劉宗亮，黎 曉，李良東，楊 琴，王振文，黃志華，劉瑞珍，肖 海

(贛南醫(yī)學(xué)院 江西省腦血管疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 贛州 341000)

3'-大豆苷元磺酸鈉對(duì)大鼠腦缺血損傷后IL-10表達(dá)的影響*

劉宗亮，黎 曉，李良東，楊 琴，王振文，黃志華，劉瑞珍，肖 海

(贛南醫(yī)學(xué)院 江西省腦血管疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 贛州 341000)

目的：探討3'-大豆苷元磺酸鈉(DSS)對(duì)缺血再灌注損傷大鼠調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞因子IL-10表達(dá)的影響。方法：制作大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞腦缺血再灌注損傷模型，缺血后10 min，于舌下靜脈給予1.0 mg·kg-1和2.0 mg·kg-1的DSS。缺血2 h，再灌注24 h后，TTC染色法測(cè)定腦梗死體積，干濕重法檢測(cè)腦組織含水率，酶聯(lián)免疫學(xué)方法測(cè)定血清及缺血側(cè)腦組織血清白介素-10(IL-10)的含量，免疫組織化學(xué)及Western blot方法檢測(cè)缺血半損傷區(qū)皮層組織IL-10蛋白的表達(dá)。結(jié)果：模型組大鼠出現(xiàn)明顯的腦梗死灶，腦組織含水率升高，血清及腦組織IL-10含量降低；DSS治療后，血清及腦組織IL-10含量升高。結(jié)論：DSS可通過(guò)提高調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)，抑制腦缺血再灌注損傷后炎癥反應(yīng)。

3'-大豆苷元磺酸鈉；腦缺血再灌注損傷；白介素-10；炎癥反應(yīng)

腦卒中疾病發(fā)展過(guò)程中的病理?yè)p傷機(jī)制非常復(fù)雜。炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、能量代謝障礙及谷氨酸等興奮性氨基酸的毒性反應(yīng)、鈣超載、線粒體功能紊亂等多種機(jī)制參與了其病理過(guò)程[1-3]。其中，炎癥反應(yīng)在腦缺血再灌注損傷中起著至關(guān)重要的作用。因此，采取有效的干預(yù)措施調(diào)節(jié)炎癥應(yīng)答過(guò)程，減輕神經(jīng)細(xì)胞的損傷，是防治腦缺血再灌注損傷的一個(gè)重要策略。3'-大豆苷元磺酸鈉(3'-daidzein sulfonate sodium,DSS)系中藥葛根的主要有效成分——大豆苷元的結(jié)構(gòu)修飾體。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，DSS可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激及促炎細(xì)胞因子IL-6水平，對(duì)腦缺血再灌注損傷起保護(hù)作用[4-5]。研究表明，調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞通過(guò)抑炎細(xì)胞因子IL-10抑制缺血后炎癥反應(yīng)，對(duì)腦缺血起保護(hù)作用[6]。DSS對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用是否也可通過(guò)上調(diào)IL-10的水平，從而抑制腦缺血再灌注后炎癥反應(yīng)？

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠，SPF級(jí)，體重250～280 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(湘)2011-0003。

1.1.2 主要試劑 3'-大豆苷元磺酸鈉(C15H9O7SNa)為白色結(jié)晶粉末，由沈陽(yáng)藥科大學(xué)天然藥物化學(xué)教研室提供(純度>99%)，實(shí)驗(yàn)前用雙蒸水稀釋至所需濃度。2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-tripheyltetrazolium, TTC)(Sigma公司)、IL-10 ELISA試劑盒及SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組與大鼠腦缺血再灌注損傷模型的制備 實(shí)驗(yàn)大鼠按數(shù)字隨機(jī)法分成4組：假手術(shù)組(sham組)、腦缺血再灌注損傷模型組(model組)、DSS(1.0, 2.0 mg·kg-1)治療組。大鼠用10%水合氯醛溶液(350 mg·kg-1，ip)麻醉，參照Longa等[7]的方法制備大腦中動(dòng)脈栓塞模型。假手術(shù)組大鼠只暴露和分離頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，不閉塞大腦中動(dòng)脈。術(shù)中控制室溫在23 ℃～25 ℃。藥物治療組于缺血后10 min分別經(jīng)由舌下靜脈注射1.0 mg·kg-1和2.0 mg·kg-1的DSS，sham組和model組給予等體積的生理鹽水。

