陳 玲,董 坤,楊智仙,董 艷**,湯 利,鄭 毅,4

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院 昆明 650201;2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 昆明 650201;3.云南大學(xué) 昆明 650091;4.西南林業(yè)大學(xué) 昆明 650224)

苯甲酸脅迫下間作對(duì)蠶豆自毒效應(yīng)的緩解機(jī)制*

陳 玲1,董 坤2,楊智仙3,董 艷1**,湯 利1,鄭 毅1,4

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院 昆明 650201;2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 昆明 650201;3.云南大學(xué) 昆明 650091;4.西南林業(yè)大學(xué) 昆明 650224)

苯甲酸是引起蠶豆連作障礙的主要自毒物質(zhì)之一。本文采用水培試驗(yàn),研究了不同濃度苯甲酸[C0(0mg·L-1)、C1(50mg·L-1)、C2(100mg·L-1)和C3(200mg·L-1)]處理對(duì)與小麥間作的蠶豆幼苗生長(zhǎng)和枯萎病發(fā)生的影響,從生理抗性角度探討小麥與蠶豆間作對(duì)緩解苯甲酸自毒效應(yīng)的機(jī)制,為合理利用間作緩解連作障礙,實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。結(jié)果表明:與C0處理相比,不同濃度苯甲酸處理均顯著抑制了蠶豆幼苗的生長(zhǎng),并且隨處理濃度升高,抑制效應(yīng)增強(qiáng);同時(shí)顯著提高了蠶豆枯萎病發(fā)病率和病情指數(shù);蠶豆根系和葉片的 MDA含量顯著提高，但抗氧化酶(POD和CAT)活性和病程相關(guān)蛋白(β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶)活性均隨苯甲酸處理濃度升高而降低。表明不同濃度苯甲酸處理均顯著抑制了蠶豆的生長(zhǎng),降低蠶豆的生理抗性而促進(jìn)枯萎病發(fā)生。與單作蠶豆相比,蠶豆與小麥間作顯著提高了苯甲酸脅迫下蠶豆的地上部干重(17.0%～47.1%),降低了發(fā)病率(11.1%～25.0%)和病情指數(shù)(20.0%～42.1%);蠶豆根系和葉片中 POD活性分別提高12.9%～16.9%和9.3%～24.9%,CAT活性分別提高10.3%～54.0%和6.6%～20.5%,蠶豆根系的β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性分別提高4.7%～13.1%和6.7%～15.8%,MDA含量分別降低19.5%～25.4%和20.5%～29.9%。C2處理下間作提高抗氧化酶和病程相關(guān)蛋白活性的效果最好,抗病效果最佳。表明小麥與蠶豆間作通過(guò)提高蠶豆的生理抗性而減輕苯甲酸引起的枯萎病危害,促進(jìn)蠶豆生長(zhǎng),是緩解苯甲酸自毒效應(yīng)的有效措施。

苯甲酸;蠶豆;連作障礙;間作;抗氧化酶;病程相關(guān)蛋白;枯萎病

受土地資源短缺、種植習(xí)慣、環(huán)境條件和經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動(dòng)等條件制約,我國(guó)在同一塊土地上連續(xù)種植同科或同一種作物的現(xiàn)象非常普遍[1]。長(zhǎng)期單一作物連作,會(huì)出現(xiàn)植株生長(zhǎng)和發(fā)育受阻,土傳病害嚴(yán)重發(fā)生,從而導(dǎo)致大幅減產(chǎn)的連作障礙問(wèn)題[1]。多年來(lái),大量研究表明土壤養(yǎng)分缺乏、土壤酶活性降低、根際微生物區(qū)系惡化和土傳病害高發(fā)等均會(huì)導(dǎo)致連作障礙發(fā)生。近年來(lái)的研究表明,連作土壤中酚酸類物質(zhì)的累積是導(dǎo)致多種作物連作障礙發(fā)生的重要原因[2-3]。目前研究者已從多種作物根系分泌物和連作土壤中檢測(cè)出肉桂酸、對(duì)羥基苯甲酸、苯甲酸、香草酸、丁香酸、香豆酸和阿魏酸等多種酚酸物質(zhì)[3-4],并證明了這些酚酸是導(dǎo)致韭菜(Cunninghamia lanceolata)、黃瓜(Cucumis sativus)、茄子(Solanum melongena)、番茄(Solanum lycopersicum)等作物發(fā)生連作障礙的自毒物質(zhì),其中苯甲酸是西瓜(Citrullus lanatus)、芋頭(Colocasia esculenta)和人參(Panax ginseng)等作物連作土壤和根系分泌物中主要的酚酸物質(zhì)[1,5],在連作西瓜和人參中已證明苯甲酸能顯著促進(jìn)黃瓜枯萎病和人參銹病的發(fā)生[6-7]。我們前期在田間試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),連作條件下蠶豆(Vicia faba)出苗差,生長(zhǎng)瘦弱,枯萎病發(fā)病較嚴(yán)重;進(jìn)一步通過(guò)高效液相色譜在蠶豆連作土壤中檢測(cè)到7種酚酸(對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、阿魏酸、水楊酸、肉桂酸、苯甲酸),且苯甲酸具有較高的含量[8],但苯甲酸是否是引起蠶豆連作障礙的自毒物質(zhì)尚不清楚。

