袁秋貞，鄭 旭，劉 富，程曉毅，考玉萍

1. 陜西省中醫(yī)醫(yī)院藥劑科(西安 710003)，2. 陜西省食品藥品檢驗所藥理室(西安710000)，3. 西安市碑林區(qū)柏樹林社區(qū)衛(wèi)生服務中心(西安710000)，4. 西安市長安區(qū)醫(yī)院(西安710000)

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心肌片對缺血再灌注心肌細胞凋亡的影響

袁秋貞1，鄭 旭2，劉 富3，程曉毅4，考玉萍1

1. 陜西省中醫(yī)醫(yī)院藥劑科(西安 710003)，2. 陜西省食品藥品檢驗所藥理室(西安710000)，3. 西安市碑林區(qū)柏樹林社區(qū)衛(wèi)生服務中心(西安710000)，4. 西安市長安區(qū)醫(yī)院(西安710000)

目的：觀測心肌片對缺血再灌注心肌細胞凋亡的影響及可能機制。方法：H9c2細胞隨機分為對照組、模型組、心肌片低中高劑量組，預給藥24h后，建立心肌缺血/再灌注損傷( MI/RI) 模型。檢測細胞存活率，LDH釋放水平，蛋白印跡法檢測心肌細胞凋亡相關基因 Bax，Bcl-2，Caspase-3，Cyt-C蛋白的表達以及AMPK磷酸化水平。結(jié)果：與模型組比較，心肌片提高細胞存活率，減少LDH水平，穩(wěn)定線粒體膜電位，減少Bax，Caspase-3以及Cyt-C蛋白的表達，增加 Bcl-2 蛋白的表達，提高 Bcl-2/Bax 的比值(P<0.05)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，這些保護作用被AMPK抑制劑Compound C取消。結(jié)論：心肌片能減輕心肌缺血再灌注損傷，抑制心肌細胞凋亡，其機制可能通過激活AMPK信號通路實現(xiàn)的。

心肌缺血/再灌注損傷 (Myocardial ischemia/reperfusion injury，MI/RI)是目前幾種常用血管再通手術及預后所面臨的主要難題之一，其在急性心肌梗死再灌注治療的病理生理過程中起著重要的作用[1]，研究開發(fā)有效防治再灌注損傷的藥物已成為醫(yī)學研究的熱點之一。近年來研究發(fā)現(xiàn)細胞凋亡普遍存在于MI/RI過程中，并起主導地位[2]，因此在再灌注前或再灌注期間藥物干預細胞凋亡，能夠?qū)I/RI到達一定的保護作用。心肌片是陜西中醫(yī)醫(yī)院研制的中藥復方制劑，于2001年獲得了陜西省食品藥品監(jiān)督管理局的批準文號，由黨參、薤白、紅花、淫羊藿、丹參等中藥煎制而成，治療心肌缺血等疾病有很好的療效，但其作用機制不清，不利于更廣泛的應用于患者。本實驗研究將心肌片預給予心肌細胞，觀察其對體外實驗性MI/RI的作用，并初步探討其作用機制。

材料與方法

1 藥物與試劑 心肌片由陜西中醫(yī)醫(yī)院提供；肌鈣蛋白T(cTnT)，肌酸激酶同工酶(CK-MB)，乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒由南京建成生物科技有限公司生產(chǎn)提供；Bax，Bcl-2，Caspase-3 和β-actin抗體由Santa Cruz Biotechnology公司提供；AMPK抗體由Cell Signaling Technology (CST)提供；Western Blot相關試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司；辣根過氧化物酶標記的二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；ECL 化學發(fā)光試劑盒購自Roche，其他試劑由Sigma公司提供。

2 細胞培養(yǎng)及造模 H9c2大鼠心肌細胞株，購自美國 ATCC 公司(Manassas, VA, USA)，采用含 10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的高糖Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM)培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加1%雙抗(鏈霉素-青霉素)后置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。細胞融合度90%左右時進行傳代培養(yǎng)，每隔一天換新鮮培養(yǎng)基。在建立缺血再灌注模型時，正常培養(yǎng)液更換為PBS緩沖液，在缺氧培養(yǎng)小室充入95% N210min后，放入37℃的恒溫箱中進行缺氧4h，然后倒掉PBS緩沖液，重新加入正常培養(yǎng)基，放置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h進行復氧。

3 MTT檢測細胞存活率 收集H9c2細胞，制成細胞懸液，調(diào)整細胞懸液濃度至5×104，每孔加入l00ul，37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。加入不同濃度藥液，每孔l00ul，設5個復孔，37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸去上清，每孔加入150μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩l0min，待結(jié)晶物充分溶解后，在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。存活率=(A測量-A調(diào)零孔)/(A對照-A調(diào)零孔)。