1.2.2 腦片制作和TTC染色 腦缺血再灌注24 h后，用上述方法麻醉大鼠，斷頭取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干。置于大鼠腦模具中，以視交叉處為中心，沿冠狀面2 mm厚切片，連續(xù)5片，將腦片迅速置于1%的TTC染色液中，避光下，37 ℃孵育箱孵育30 min。染色結(jié)果為腦梗死區(qū)呈白色，非梗死區(qū)呈玫瑰紅色。將染色后腦片置于4%多聚甲醛(paraformaldehyde)中固定，濾紙吸干腦片表面水分后按順序擺放，數(shù)碼相機(jī)拍照。

1.2.3 腦組織含水率測(cè)定 另取大鼠按上述相同方法制備模型及給藥后，斷頭取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干。生理鹽水洗凈后，濾紙吸干表面水分，電子天秤稱量腦濕重，將腦組織在105 ℃，24 h條件下烘干、稱腦干重。計(jì)算腦組織含水率(%)=(腦濕重-腦干重)/腦濕重×100%。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 腦缺血再灌注24 h后，麻醉后腹腔靜脈取血，4 ℃，3 000轉(zhuǎn)離心10 min，取血清，-80 ℃保存。取缺血側(cè)腦組織，于冰浴中制備10%的腦組織勻漿，4 ℃，3 500轉(zhuǎn)離心10 min，取上清，-80 ℃保存。嚴(yán)格按上述試劑盒說(shuō)明操作，酶免法測(cè)定血清和腦勻漿組織上清液中IL-10的含量。

1.2.5 免疫組織化學(xué)方法 腦缺血再灌注24 h后，大鼠麻醉后，行組織內(nèi)固定后取前腦，4%多聚甲醛固定24 h后，梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、5 μm厚切片。切片脫蠟至水，免疫組化SABC法檢測(cè)缺血半損傷區(qū)腦組織中IL-10的表達(dá)，嚴(yán)格按免疫組化試劑盒說(shuō)明書操作。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片，光鏡下觀察。細(xì)胞質(zhì)染色為棕黃色顆粒判定為陽(yáng)性細(xì)胞。

2 結(jié) 果

2.1 DSS對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦梗死范圍的影響 TTC染色后，左側(cè)大腦梗死灶區(qū)呈白色，分布在額頂部皮質(zhì)和尾殼核。依圖顯示，1.0 mg·kg-1DSS和2.0 mg·kg-1DSS治療后均能縮小腦梗死范圍，以高劑量組(2.0 mg·kg-1)效果最佳(見圖1)。

A為sham組，B為model組，C為1 mg·kg-1DSS組，D為2 mg·kg-1DSS組。

圖1 DSS對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦梗死范圍的影響

2.2 DSS對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織含水率的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織含水率明顯升高(P<0.001)，DSS治療后腦組織含水率降低，其中1.0 mg·kg-1DSS及2.0 mg·kg-1DSS組與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(圖2)。

注：***P<0.001與假手術(shù)組比較，#P<0.05與模型組比較。

2.3 DSS對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠IL-10的影響 模型組大鼠血清(P<0.001)及腦組織(P<0.05)IL-10含量降低，DSS治療后，血清及腦組織IL-10含量升高(P<0.05)(圖3,4)。免疫組化染色后，顯微鏡下觀察細(xì)胞胞漿呈棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞，定位于神經(jīng)細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞，假手術(shù)組可見大量強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞，而模型組僅見少量弱陽(yáng)性細(xì)胞，DSS治療組則較模型組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加明顯(圖5)。

注：*P<0.05與假手術(shù)組比較，#P<0.05與模型組比較。

圖3 DSS對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠血清IL-10含量的影響

注：**P<0.01與假手術(shù)組比較，#P<0.05與模型組比較。

圖5 DSS對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織細(xì)胞IL-10表達(dá)的影響(免疫組化染色，×40)

