔梗皂苷D對(duì)白色念珠菌黏附KB細(xì)胞的情況，為桔梗皂苷D臨床上用于治療口腔黏膜白色念珠菌感染提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

KB細(xì)胞為永生化的口腔上皮細(xì)胞株，來(lái)源于口咽癌上皮細(xì)胞，是目前國(guó)際通用的口腔上皮細(xì)胞模型，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院天津血液病研究所；白色念珠菌(ATCC?10231TM)購(gòu)自南京便診生物科技有限公司；沙氏培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限公司；桔梗皂苷D購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自Solarbio；臺(tái)盼藍(lán)購(gòu)自Sigma；抗人β-防御素2 (human β-defensin 2, HBD-2)及GAPDH抗體購(gòu)自Santa Cruz。

2 方法

2.1 白色念珠菌菌懸液的制備 將白色念珠菌(ATCC?10231TM)菌株接種于沙氏液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)48 h，150 r/min，當(dāng)白色念珠菌生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，3 000 r/min離心15 min，溶于無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，調(diào)整菌懸液濃度為1×109/L備用，臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)證明活菌數(shù)大于95%。

2.2 KB細(xì)胞的培養(yǎng) 將KB細(xì)胞置于5% CO2培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)24 h，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)瓶底約90%時(shí)，換新鮮培養(yǎng)液。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，加入0.25%胰酶消化，重懸計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至5×109/L，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為5×108/L備用。

2.3 MTT法檢測(cè)桔梗皂苷對(duì)KB細(xì)胞存活率的影響 將濃度為5×108/L的KB細(xì)胞置于96孔培養(yǎng)板，加入桔梗皂苷D使其在培養(yǎng)液中最終濃度為：0、10、20、40、80、160和500 mg/L(其中以0 mg/L作為正常對(duì)照組)，置于37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜150 μL終止反應(yīng)，在波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定吸光度(A)值，每濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，設(shè)空白對(duì)照組。計(jì)算各濃度對(duì)KB細(xì)胞的存活率，存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組平均A值/對(duì)照組平均A值×100%。

2.4 白色念珠菌的黏附與活力的測(cè)定 將上述KB細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，置于5% CO2培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿(mǎn)皿底約80%，加入濃度為1×109/L的白色念珠菌懸液4 mL，分別加入桔梗皂苷D溶液0、5、10、20 μmol/L，共同培養(yǎng)，并于24 h后取出蓋玻片，PBS洗滌，于無(wú)水乙醇中固定15 min，革蘭氏染色，倒置在顯微鏡下觀察，計(jì)算黏附在KB細(xì)胞的白色念珠菌數(shù)。臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)檢測(cè)念珠菌活力和菌絲轉(zhuǎn)換率。

2.5 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-18與HBD-2的蛋白含量 取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KB細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，培養(yǎng)，使細(xì)胞貼壁，細(xì)胞形成單層后吸取培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)分為KB細(xì)胞對(duì)照(control，Con)組，加入1×109/L孢子相白色念珠菌及濃度為0、5、10、20 μmol/L的桔梗皂苷D溶液組，加入1×109/L菌絲相白色念珠菌及濃度為0、5、10、20 μmol/L的桔梗皂苷D溶液組。繼續(xù)培養(yǎng)12 h，取上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，于492 nm處測(cè)吸光值，計(jì)算IL-18與HBD-2的相應(yīng)蛋白含量。

2.6 熒光定量PCR測(cè)定KB細(xì)胞中HBD-2的mRNA表達(dá) 采用TRIzol法提取各組總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，HBD-2的上游引物為5’-CCAGCCATCAGCCATGAGGGT-3’，下游引物為5’-GGAGCCCTTTCTGAATCC GACA-3’；β-actin的上游引物為5’-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3’，下游引物為5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’；反應(yīng)條件為：95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,63 ℃ 5 min，40個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增完成后，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和擴(kuò)增曲線(xiàn)由PCR儀器自動(dòng)生成，所得結(jié)果直接在熒光定量操作系統(tǒng)中進(jìn)行比較分析，目標(biāo)基因的相對(duì)定量用2-ΔΔCt計(jì)算。

2.7 Western blot實(shí)驗(yàn) 收集各組細(xì)胞，加入裂解液，收集蛋白并定量，上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入含5%脫脂奶粉的TBST溶液，室溫放置1 h，加入相應(yīng) I 抗，4 ℃孵育過(guò)夜，再加入相應(yīng) II 抗，室溫孵育1 h，ECL顯色，成像掃描分析系統(tǒng)測(cè)定蛋白條帶的積分吸光度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，各組均數(shù)間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 顯微鏡觀察白色念珠菌與KB細(xì)胞黏附

顯微鏡下觀察可見(jiàn)正常KB細(xì)胞呈現(xiàn)扁平多角形，排列緊密，呈“鋪路石”狀；KB細(xì)胞感染白色念珠菌后，菌絲形態(tài)的白色念珠菌占絕大部分；加入桔梗皂苷D共同培養(yǎng)后，隨著桔梗皂苷D濃度的增加，菌絲狀態(tài)的白色念珠菌的數(shù)量逐漸減少，見(jiàn)圖1。

Figure 1. The effect of platycodin D on the adhesion ofCandidaalbicanswith KB cells (×200). A: normal KB cells; B: the KB cells adhered byCandidaalbicans; C: the KB cells adhered byCandidaalbicansafter treated with 20 μmol/L platycodin D.