利用植物化感作用而采用的間作模式,是以植物為藥源取代化學(xué)殺菌劑,去弊存利的植物保護(hù)措施,是解除連作障礙的有效手段[5]。云南具有豐富的生物資源優(yōu)勢(shì),小麥(Triticum aestivum)與蠶豆間作一直是云南及西南地區(qū)普遍的種植模式,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位,具有大面積的種植,增產(chǎn)、增收、抗病效果顯著[9]。蠶豆連作致使土傳枯萎病嚴(yán)重發(fā)生,產(chǎn)量嚴(yán)重下降,是制約我國(guó)蠶豆生產(chǎn)的重要病害,尤其在云南蠶豆生產(chǎn)上發(fā)生危害較重。我們的前期研究表明小麥與蠶豆間作增加了蠶豆根際微生物的數(shù)量和多樣性而抑制了枯萎病的發(fā)生[10-11]。但截至目前為止,有關(guān)自毒物質(zhì)脅迫下,小麥與蠶豆間作對(duì)連作蠶豆自毒作用的緩解效果及機(jī)理尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)在外源添加苯甲酸并接種尖孢鐮刀菌的條件下,研究苯甲酸對(duì)單作蠶豆生長(zhǎng)、枯萎病發(fā)生及蠶豆抗氧化酶和病程相關(guān)蛋白的影響,明確苯甲酸在蠶豆連作障礙形成中的作用;通過(guò)比較單作和間作蠶豆生長(zhǎng)和枯萎病發(fā)生,根系及葉片病程相關(guān)蛋白和抗氧化酶活性的差異,明確間作對(duì)苯甲酸自毒效應(yīng)的緩解效果及間作減輕苯甲酸自毒效應(yīng)的生理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)于2015年10月至12月在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院溫室大棚內(nèi)進(jìn)行。

供試小麥品種為‘云麥53’,蠶豆品種為‘89-147’,購(gòu)于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院。供試苯甲酸(分析純)購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)上海有限公司。供試病原菌為尖孢鐮刀菌蠶豆?；蚚Fusarium oxysporumf.fabae,(FOF)],由本試驗(yàn)室從蠶豆連作土壤中篩選并保存。在PDA平板上培養(yǎng),于28℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)7 d后刮取菌絲于無(wú)菌水中振蕩均勻,經(jīng)兩層紗布過(guò)濾后配成孢子懸液用于接種。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)為雙因素試驗(yàn)設(shè)計(jì),A因素為苯甲酸處理,共設(shè)4個(gè)濃度,C0(0mg·L-1,為對(duì)照),C1(50mg·L-1),C2(100mg·L-1),C3(200mg·L-1)。B因素為種植模式,設(shè)蠶豆單作(MF)和小麥與蠶豆間作(IF),組合為8個(gè)處理,每個(gè)處理3次重復(fù),共計(jì)24盆。單作每盆種植3株蠶豆,間作每盆種植3株蠶豆和9株小麥(如圖1),24 h通氣泵通氣。

圖1 蠶豆單作和小麥與蠶豆間作種植示意圖Fig.1 Schematic diagrams of faba bean monocropping and intercropping with wheat

1.3 試驗(yàn)實(shí)施

小麥和蠶豆種子于室溫下浸種24 h,25℃下催芽后同時(shí)播于Hoagland營(yíng)養(yǎng)液浸透的無(wú)菌石英砂中培養(yǎng),待蠶豆幼苗長(zhǎng)至 4～6片真葉時(shí),選取長(zhǎng)勢(shì)一致的蠶豆幼苗移入盛有不同濃度苯甲酸的2 L容器中,間作處理同時(shí)移栽小麥(3葉期)。苯甲酸處理2 d后,向營(yíng)養(yǎng)液中添加1×106cfu·mL-1的尖孢鐮刀菌孢子懸液。