3 討 論

自Setehell和Adlerereutz首次證實(shí)異黃酮和木醋體與哺乳動(dòng)物雌激素結(jié)構(gòu)的相似性，并闡述它們可能具有防癌作用以來(lái)，植物雌激素就受到人們的廣泛關(guān)注[8]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，植物雌激素表現(xiàn)出很好的抗腦中風(fēng)作用[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，植物雌激素大豆苷元的結(jié)構(gòu)改造物DSS處理后，降低大鼠腦梗死范圍，提示其對(duì)腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。

在腦缺血再灌注損傷發(fā)展過(guò)程中，炎癥反應(yīng)起重要作用。炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、腦水腫形成、各種細(xì)胞因子和黏附因子的產(chǎn)生，以及基質(zhì)金屬蛋白酶等均與腦梗死的過(guò)程密切相關(guān)[10]。在腦缺血再灌注損傷情況下，中樞損傷局部及外周血中炎性反應(yīng)相關(guān)信號(hào)均呈活化狀態(tài)，炎性細(xì)胞因子參與了腦缺血再灌注損傷過(guò)程中中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷及損傷修復(fù)過(guò)程，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[11]。另外，調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞通過(guò)抑炎細(xì)胞因子IL-10抑制缺血后炎癥反應(yīng)，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增生，對(duì)腦缺血起保護(hù)作用[6，12-13]；腦室內(nèi)注射IL-10后，下調(diào)腦缺血再灌注損傷活化的炎癥信號(hào)通路[14]?？梢娬{(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞及其細(xì)胞因子是腦缺血再灌注損傷后炎癥反應(yīng)重要的負(fù)調(diào)控因子。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DSS可明顯降低腦組織含水率，提示其可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷起保護(hù)作用。DSS可降低缺血側(cè)腦組織促炎細(xì)胞因子IL-6水平[5]，升高血清及腦組織中抑炎細(xì)胞因子IL-10的含量或表達(dá)，證明DSS能通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠起保護(hù)作用。

綜上所述，DSS能有效對(duì)抗腦缺血再灌注時(shí)引起的炎癥反應(yīng)，其作用機(jī)制可能與提高調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌抗炎細(xì)胞因子IL-10有關(guān)。然而，DSS對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及IL-10的調(diào)控機(jī)制鮮有報(bào)道，還有待于進(jìn)一步研究。

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Effects of 3'-daidzein sulfonate on IL-10 Expression After Focal Cerebral Ischemia in Rats

LIUZong-liang,LIXiao,LILiang-dong,YANGQing,WANGZhen-wen,HUANGZhi-hua,LIURui-zhen,XIAOHai

(GannanMedicalUniversity,KeyLaboratoryofCerebrovascularDiseasesofJiangxiProvince,Ganzhou,Jiangxi341000)

Objective: To investigate the effect of 3'-Daidzein Sulfonate Sodium (DSS) on IL-10, an anti-inflammatory cytokine secreted by regulatory T cells, in cerebral ischemia/reperfusion injury. Method: A rat middle cerebral artery occlusion (MCAO) model was established. 10 minutes after ischemia, 1.0 mg·kg-1and 2.0 mg·kg-1DSS were given via the sublingual vein. After 2 h of ischemia and 24 h of reperfusion, brain water rate was calculated by the wet and dry weight method. Serum and brain tissue interleukin-10 (IL-10) content were examined by enzyme linked immunosorbent assay. The IL-10 protein expression in the ischemic penumbra region of cortical tissue was detected by immunohistochemistry and western blot assay. Result: DSS decreased cerebral infarct size and water content in rats with cerebral ischemia/reperfusion injury. It also significantly increased serum and brain tissue IL-10 content in the ischemic penumbra region. Conclusion: DSS can inhibit the inflammatory response after cerebral ischemia reperfusion injury through the increase of regulatory T cells factor, the expression of IL-10.

3'-Daidzein Sulfonate Sodium; cerebral ischemia/reperfusion; IL-10; inflammatory response

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(NO：81560583)；江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(NO：20142BAB205021)；江西省教育廳科技項(xiàng)目(No.GJJ13679)；江西省衛(wèi)生廳項(xiàng)目(No.20155659)

肖海，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，從事心腦血管疾病研究。E-mail：xh669168@sina.com

R285.5

A

1001-5779(2016)06-0846-04

10.3969/j.issn.1001-5779.2016.06.003

2016-12-08)(責(zé)任編輯：敖慧斌)