圖1 桔梗皂苷D對(duì)白色念珠菌黏附KB細(xì)胞的影響

2 桔梗皂苷D對(duì)KB細(xì)胞存活率的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著桔梗皂苷D濃度的增加，KB細(xì)胞的存活率沒(méi)有顯著變化，但當(dāng)桔梗皂苷D到達(dá)500 mg/L時(shí)，KB細(xì)胞的存活率略微下降，但并不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖2。

3 白色念珠菌黏附數(shù)、菌活力、菌絲轉(zhuǎn)換率與桔梗皂苷D濃度的關(guān)系

如表1所示，在24 h之后，隨著桔梗皂苷D濃度的增加，細(xì)菌黏附數(shù)和菌活力均降低；菌絲轉(zhuǎn)換率由(91.54±2.71)%降低至(52.41±3.16)%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Figure 2. The effect of platycodin D (PD) on the viability of KB cells. Mean±SD.n=6.

圖2 桔梗皂苷D對(duì)KB細(xì)胞存活率的影響

表1 白色念珠菌黏附數(shù)、菌活力、菌絲轉(zhuǎn)換率與桔梗皂苷D濃度的關(guān)系

Table 1. The relationship of platycodin D (PD) concentration with adherent numbers, bacterial activity and conversion ofCandidaalbicans(Mean±SD.n=6)

ConcentrationofPDAdherentnumberBacterialactivity(%)Conversionrate(%)0μmol/L225±1299．25±0．4291．54±2．715μmol/L202±8?88．24±0．38?75．63±3．49?10μmol/L161±9?82．05±0．58?63．98±3．41?20μmol/L122±6?68．36±1．36?52．41±3．16?

*P<0.05vs0 μmol/L group.

4 KB細(xì)胞中IL-18與HBD-2蛋白含量的變化

未加桔梗皂苷D培養(yǎng)的KB細(xì)胞感染白色念珠菌后，培養(yǎng)上清液中IL-18與HBD-2蛋白含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，隨著加入桔梗皂苷D的濃度逐漸升高，孢子相與菌絲相組的IL-18與HBD-2蛋白含量逐漸降低，見(jiàn)圖3、4。我們用Western blot法進(jìn)一步檢測(cè)KB細(xì)胞中HBD-2蛋白表達(dá)的變化，結(jié)果顯示KB細(xì)胞自身的HBD-2 蛋白表達(dá)量少，當(dāng)白色念珠菌黏附KB細(xì)胞后，HBD-2蛋白表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，加入桔梗皂苷D干預(yù)后，孢子相組與菌絲相組的KB細(xì)胞HBD-2蛋白表達(dá)均隨桔梗皂苷D濃度增加而減少(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

5 KB細(xì)胞中HBD-2的mRNA表達(dá)

KB細(xì)胞自身HBD-2的mRNA表達(dá)量少，當(dāng)白色念珠菌黏附KB細(xì)胞后，HBD-2的mRNA表達(dá)量迅速上升(P<0.05)，加入桔梗皂苷D干預(yù)后，孢子相組與菌絲相組的KB細(xì)胞HBD-2的mRNA表達(dá)均隨桔梗皂苷D濃度增加而減少(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

Figure 3. The content of IL-18 in the culture supernatants of KB cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol (Con) group;#P<0.05vs0 μmol/L (spore form) group;△P<0.05vs0 μmol/L (hyphal form) group.

圖3 KB細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-18蛋白的含量

Figure 4. The content of HBD-2 in the culture supernatants of KB cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol (Con) group;#P<0.05vs0 μmol/L (spore form) group;△P<0.05vs0 μmol/L (hyphal form) group.

圖4 HBD-2蛋白在KB細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的含量

Figure 5. The protein expression of HBD-2 in the KB cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol (Con) group;#P<0.05vs0 μmol/L group.

圖5 HBD-2 蛋白在KB細(xì)胞中的表達(dá)

Figure 6. The mRNA expression of HBD-2 in the KB cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol (Con) group;#P<0.05vs0 μmol/L (spore form) group;△P<0.05vs0 μmol/L (hyphal form) group.

