賈敬亮，陳有旺，張鵬程

(1．衡水市畜牧技術(shù)推廣站，河北 衡水 053000;2．廊坊職業(yè)技術(shù)學(xué)院動物科學(xué)與技術(shù)系，河北 廊坊 065000)

黃芩苷對原代大鼠肝細(xì)胞CYP3A1的影響

賈敬亮1，陳有旺2，張鵬程1

(1．衡水市畜牧技術(shù)推廣站，河北 衡水 053000;2．廊坊職業(yè)技術(shù)學(xué)院動物科學(xué)與技術(shù)系，河北 廊坊 065000)

膠原酶二步灌流法獲取原代大鼠肝細(xì)胞，用不同濃度的黃芩苷處理1～3 d，Western Blot法檢測細(xì)胞色素P450 3A1(CYP3A1)的表達。結(jié)果表明，通過膠原酶灌流法，每只大鼠可獲得2－4×108個肝細(xì)胞，存活率約為95%。低濃度(＜10μmol/L)的黃芩苷處理后，肝細(xì)胞CYP3A1的表達隨黃芩苷濃度的增加和處理時間的延長而呈升高的趨勢。高濃度(＞10μmol/L)黃芩苷對細(xì)胞產(chǎn)生毒性，原代大鼠肝細(xì)胞可用于黃芩苷藥物代謝的研究，為探討其他藥物的代謝打下了基礎(chǔ)。

黃芩苷;大鼠;原代肝細(xì)胞;CYP3A1

黃芩苷是傳統(tǒng)中藥黃芩的主要藥效成分，具有抗菌、抗氧化、清除自由基、抗炎、抗過敏、保護心血管、抗腫瘤、對腦損傷的修復(fù)保護、對糖尿病腎病的改善等藥理作用［1－2］，并對多種因素引起的肝臟損傷具用明顯的保護作用［3－5］。細(xì)胞色素P450 3A家族(CYP3A)是動物體內(nèi)重要的Ⅰ相代謝酶，占肝臟中細(xì)胞色素P450酶(CYP)總量的25%～28%，約有60%的臨床藥物經(jīng)肝臟CYP3A代謝［6］，在內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的代謝中起著極其重要的作用。CYP3A1是大鼠CYP3A亞族最主要的亞型，它的活性高低直接影響許多藥物的治療效果和毒性反應(yīng)。目前，黃芩苷對肝細(xì)胞CYP3A1有無誘導(dǎo)作用尚不清楚。

體外培養(yǎng)的原代大鼠肝細(xì)胞具有較好的體外試驗重現(xiàn)性，基本維持了肝臟的代謝功能，并能很好地保留與體內(nèi)一致的CYP水平。本試驗采用膠原酶兩步灌流法分離大鼠肝細(xì)胞，并用黃芩苷作用肝細(xì)胞，通過測定其CYP3A1的表達，在細(xì)胞及分子水平上探討了黃芩苷藥物代謝的機理，為黃芩苷的臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 成年SD雄性大鼠(清潔級)，體重(100～150)g，購自河北省實驗動物中心。

1.2 主要試劑 黃芩苷，購自中國藥品生物制品檢定所，William's E培養(yǎng)基(WME)、Hank's液、膠原酶Ⅰ、PCN(Pregnenolone-16α-Carbonitrile)，購自Sigma公司;胎牛血清，購自北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所;Bradford蛋白定量試劑盒、預(yù)染蛋白 MarkerⅢ，購自北京天根生化科技有限公司;兔抗大鼠CYP3A1抗體，購自Chemicon公司;堿磷酶標(biāo)記山羊抗兔IgG，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司; NBT、BCIP，購自Amresco公司。

1.3 肝細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 膠原酶二步灌流法分離原代大鼠肝細(xì)胞，大鼠用速眠新麻醉后，打開腹腔，門靜脈插管，先灌入含0.5 mmol/L EGTA的無鈣Hank's液，漂洗大鼠肝臟2 min，再用0.04%膠原酶Ⅰ消化5 min，最后用Hank's液漂洗2 min后取出肝臟，分離肝細(xì)胞，肝細(xì)胞用WME培養(yǎng)基洗滌3次，1 000 r/min離心5 min，獲得純化的肝細(xì)胞懸液。將所得肝細(xì)胞懸液用0.4%的臺盼藍(lán)染色，檢測細(xì)胞活力并計數(shù)，用貼壁培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至3× 105cells/mL。接種于大鼠尾膠原處理的12孔板中，3×105/孔，37℃、5%CO2條件下，在WME中培養(yǎng)。24 h換液1次，并觀察肝細(xì)胞形態(tài)。