4 樣本收集 缺血再灌注后，收集細胞培養(yǎng)上清液，離心后用于測定LDH和CK-MB含量；收集細胞，經(jīng)超聲破碎處理、離心收集上清用于測定Caspase 3, MDA和SOD水平，測定方法和步驟按照試劑盒說明書進行。

5 流式細胞術檢測心肌細胞線粒體膜電位 線粒體膜電位的檢測用熒光染料羅丹明 123，根據(jù)設計處理細胞后，按照試劑盒說明書操作，用流式細胞儀檢測，最后所得結(jié)果用 Cell quest 軟件處理。

6 采用 Western blotting 法檢測心肌細胞內(nèi)AMPK和ACC 的表達 具體步驟如下：裂解緩沖液裂解提取心肌細胞蛋白，BCA 法蛋白定量后，保存于-70℃?zhèn)溆?。向此蛋白樣品中加入等體積的2×電泳樣品緩沖液，加熱變性，按 30μg 每泳道上樣，經(jīng) 10% SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)至 PVDF 膜上。5%的脫脂奶粉封閉常溫下震蕩1h后，加Bcl-2，Bax，AMPK和ACC 單克隆抗體，加用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔 IgG，ECL 試劑盒顯影、定影。以β-actin 作內(nèi)參照物。目的條帶積分光密度值和上樣內(nèi)參積分光密度值用Quantity One software (Bio-Rad Laboratories, USA)測定后，進行比較得出相對光密度值。

7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0 統(tǒng)計學軟件,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差來表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用 LSD-t 檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 心肌片對缺血再灌注后 H9c2 細胞增殖的作用 利用MTT實驗檢測心肌片對H9c2細胞增殖活性的影響。心肌片在低濃度時，對心肌細胞沒有毒性作用，甚至可以促進細胞的增殖，在濃度達到120 mg/ml以上時，毒性增加，故選擇20,40和80 mg/ml為作用濃度進行以后實驗(圖1A)。與正常組比較，缺血再灌注使H9c2 細胞存活率顯著下降(P<0.01)，而心肌片可以保護H9c2 細胞，降低缺血再灌注的損傷程度，并呈濃度依賴關系(圖1B)。

注： A不同濃度心肌片對正常H9c2存活率的影響；B 心肌片對缺血再灌注心肌細胞的保護作用,##P<0.01 比 CON組，**P<0.01 比 I/R組

2 心肌片減輕缺血再灌注損傷 與正常對照組相比，缺血再灌注顯著升高培養(yǎng)基內(nèi)LDH水平，促進了LDH釋放，造成細胞損傷，而心肌片預處理組，LDH水平顯著低于缺血再灌注組，且呈劑量依賴關系(圖2A)。線粒體膜電位的變化可以反映細胞凋亡或者細胞損傷情況(圖2B)，缺血再灌注使線粒體膜電位顯著降低，與缺血再灌注組比較，心肌片預處理使線粒體膜電位顯著升高，表明其可以穩(wěn)定線粒體膜電位。

注:A 心肌片對細胞培養(yǎng)基上清中LDH水平的影響；B心肌片對細胞線粒體膜電位的影響,##P<0.01 比 sham組，**P<0.01 比模型組

圖2 心肌片減輕缺血再灌注損傷

3 心肌片減輕缺血再灌注引起的細胞凋亡 Caspase 家族的激活與細胞凋亡密切相關。為了測試缺血再灌注是否激活 Caspase-3，我們檢測了Cleaved-caspase 3表達情況。如圖3A所示，與正常組比較，缺血再灌注誘導的Cleaved-caspase 3顯著增加；心肌片預處理使Cleaved-caspase 3表達水平顯著降低，并呈劑量依賴關系。

細胞凋亡的線粒體途徑通過 Bcl-2 家族蛋白調(diào)控，具有顯著調(diào)節(jié)線粒體釋放 Cyt-C以及 Caspase-3等 Caspase 家族蛋白的作用。本實驗中，缺血再灌注使細胞內(nèi)Cyt-C水平顯著升高，而心肌片劑量依賴性的降低了其水平。進一步研究發(fā)現(xiàn)，心肌片可以調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax比例，穩(wěn)定缺血再灌注造成的Bcl-2/Bax表達失衡，從而減輕細胞凋亡(圖3B)。