1.4 蠶豆枯萎病調(diào)查

蠶豆移栽 45 d時(shí)進(jìn)行枯萎病調(diào)查,單間作處理每個(gè)重復(fù)均調(diào)查蠶豆3株。蠶豆枯萎病調(diào)查按 5級(jí)分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[11],調(diào)查結(jié)束后計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果。

1.5 蠶豆生長(zhǎng)、生理指標(biāo)測(cè)定方法

1.5.1 生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定

蠶豆移栽 45 d時(shí)(蠶豆分枝期)采樣,每個(gè)重復(fù)采3株蠶豆,測(cè)量單株葉片數(shù)、最大葉長(zhǎng)、最大葉寬、株高、主根長(zhǎng)、植株地上部干重和根系干重,計(jì)算根冠比。

1.5.2 抗氧化酶活性和膜質(zhì)過(guò)氧化測(cè)定

于蠶豆移栽45 d (蠶豆分枝期)時(shí)采樣,每個(gè)重復(fù)采樣3株,用葉片和根系鮮樣測(cè)定過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量,測(cè)定采用李合生[12]的方法。

1.5.3 病程相關(guān)蛋白測(cè)定

蠶豆移栽 45 d時(shí)(蠶豆分枝期)采樣,每個(gè)重復(fù)采樣3株,用蠶豆根系鮮樣測(cè)定病程相關(guān)蛋白。幾丁質(zhì)酶測(cè)定采用幾丁質(zhì)酶試劑盒(購(gòu)于南京建成生物工程研究所),1個(gè)單位幾丁質(zhì)酶活性定義為每g組織每小時(shí)分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的量。β-1,3-葡聚糖酶活性測(cè)定采用 β-1,3-葡聚糖酶試劑盒(購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司),1個(gè)單位β-1,3-葡聚糖酶活性定義為每g組織每小時(shí)產(chǎn)生1mg還原糖的量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,采用SPSS 20.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,最小顯著差異法(LSD) 檢驗(yàn)各處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯甲酸脅迫下間作對(duì)蠶豆幼苗生長(zhǎng)的影響

苯甲酸處理對(duì)蠶豆幼苗生長(zhǎng)的影響見(jiàn)表1。從表1可看出,蠶豆單作條件下,隨苯甲酸處理濃度升高,蠶豆幼苗生長(zhǎng)參數(shù)(葉片數(shù)、最大葉長(zhǎng)、最大葉寬、株高、主根長(zhǎng)、地上部干重、根干重和根冠比)均顯著降低。與C0相比,C1、C2和C3濃度處理顯著降低蠶豆葉片數(shù)32.3%、35.4%和41.5%;顯著降低最大葉長(zhǎng)15.6%、32.4%和44.5%;顯著降低最大葉寬25.0%、31.7%和50.3%;顯著降低株高18.0%、34.2%和 46.2%;顯著降低地上部干重31.8%、61.0%和76.2%;顯著降低根干重33.3%、64.8%和83.3%。與C0相比,C2和C3濃度處理顯著降低主根長(zhǎng)8.18%和28.4%。表明苯甲酸處理顯著抑制了蠶豆的生長(zhǎng)。

苯甲酸各濃度處理下,小麥與蠶豆間作均促進(jìn)了蠶豆幼苗的生長(zhǎng)。不添加苯甲酸(C0)情況下,間作顯著增加了蠶豆葉片數(shù)、最大葉長(zhǎng)、主根長(zhǎng)、地上部干重和根干重10.8%、12.2%、8.2%、47.1%和59.3%;苯甲酸C1濃度處理下,間作顯著增加蠶豆葉片數(shù)、地上部干重和根干重10.6%、40.8%和55.6%;C2濃度處理下,間作顯著增加蠶豆最大葉長(zhǎng)、最大葉寬、地上部干重和根干重6.1%、7.0%、31.0%和68.4%;C3處理濃度下,間作顯著增加蠶豆最大葉長(zhǎng)、地上部干重和根干重3.6%、17.0%和77.8%。表明小麥與蠶豆間作促進(jìn)了蠶豆幼苗的生長(zhǎng),緩解了苯甲酸對(duì)蠶豆生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)(表1)。

表1 苯甲酸脅迫下與小麥間作對(duì)蠶豆幼苗生長(zhǎng)的影響Table1 Effect of intercropping with wheat on faba bean growth parameters under benzoic acid stress