1.4 黃芩苷處理肝細(xì)胞 0.01～100μmol/L黃芩苷處理肝細(xì)胞1～3 d，10μmol/L PCN為陽性對照，蛋白裂解液收集蛋白，Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒檢測蛋白濃度。

1.5 Western Blot法檢測CYP3A1的表達 蛋白變性，12%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶封閉，加TBST 1∶4 000稀釋的CYP3A1一抗，TBST洗膜，加TBST 1∶2 000稀釋的堿磷酶標(biāo)記IgG二抗，TBST洗膜，NBT/BCIP顯色，用ImageJ軟件計算所得條帶的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 肝細(xì)胞的獲取 每只大鼠可獲得2～4×108個肝細(xì)胞，存活率在95%左右。

2.2 肝細(xì)胞的形態(tài) 倒置顯微鏡下觀察，新鮮分離的肝細(xì)胞呈圓球狀，單個散在;4 h后，大部分細(xì)胞貼壁生長并展開，連接成索狀;24 h后，貼壁的肝細(xì)胞呈典型上皮細(xì)胞樣的多角形形態(tài)，體積增大，細(xì)胞間開始出現(xiàn)島嶼狀連接(見中插彩版圖1);48 h后，肝細(xì)胞連接為成片島嶼狀;72 h后，肝細(xì)胞形態(tài)特征更加典型，單層生長呈板狀、條索狀(見中插彩版圖2)。

2.3 黃芩苷對CYP3A1表達的影響 黃芩苷作用24 h、48 h、72 h均對CYP3A1具有誘導(dǎo)作用。在作用24 h內(nèi)，濃度低于0.5μmol/L的黃芩苷對肝細(xì)胞CYP3A1誘導(dǎo)作用不明顯，濃度增大到1μmol/L后，CYP3A1的表達隨藥物濃度的增加呈上升趨勢。作用48 h、72 h時，在黃芩苷濃度低于10μmol/L時，隨藥物濃度的增加和作用時間的延長，誘導(dǎo)作用增強，但濃度高于10μmol/L后，CYP3A1的表達明顯減弱(見中插彩版圖3)。

3 討論

3.1 原代大鼠肝細(xì)胞的分離培養(yǎng) 原代肝細(xì)胞的分離方法有機械法、螯合法和酶消化法等。早期的機械法對細(xì)胞損傷嚴(yán)重，獲取的肝細(xì)胞數(shù)量少，且功能活性低。螯合法是用能夠結(jié)合Ca2+、Mg2+的螯合劑來分離肝細(xì)胞，但分離細(xì)胞效果差。目前應(yīng)用最廣泛的是膠原酶二步灌流法，因其在膠原酶消化細(xì)胞前使用了鰲合劑，對肝細(xì)胞損傷小，且分離徹底，是較好的肝細(xì)胞分離方法［7］。

本試驗應(yīng)用膠原酶二步灌流法成功地獲得了活力強、形態(tài)完整的原代大鼠肝細(xì)胞。在分離過程中最關(guān)鍵的是膠原酶的用量和消化時間，膠原酶的濃度過高則作用時間難以控制，濃度過低則作用時間過長，細(xì)胞存活率低。在細(xì)胞培養(yǎng)中，選用合適的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基也非常重要。研究表明，正常肝細(xì)胞表面存在某些生長因子受體和激素受體，在培養(yǎng)液中加入合適的外源性生長因子和激素，共同發(fā)揮生物效應(yīng)，對促進體外培養(yǎng)肝細(xì)胞的生長、分化、增殖及生物學(xué)功能的維持具有重要作用，不同類型的培養(yǎng)基對肝細(xì)胞的培養(yǎng)也有明顯的影響［8］。本文先用含有 10%胎牛血清及 10 mg/L ITS、100 nmol/L地塞米松的WME培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待肝細(xì)胞貼壁后，換用不加血清的WME培養(yǎng)基培養(yǎng)，結(jié)果表明，肝細(xì)胞生長良好，并可長期培養(yǎng)用于試驗研究。