注：A心肌片對缺血再灌注心肌細胞內(nèi)Cleaved-caspase 3和Cyt-C水平的影響；B心肌片對缺血再灌注心肌細胞

4 心肌片對AMPK信號通路調(diào)控作用 Western Blot 結(jié)果如圖4 A所示，與對照組比較，缺血再灌注組P-AMPK/AMPK水平顯著降低，而心肌片預處理使P-AMPK/AMPK水平呈劑量依賴性增加，說明心肌片可以激活AMPK信號通路。心肌片可以保護心肌細胞免受缺血再灌注引起的細胞存活率下降和線粒體凋亡途徑激活，而這些保護作用均被AMPK抑制劑Compound C抵消(圖4B和圖4C)。

注：A心肌片對缺血再灌注心肌細胞內(nèi)AMPK磷酸化水平的影響；用AMPK抑制劑Compound C(1μmol/L)抑制AMPK后觀察心肌片對細胞

缺血/再灌注損傷(Ischemia/reperfusion injury, I/RI) 是指細胞因缺血發(fā)生可逆性、可存活的損傷，在再灌注后這種損傷反而加重并引起細胞死亡或進一步的功能障礙，此概念由Hearse在1977年首次提出[3]。近年已有大量實驗和臨床研究發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡可能是心肌缺血再灌注損傷發(fā)病機制中的重要環(huán)節(jié)之一[4]。梗死灶周邊區(qū)域的心肌細胞凋亡擴大了梗死面積，促進心室重構(gòu)，對心肌功能產(chǎn)生不利影響。因此有效地抑制再灌注心肌細胞的凋亡不僅可以減緩心肌細胞壞死的發(fā)生，更可以挽救大量瀕死細胞，對于不可再生的心肌細胞具有重要臨床意義。

近年來研究發(fā)現(xiàn)中藥能夠有效地保護再灌注缺血心肌[5,6]，本研究所用心肌片是由陜西中醫(yī)醫(yī)院研制而成，用于心肌缺血，病毒性心肌炎等有很好的療效。其成分黨參、薤白、紅花、淫羊藿、丹參等已有大量研究報道具有心肌保護作用[7-9]，而心肌片的藥理學作用及其作用機制未見報道，影響其推廣應用。本實驗通過建立心肌細胞缺血再灌注模型，檢測心肌細胞存活率、LDH釋放量等損傷性指標，結(jié)果發(fā)現(xiàn)心肌片預處理可以提高細胞存活率，減少LDH釋放，表明心肌片具有保護心肌缺血再灌注損傷作用。

本研究結(jié)果進一步顯示，心肌片對缺血再灌注心肌細胞凋亡也有很好的抑制作用，且能穩(wěn)定缺血再灌注心肌線粒體膜電位。并發(fā)現(xiàn)心肌片對缺血再灌注心肌 Clevead-caspase-3 和細胞色素C活性升高有很好的抑制作用，而Clevead-caspase-3 和細胞色素C活性升高也是導致細胞凋亡的重要因素。另外還發(fā)現(xiàn)，心肌片能夠增加 Bcl-2 蛋白、減少 Bax蛋白表達，提高 Bcl-2 /Bax 比值，體現(xiàn)出心肌片對缺血再灌注心肌細胞凋亡的保護作用。

我們進一步闡述了心肌片保護心肌細胞缺血/再灌注損傷，抗細胞凋亡的具體機制。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是一種在細胞內(nèi)行使能量代謝調(diào)節(jié)的蛋白激酶，在全身能量平衡、血糖穩(wěn)定、調(diào)節(jié)脂代謝方面起關鍵的調(diào)節(jié)作用，此外，研究發(fā)現(xiàn)AMPK抑制細胞凋亡，促進缺血后心功能恢復，減少心肌梗死面積發(fā)揮保護缺血/再灌注心臟的作用[10]。在本研究中，心肌片可以劑量依賴性的激活AMPK，并且采用AMPK特異性抑制劑Compound C抑制AMPK活性后，心肌片的心肌保護作用消失，說明心肌片通過AMPK信號通路發(fā)揮心肌細胞保護作用。

綜上所述，心肌片能減輕心肌缺血再灌注損傷，抑制心肌細胞凋亡，具有心肌保護作用，尤其是心肌片高劑量組作用明顯，其機制可能通過激活AMPK信號通路，從而上調(diào)Bcl-2，下調(diào) Bax，Cyt-C及 Caspase-3 蛋白表達，升高 Bcl-2 /Bax 比值有關。

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(收稿：2016-08-16)

心肌缺血/中醫(yī)藥療法 @心肌片 動物，實驗 大鼠

R542.2

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10.3969/j.issn.1000-7369.2017.01.062