2.2 苯甲酸脅迫下間作對(duì)蠶豆枯萎病發(fā)生的影響

從表2可看出,蠶豆單作條件下,與C0處理相比,苯甲酸C1、C2和C3處理顯著提高枯萎病發(fā)病率33.3%、50.0%和 50.0%,提高病情指數(shù) 25.0%、137.5%和362.4%。

苯甲酸 C1和 C2濃度處理下,與單作蠶豆相比,間作使蠶豆枯萎病發(fā)病率顯著降低 25.0%和11.1%;C0和 C3濃度處理下間作對(duì)蠶豆枯萎病發(fā)病率無(wú)顯著影響。C0、C1、C2和C3濃度處理下,間作降低病情指數(shù) 25.0%、20.0%、42.1%和21.6%,以C2濃度處理下間作降低病情指數(shù)的效果最好。苯甲酸不同濃度處理下,小麥與蠶豆間作對(duì)蠶豆枯萎病的防效為20.0%～42.1%,其中以C2處理?xiàng)l件下間作防效最高,達(dá)42.1%。

表2 苯甲酸脅迫下間作對(duì)蠶豆枯萎病發(fā)病率和病情指數(shù)的影響Table 2 Effect of intercropping with wheat on occurrence and index of faba beanFusariumwilt under benzoic acid stress

2.3 苯甲酸脅迫下間作對(duì)蠶豆POD和CAT活性的影響

苯甲酸處理對(duì)蠶豆根系和葉片中POD活性的影響見(jiàn)圖2。隨苯甲酸處理濃度升高,單作蠶豆根系和葉片中POD活性均呈先提高后降低的趨勢(shì)。蠶豆單作條件下,與 C0相比,C1處理下蠶豆根系和葉片中POD酶活性高于 C0處理,但差異不顯著;C2和 C3濃度處理下間作顯著降低蠶豆根系中 POD活性15.7%和31.4%;顯著降低蠶豆葉片中 POD活性21.3%和38.7%。表明,隨苯甲酸處理濃度升高,蠶豆POD活性降低幅度增大。

苯甲酸C0、C1、C2和C3濃度處理下,間作顯著提高蠶豆根系的POD活性12.9%、15.1%、16.9%和14.6%。苯甲酸各處理濃度下,間作均提高了蠶豆葉片中 POD的活性,其中 C2濃度下間作顯著提高POD活性24.9%(圖2)。表明苯甲酸C2濃度處理下間作提高蠶豆POD酶活性的增幅最大。

圖2 苯甲酸脅迫下與小麥間作對(duì)蠶豆根系和葉片中POD和CAT活性的影響Fig.2 Effect of intercropping with wheat on POD and CAT activities in roots and leaves of faba bean under benzoic acid stress

苯甲酸處理對(duì)蠶豆CAT活性的影響見(jiàn)圖2。蠶豆單作條件下,與C0相比,C1濃度處理下蠶豆根系和葉片中CAT活性低于C0處理,但無(wú)顯著差異;C2和C3濃度處理顯著降低蠶豆根系 CAT活性37.7%和42.8%;顯著降低蠶豆葉片CAT活性28.4%和44.8%。

苯甲酸各濃度處理下,間作均提高了蠶豆根系和葉片中CAT活性。C0、C1、C2和C3濃度處理下,間作提高蠶豆根系CAT活性10.3%、22.6%、54.0%和21.7%,提高蠶豆葉片CAT活性6.6%、9.2%、11.5%和20.5%(圖2)。

2.4 苯甲酸脅迫下間作對(duì)蠶豆MDA含量的影響

苯甲酸和間作對(duì)蠶豆MDA含量的影響見(jiàn)圖3。蠶豆單作條件下,與 C0相比,C1處理?xiàng)l件下蠶豆根系和葉片中MDA含量均低于C0處理,但差異不顯著;C2和C3濃度處理顯著提高蠶豆根系MDA含量28.9%和42.6%;顯著提高蠶豆葉片MDA含量16.4%和45.0%。

苯甲酸各濃度處理下,間作均顯著降低了蠶豆根系和葉片中MDA含量,C0、C1、C2和C3濃度處理下,間作顯著降低蠶豆根系的MDA含量25.4%、22.6%、20.0%和19.5%,顯著降低了蠶豆葉片MDA含量20.5%、29.9%、24.5%和26.5%。

圖3 苯甲酸脅迫下與小麥間作對(duì)蠶豆根系和葉片中MDA含量的影響Fig.3 Effect of intercropping with wheat on MDA content in roots and leaves of faba bean under benzoic acid stress