圖6 HBD-2 mRNA在KB細(xì)胞中的表達(dá)

討 論

白色念珠菌的毒力因子主要包括黏附、菌絲形成、表型轉(zhuǎn)換等，對(duì)白色念珠菌致病性起重要作用。白色念珠菌具有孢子相和菌絲相兩種基本形態(tài)，菌絲更容易持續(xù)黏附在上皮細(xì)胞的表面。有研究表明[6-7]，菌絲相的白色念珠菌更具有致病性，對(duì)宿主的黏附能力更強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，500 mg/L桔梗皂苷D對(duì)KB細(xì)胞不存在毒性，因此，本實(shí)驗(yàn)中所采用的桔梗皂苷D的劑量對(duì)黏膜上皮細(xì)胞不具有毒性。隨著桔梗皂苷D濃度的增加，白色念珠菌由孢子相向菌絲相改變逐漸減少，表明桔梗皂苷D能夠抑制白色念珠菌由孢子相向菌絲相轉(zhuǎn)變，并使白色念珠菌對(duì)KB細(xì)胞的黏附能力下降。臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示白色念珠菌均是以活體的形式侵入KB細(xì)胞，但隨著桔梗皂苷D的濃度增加，白色念珠菌黏附數(shù)顯著減少，由此推測(cè)桔梗皂苷D可能具有抑菌作用。

IL-18是一個(gè)重要的免疫調(diào)節(jié)因子。Tardif等[8]在人類(lèi)正?？谇火つそM織和唾液腺中檢測(cè)到IL-18。白色念珠菌感染口腔黏膜組織后，IL-18的表達(dá)顯著升高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示桔梗皂苷D能夠抑制IL-18的蛋白表達(dá)，可能是通過(guò)減少白色念珠菌與口腔上皮細(xì)胞的相互作用，使得上皮細(xì)胞IL-18的表達(dá)減少。

人β-防御素是具有廣譜抗菌(包括念珠菌)活性的小分子陽(yáng)離子多肽，對(duì)機(jī)體的免疫作用具有重要的影響[9]。HBD-2在念珠菌病頰黏膜上皮中的表達(dá)水平比健康頰黏膜高[10]。普遍認(rèn)為HBD-2在被感染的局部大量釋放，直接殺傷病原微生物，當(dāng)擴(kuò)散后其殺菌能力下降，進(jìn)而產(chǎn)生趨化活性，使更多的白細(xì)胞到達(dá)被感染的組織清除病原微生物[11]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，KB細(xì)胞自身的HBD-2表達(dá)少，白色念珠菌顯著誘導(dǎo)HBD-2的表達(dá)，與桔梗皂苷D共同培養(yǎng)后，HBD-2的表達(dá)均呈現(xiàn)了下降。但其機(jī)制尚未十分清楚。有研究發(fā)現(xiàn)病原微生物細(xì)胞壁上具有某些免疫反應(yīng)的激活分子，通過(guò)激活宿主上皮細(xì)胞的某些識(shí)別受體，如Toll樣受體，從而產(chǎn)生免疫應(yīng)答因子，如TNF、IL-1、IL-12等。

綜上所述，桔梗皂苷D能夠抑制白色念珠菌對(duì)口腔黏膜上皮細(xì)胞的黏附作用，可能通過(guò)參與口腔黏膜上皮細(xì)胞的免疫抑制作用而降低白色念珠菌對(duì)口腔黏膜的感染。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Platycodin D protects oral epithelial cells against infection of Candida albicans

ZHU Li-fen, WANG Bing

(DepartmentofStomatology,ChongqingHospitalofTraditionalChineseMedicine,Chongqing400010,China.E-mail: 187014511@qq.com)

AIM: To investigate the effect of platycodin D onCandidaalbicansinfection in oral epithelial cells. METHODS: The viability of the oral squamous carcinoma KB cells was detected by MTT assay after treated with different concentrations of platycodin D. The KB cells were infected withCandidaalbicans, and then were incubated with platycodin D at different concentrations. Adherent numbers of theCandidaalbicanswere counted by Gram staining, and the bacterial activity and conversion were measured by Trypan blue staining. Furthermore, the protein levels of IL-18 and human β-defensin 2 (HBD-2) were analyzed by ELISA, and the expression of HBD-2 at mRNA and protein levels was determined by RT-qPCR and Western blot, respectively. RESULTS: The viability of the KB cells was not affected by platycodin D at the concentrations used. The adherent numbers, bacterial activity and conversion were decreased by treatment with platycodin D in a dose-dependent manner. In addition, the protein level of IL-18 in the culture supernatant and the mRNA expression of HBD-2 in the KB cells were also reduced after platycodin D treatment.CONCLUSION: Platycodin D has a bacteriostasis effect and prevents oral epithelial cells fromCandidaalbicansinfection.

Platycodin D; Oral epithelial cells;Candidaalbicans

1000- 4718(2017)01- 0161- 05

2016- 04- 11

2016- 11- 07

R363; R379

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.027

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△通訊作者 Tel: 023-67063949; E-mail: 187014511@qq.com