3.2 黃芩苷對肝細(xì)胞CYP3A1的影響 CYP是體內(nèi)重要的藥物代謝酶，臨床和藥理研究表明，中草藥可對它產(chǎn)生誘導(dǎo)或抑制作用，從而引起自身和其他藥物的藥代動力學(xué)的變化，中藥的濃度、用藥時間、給藥方式等多種藥物因素均會影響其對CYP的作用［9］。黃芩苷是中藥黃芩的主要藥效成分，具有廣泛的藥理作用，且對肝臟損傷具有明顯的保護作用，侯艷寧等［10］，報道黃芩苷可誘導(dǎo) CYP1A1、CYP2B1及CYP2C11等3種同功酶，另有研究表明，黃芩苷對大鼠肝微粒體CYP450酶7種亞型均無抑制作用，而對人肝微粒體 CYP1A2，CYP2C19和CYP2E1有較弱的抑制作用［11］。為確定黃芩苷對肝細(xì)胞CYP3A1的影響，本研究利用不同濃度的黃芩苷作用原代培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞，并利用Western Blot法檢測了CYP3A1的表達。研究結(jié)果證實，黃芩苷對肝細(xì)胞CYP3A1確有誘導(dǎo)作用，且與藥物濃度和作用時間均有關(guān)。在短時間內(nèi)低濃度黃芩苷不能夠誘導(dǎo)CYP3A1的表達，但隨著作用時間的延長和藥物濃度的增加，對CYP3A1的誘導(dǎo)作用會逐漸增強，而高濃度(＞10μmol/L)的黃芩苷隨作用時間延長，會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性，致使部分細(xì)胞死亡，10μmol/L的黃芩苷是作用大鼠肝細(xì)胞72 h內(nèi)的最佳用藥濃度。

［1］ 丁嬋，褚秀玲，蘇建青，等．黃芩苷抗病毒作用研究進展［J］．中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2016，35(2):27-29．

［2］ 黃志軍．黃芩苷藥理作用研究進展［J］．天津藥學(xué)，2012，24 (3):61-64．

［3］ 章寶燕，林擁華，林志強．黃芩及其有效成分的肝臟保護作用研究進展［J］．中國中醫(yī)藥信息雜志，2014，21(12):129-133．

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［6］ Krippendorff B F，Lienau P，Reichel A，et al．Optimizing classification of drug-drug interaction potential for CYP450 isoenzyme inhibition assays in early drug discovery［J］．Journal of Biomolecular Screening，2007，12(1):92-99．

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［8］ Hamilton G A，Westmoreland C，George A E．Effects of medium composition on the morphology and function ofrathepatocytes cultured as spheroids and monolayers［J］．In Vitro Cellular Developmental Biology(Animal)，2001，37(10):656-667．

［9］ 王丹，張振清，阮金秀．中藥對細(xì)胞色素P450誘導(dǎo)或抑制作用的影響因素［J］．解放軍藥學(xué)學(xué)報，2008，24(3):242-244．

［10］ 侯艷寧，朱秀媛，程桂芳．黃芩甙對小鼠肝細(xì)胞色素P450及其亞家族的誘導(dǎo)［J］．解放軍藥學(xué)學(xué)報，2000，16(2):68-71．

［11］ 黃凱，劉志浩，賀晴．黃芩苷對大鼠和人肝微粒體CYP450酶的抑制作用［J］．中國實驗方劑學(xué)雜志，2016，22(3):20-23．

Effects of Baicalin on Cytochrome P450 3A1 in Rat Primary Cultured Hepatocytes

JIA Jing-liang1，CHEN You-wang2，ZHANG Peng-cheng1

(1．Hengshui Animal husbandry technology promotion station，Hengshui053000，China; 2．Animal Science and Technology Department，Langfang Polytechnic Institute，Langfang 065001，China)

Rat primary cultured hepatocytes were isolated by two-step collagenase digestion method and treated with gradient concentration of baicalin for 1－3 d，and the expression of cytochrome P450 3A1 was determined by Western Blot．The results showed that 2－4×108cells per rat were obtained and the viability was about95%．The expression of CYP3A1 in rat hepatocytes increased gradually with the treatment of low concentration baicalin(＜10 mol/L)，and high concentration(＞10 mol/L)baicalin injured hepatocytes．Rat primary cultured hepatocytes can be used for investigation of baicalin metabolism，and it also makes a foundation to explore other drugs metabolism．

baicalin;rat;primary cultured hepatocyte;CYP3A1

S853．7

A

0529-6005(2017)06-0037-02

2016-07-07

賈敬亮(1981-)，男，獸醫(yī)師，碩士，從事畜牧獸醫(yī)工作，E-mail:jiajingliang1981@163．com