2.5 苯甲酸脅迫下間作對(duì)蠶豆幼苗根系病程相關(guān)蛋白的影響

苯甲酸處理對(duì)蠶豆 β-1,3葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性的影響見(jiàn)圖 4。蠶豆單作條件下,與 C0處理相比,C1處理?xiàng)l件下蠶豆根系中β-1,3葡聚糖酶活性高于C0處理,但差異不顯著;C2和C3濃度處理顯著降低根系β-1,3葡聚糖酶活性17.4%和38.7%。

苯甲酸C0、C1、C2和C3濃度處理下,間作提高蠶豆根系β-1,3葡聚糖酶活性4.7%、7.9%、13.1%和10.3%,其中以C2濃度處理下間作提高β-1,3葡聚糖酶活性的效果最好(圖4)。

圖4 苯甲酸脅迫下與小麥間作對(duì)蠶豆根系β-1,3葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性的影響Fig.4 Effect of intercropping with wheat on β-1,3-glacanase and chitinase activities in roots of faba bean under benzoic acid stress

蠶豆單作條件下,與C0處理相比,C1處理?xiàng)l件下蠶豆根系中幾丁質(zhì)酶活性高于C0處理,但差異不顯著;C2和C3濃度處理降低幾丁質(zhì)酶活性23.6%和39.4%(P<0.05),表現(xiàn)為隨苯甲酸處理濃度增高,幾丁質(zhì)酶活性顯著降低。苯甲酸各濃度處理下,間作提高了蠶豆根系中幾丁質(zhì)酶活性6.7%、7.8%、15.8%和10.5%,以C2濃度下間作提高幾丁質(zhì)酶活性的增幅最大。

3 討論與結(jié)論

3.1 苯甲酸脅迫下間作對(duì)蠶豆生長(zhǎng)和枯萎病發(fā)生的影響

化感自毒現(xiàn)象在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛存在,許多作物的連作障礙與此相關(guān),在世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,由于化感自毒效應(yīng)所造成的損失每年達(dá)數(shù)十億美元。黃瓜(Cucumis sativus)、西瓜(Citrullus lanatus)和茄子(Solanum melongena)連作障礙的自毒作用主要是由根系分泌物中的酚酸物質(zhì)引起的,主要包括芥子酸、丁香酸、香草酸(醛)、香豆酸、五倍子酸、對(duì)羥基苯甲酸、鄰苯二甲酸、咖啡酸、阿魏酸、苯甲酸、水楊酸和肉桂酸等[13]。自毒物質(zhì)肉桂酸和香草醛對(duì)茄子根系生長(zhǎng)(根干重、根鮮鮮重、根系活力)表現(xiàn)為“低促高抑”的作用特點(diǎn)[14]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,蠶豆單作條件下,苯甲酸處理抑制了蠶豆幼苗的生長(zhǎng),其中以生物量(地上部干重和根干重)的降低最為明顯,隨苯甲酸處理濃度的提高,對(duì)蠶豆生長(zhǎng)的抑制程度更加嚴(yán)重。黃瓜連作障礙研究中也發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象,即自毒物質(zhì)肉桂酸處理后再接種鐮刀菌能顯著抑制黃瓜的生長(zhǎng),原因是肉桂酸作用于黃瓜根系就表現(xiàn)出明顯的化感抑制效應(yīng),同時(shí)鐮刀菌還通過(guò)破壞維管束系統(tǒng)進(jìn)而影響黃瓜生長(zhǎng)[15]。

對(duì)羥基苯甲酸脅迫下接種尖孢鐮刀菌明顯加重草莓(Fragaria ananassa)根系組織受損程度,促進(jìn)草莓枯萎病發(fā)生[16]。肉桂酸是黃瓜根系分泌物中重要的化感物質(zhì),能誘導(dǎo)黃瓜鐮刀菌枯萎病的發(fā)生[17];苯甲酸和肉桂酸處理可顯著提高西瓜幼苗枯萎病的發(fā)病率[18]。本研究中苯甲酸處理顯著提高單作蠶豆枯萎病發(fā)病率和病情指數(shù),表明苯甲酸加劇了蠶豆枯萎病的發(fā)生,發(fā)病程度隨苯甲酸處理濃度的提高而加重。本研究結(jié)果與甜瓜根系分泌物中的肉桂酸、阿魏酸和苯甲酸顯著提高甜瓜(Cucumis melo)枯萎病病情指數(shù)的結(jié)論相同[13]。

間作作為我國(guó)傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)的精髓,具有增產(chǎn)、提高養(yǎng)分資源利用效率的優(yōu)勢(shì)[19-20],采用間作減輕土傳病害危害,緩解作物連作障礙已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[21]。旱作水稻(Oryza sativa)和西瓜間作顯著提高了西瓜鮮重和株高,促進(jìn)了西瓜生長(zhǎng)[22]。本研究中,苯甲酸不同濃度處理下,小麥與蠶豆間作促進(jìn)了蠶豆葉片的生長(zhǎng),提高了蠶豆地上部干重。中藥材茅蒼術(shù)(Artractylodes lancea)與花生間作顯著降低了花生連作土傳病害的發(fā)生,緩解了花生連作障礙[23];旱作水稻與西瓜間作降低了西瓜枯萎病的病情指數(shù)[5]。本研究結(jié)果表明,苯甲酸各濃度處理下,間作對(duì)蠶豆枯萎病的相對(duì)防效為 20.0%～42.1%,以C2處理下防效最好。表明小麥與蠶豆間作能有效減輕苯甲酸對(duì)蠶豆幼苗生長(zhǎng)的抑制效應(yīng),緩解苯甲酸對(duì)枯萎病發(fā)生的促進(jìn)效應(yīng)。

3.2 間作緩解苯甲酸自毒效應(yīng)的生理機(jī)制

植株在正常情況下,體內(nèi)活性氧產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài),CAT是植物細(xì)胞中清除活性氧,保護(hù)細(xì)胞的重要酶系統(tǒng),其活性可作為植物抗病性的生理生化指標(biāo)[22]。植物感病后,其體內(nèi)的保護(hù)酶活性與植株抗病性呈正相關(guān)[24-25]。自毒物質(zhì)脅迫下,茄子和黃瓜等作物的POD和CAT等抗氧化酶活性有一定程度的降低[14,26]。肉桂酸處理并接種鐮刀菌的條件下嫁接黃瓜苗根系中的CAT酶活性普遍高于自根苗,嫁接黃瓜根系具有較高的抗氧化系統(tǒng)[15]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,苯甲酸不同濃度處理并接種鐮刀菌的條件下,間作蠶豆根系和葉片的CAT酶活性均高于單作蠶豆,表明在自毒物質(zhì)苯甲酸脅迫下,間作蠶豆根系和葉片能夠迅速提高抗氧化系統(tǒng)活性(CAT),有效并及時(shí)清除體內(nèi)的自由基,提高蠶豆自身的抗性,從而緩解苯甲酸對(duì)枯萎病發(fā)生的促進(jìn)效應(yīng)。POD是酚類物質(zhì)代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶,存在于細(xì)胞壁上參與脯氨酸轉(zhuǎn)化和木質(zhì)素的合成,能控制病原菌的擴(kuò)展。本研究中,苯甲酸處理并接種尖孢鐮刀菌條件下,間作顯著提高了蠶豆根系和葉片的POD酶活性,從而抑制病原菌的破壞并保護(hù)蠶豆自身的生長(zhǎng)和代謝,表明小麥與蠶豆間作提升了蠶豆抵御枯萎病菌侵染的能力。

MDA 是直接反映膜脂過(guò)氧化程度的重要指標(biāo)之一,其含量的高低反映了細(xì)胞氧化損傷的程度,MDA含量越高,細(xì)胞膜受損傷程度越大。自毒物質(zhì)通過(guò)加速膜脂過(guò)氧化程度,造成營(yíng)養(yǎng)元素泄漏,從而刺激病原菌使其更易侵入寄主,結(jié)果表現(xiàn)為發(fā)病率高,土傳病害嚴(yán)重[27]。黃瓜根系分泌物中主要自毒物質(zhì)肉桂酸處理黃瓜后明顯增加了根系 MDA的含量,從而破壞了根系細(xì)胞的細(xì)胞膜,顯著增加根系的離子滲漏而促進(jìn)黃瓜枯萎病的發(fā)生[15]。本研究結(jié)果表明,苯甲酸處理并接種鐮刀菌后,蠶豆幼苗根系和葉片的 MDA含量顯著增高,枯萎病發(fā)病率和病情指數(shù)也顯著提高,表明蠶豆連作條件下,苯甲酸通過(guò)增加蠶豆幼苗的膜質(zhì)過(guò)氧化,提高營(yíng)養(yǎng)元素的滲透,促進(jìn)鐮刀菌對(duì)蠶豆的侵染而加劇枯萎病發(fā)生。苯甲酸各濃度處理下間作均顯著降低蠶豆根系和葉片的 MDA含量,表明間作顯著降低了蠶豆幼苗根系和葉片中 MDA的積累,降低脂質(zhì)過(guò)氧化傷害,膜透性下降,維持了苯甲酸作用下蠶豆幼苗細(xì)胞膜的穩(wěn)定性而減少了對(duì)鐮刀菌供應(yīng)營(yíng)養(yǎng),減輕了枯萎病發(fā)生。本研究結(jié)果與接種西瓜尖孢鐮刀菌5 d、10 d和15 d后西瓜根系內(nèi)MDA含量呈上升趨勢(shì),但與小麥伴生的西瓜根系內(nèi) MDA含量顯著低于單作西瓜的結(jié)論相同[28]。

苯甲酸脅迫條件下,蠶豆幼苗根系和葉片的 POD與 CAT活性下降,防御系統(tǒng)受到損害,MDA含量增加,細(xì)胞膜受損嚴(yán)重,降低其生理生化抗性是蠶豆幼苗枯萎病抗性降低的主要原因,而間作提高蠶豆抗氧化酶活性并降低膜脂過(guò)氧化程度,顯著提升了蠶豆對(duì)枯萎病的抗性。

3.3 苯甲酸脅迫下間作對(duì)蠶豆枯萎病病程相關(guān)蛋白的影響

當(dāng)寄主植物被病原菌侵染后,自身防御反應(yīng)啟動(dòng),病程相關(guān)蛋白表達(dá),產(chǎn)生水解真菌細(xì)胞壁的重要水解酶,從而提高寄主對(duì)病原菌的抵抗能力[28]。幾丁質(zhì)酶是重要的水解酶,能直接降解真菌細(xì)胞壁的主要成分——幾丁質(zhì),從而使菌絲停止生長(zhǎng),粗縮畸形,甚至完全解體消化,從而抵抗病原物侵染;β-1,3-葡聚糖酶是一類重要的病程相關(guān)蛋白,其在植物抗真菌病害的防衛(wèi)反應(yīng)中起著重要的作用[28]。添加阿魏酸并同時(shí)接種尖孢鐮刀菌,西瓜根系和葉片的幾丁質(zhì)酶活性受到抑制,西瓜葉片β-1,3-葡聚糖酶活性下降，從而促進(jìn)了西瓜枯萎病的發(fā)生[29]。本研究中,接種尖孢鐮刀菌的情況下,苯甲酸C1處理提高了蠶豆根系的β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性,此時(shí)蠶豆根系防御系統(tǒng)開(kāi)啟保護(hù)功能;當(dāng)苯甲酸處理超過(guò)C1濃度時(shí),β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性顯著低于對(duì)照,此時(shí)蠶豆自身保護(hù)系統(tǒng)功能逐漸下降,不能抵抗病原菌侵染而加劇枯萎病發(fā)生。表明苯甲酸和枯萎病菌共同脅迫加劇了蠶豆植物自身防御系統(tǒng)破壞程度,導(dǎo)致枯萎病嚴(yán)重發(fā)生。

伴生小麥通過(guò)提高西瓜根系 β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性而提高了西瓜對(duì)枯萎病的抗性[28]。西瓜與水稻間作顯著提高了西瓜根系幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶的活性,從而提高了西瓜抗枯萎病的能力[29]。本研究表明,添加苯甲酸并接種鐮刀菌情況下,小麥與蠶豆間作提高了蠶豆根系幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶的活性,且間作提高蠶豆根系幾丁質(zhì)酶和 β-1,3-葡聚糖酶的效果隨苯甲酸處理濃度升高而增加,表明苯甲酸高濃度累積環(huán)境下間作仍能顯著提高蠶豆病程相關(guān)蛋白表達(dá),從而提高蠶豆的抗病性。

本研究結(jié)果表明,自毒物質(zhì)苯甲酸一方面抑制蠶豆幼苗的生長(zhǎng),且通過(guò)降低蠶豆抗氧化酶和防御酶活性而降低蠶豆抗性,促進(jìn)枯萎病發(fā)生;苯甲酸和鐮刀菌的輔助和協(xié)同作用是形成蠶豆連作障礙的重要機(jī)制。小麥與蠶豆間作,緩解了苯甲酸對(duì)蠶豆幼苗生長(zhǎng)的抑制效應(yīng),提高了蠶豆的防御酶活性,降低了細(xì)胞膜受損程度,從生理上提高了蠶豆對(duì)枯萎病的抗病能力,緩解了苯甲酸對(duì)蠶豆的自毒效應(yīng),證實(shí)了合理間作是緩解作物連作障礙的有效措施。

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Alleviation mechanism of intercropping with wheat for faba bean autotoxicity under benzoic acid stress*

CHEN Ling1,DONG Kun2,YANG Zhixian3,DONG Yan1**,TANG Li1,ZHENG Yi1,4
(1.College of Resources and Environment,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China;2.College of Food Science and Technology,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China;3.Yunnan University,Kunming 650091,China;4.Southwest Forestry University,Kunming 650224,China)

Continuous cropping of faba bean causes serious growth obstacle,and benzoic acid is one of the main autotoxins in faba bean continuous cropping.Faba bean-wheat intercropping is a general planting pattern in Southwest China.To investigate the effect of benzoic acid on faba bean seedling growth andFusariumwilt occurrence,and to explore the effect and alleviationmechanism of intercropping with wheat on faba bean autotoxicity,a hydroponic experiment of faba bean-wheat intercropping with benzoic acid application was conducted in the greenhouse of Yunnan Agricultural University.Four benzoic acid rates were set,which were C0(0mg·L-1),C1(50mg·L-1),C2(100mg·L-1) and C3(200mg·L-1),with two planting patterns,faba bean monocropping and faba bean and wheat intercropping.The growth,enzymes activities and occurrence of faba beanFusariumwilt were investigated.The results showed that in comparison with C0treatment,seedling growth was inhibited with increasing benzoic acid concentration.Benzoic acid increased the incidence and disease index of monocropped faba beanFusariumwilt,significantly increased root and leaf MDA contents,and decreased the activities of antioxidant enzyme (POD and CAT) and pathogenesis-related proteins (β-1,3-glacanase and chitinase) with increasing application rates.Comparison with monocropped faba bean,intercropped faba bean increased shoot dry weight by17.0%-47.1%,reduced disease incidence and disease index by11.1%-25.0% and 20.0%-42.1%,respectively,under benzoic acid application.Furthermore,the peroxidase (POD) activity increased by12.9%-16.9% in root and by 9.3%-24.9% in leaf;and the catalase (CAT) activity increased by10.3%-54.0% in root and by 6.6%-20.5% in leaf under intercropped condition.Compared with monocropping of faba bean,intercropping with wheat increased faba bean β-1,3-glacanase and chitinase activities in root by 4.7%-13.1% and 6.7%-15.8%,while decreased malondialdehyde (MDA) contents in both root and leaf significantly by19.5%-25.4% and 20.5%-29.9%,respectively,with benzoic acid application.Under C2(100mg·L-1) treatment of benzoic acid stress,faba bean-wheat intercropping system showed the best effect of improving pathogenesis-related proteins and antioxidative enzymes activity.Intercropping of faba bean-wheat significantly increased physiological resistance toFusarium oxysporumf.fabaeand significantly decreased the incidence ofFusariumwilt.Therefore,it alleviated the damage ofFusariumwilt caused by benzoic acid,and promoted growth of faba bean.Thus,intercropping with wheat was an effective method to alleviate faba bean autotoxicity caused by benzoic acid.The results also provided an experimental evidence for developing an ecologicaleconomic and effective approach to control soil-borne diseases caused by continuous crop cultivation.

Benzoic acid;Faba bean;Continuous cropping obstacle;Intercropping;Antioxidative enzyme;Pathogenesisrelated protein;Fusariumwilt

S154.36

:A

:1671-3990(2017)01-0095-09

10.13930/j.cnki.cjea.160541

陳玲,董坤,楊智仙,董艷,湯利,鄭毅.苯甲酸脅迫下間作對(duì)蠶豆自毒效應(yīng)的緩解機(jī)制[J].中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2017,25(1):95-103

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* 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360507,31560586,31460551,31210103906)和云南省科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2015FA022)資助

** 通訊作者:董艷,主要研究方向?yàn)槎鄻有苑N植系統(tǒng)根際微生態(tài)與病害控制。E-mail:dongyanyx@163.com

陳玲,主要研究方向?yàn)槎鄻有苑N植系統(tǒng)根際微生態(tài)與病害控制。E-mail:379263512@qq.com

2016-06-15接受日期:2016-09-06

* The study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31360507,31560586,31460551,31210103906) and the Key Science and Technology Project of Yunnan Province of China (2015FA022).

** Corresponding author,E-mail:dongyanyx@163.com

Received Jun.15,2016;accepted Sep.6,2016