郭小華，胡海波，金 奇，李洪亮，程齊來

(贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江西 贛州 341000)

獼猴桃根中TUA對肺癌移植瘤增殖抑制作用及機制初步研究*

郭小華，胡海波，金 奇，李洪亮，程齊來

(贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江西 贛州 341000)

目的:研究獼猴桃根中分離得到的烏蘇烷化合物TUA(2β,3β,23-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸)對肺癌裸鼠移植瘤增殖抑制作用并初步探討其作用機制。方法:采用NCI-H460細(xì)胞裸鼠移植成瘤,再把裸鼠傳代2代以上的瘤塊,使用解剖針接入裸鼠右肢皮下部位,建立人肺癌裸鼠異體移植瘤模型。接瘤后待移植瘤體積約50 mm3，將小鼠隨機分成6組:(1) 模型組； (2) 10 mg·kg-1順鉑給藥組；(3)10 mg·kg-1PDTC組；(4) TUA高劑量組(30 mg·kg-1)；(5) TUA中劑量組(12 mg·kg-1)；(6) TUA低劑量組(6 mg·kg-1),腹腔注射給藥,連續(xù)14天,觀察各組對移植瘤模型動物的體重、瘤體積和瘤重的影響, 繪制腫瘤體積生長曲線計算抑瘤率和腫瘤指數(shù);采用HE染色觀察裸鼠腫瘤組織病理學(xué)改變；采用免疫組化和Western blot檢測TUA對腫瘤組織中NF-κB相關(guān)信號通路蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果:給藥后裸鼠體內(nèi)瘤組織變小；隨著TUA劑量的不斷增加，瘤組織也越來越小，尤其是在TUA高劑量(30 mg·kg-1)時，其腫瘤組織大小與NF-κB抑制劑PDTC(10 mg·kg-1)相當(dāng)；HE染色觀察結(jié)果證實TUA處理過的腫瘤組織腫瘤壞死程度和核分裂象明顯降低；免疫組化結(jié)果表明TUA處理組與模型組比較，p65在腫瘤組織中表達(dá)降低,而IκBα表達(dá)增加；Western blot法檢測結(jié)果也表明，與NF-κB相關(guān)的p65蛋白表達(dá)水平下降，與此同時IκBα蛋白表達(dá)水平增加；與凋亡相關(guān)蛋白的Survivin蛋白表達(dá)受到抑制， Caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)。結(jié)論:TUA能顯著抑制肺癌移植瘤的生長，其機制可能與抑制腫瘤組織中凋亡相關(guān)蛋白p65,Survivin表達(dá)和上調(diào)IκBα,Caspase-3蛋白的表達(dá)相關(guān)。

TUA；肺癌；移植瘤；凋亡相關(guān)蛋白

目前肺癌仍然是全世界導(dǎo)致癌癥患者死亡的主要原因,而其中的非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC) 患者幾乎占到其中的85%～90%[1]。 肺癌高致死率的原因主要是早期診斷困難、更易向周圍組織器官轉(zhuǎn)移、對化療藥物的敏感性愈來愈低等[2]。盡管含順鉑和卡鉑的雙鉑化療方案在超過50%的NSCLC患者的治療過程中應(yīng)用過多年, 但是其5年生存率大概只有15.7%～17.5%，并且絕大部分的患者在隨后的十年內(nèi)最終病情進(jìn)一步惡化而去世。雖然當(dāng)今世界上很多國家一直在嘗試應(yīng)用一些新穎的預(yù)防與治療肺癌的策略，但是其應(yīng)用后的5年生存率仍然不會超過18%[3]。因此，為了提高肺癌患者的生存率，目前最迫切的任務(wù)是開發(fā)新的臨床藥物，特別是一些源自動植物、具有廣泛的生物活性、幾乎無不良反應(yīng)的天然產(chǎn)物。

在過去的一個多世紀(jì)以來，天然產(chǎn)物已經(jīng)為人類疾病的治療提供了大量的藥物來源[4]。近年來體內(nèi)外研究表明，從植物中分離鑒定得到的相當(dāng)多數(shù)量的萜類化合物對不同種類的腫瘤細(xì)胞株具有顯著的抗腫瘤活性，其中有些化合物已經(jīng)成功的應(yīng)用于臨床人類腫瘤疾病的預(yù)防，特別是一些五環(huán)三萜類化合物，例如齊墩果酸(oleanolic acid), 甘草酸(glycyrrhetic acid)和甘草次酸(carbenoxolone)等[5]。因此，研究與開發(fā)新型的具有更強抗腫瘤活性的五環(huán)三萜類化合物及其衍生物越來越引起醫(yī)藥、生化、分子生物學(xué)等生命科學(xué)相關(guān)專業(yè)背景的研究者的興趣。

TUA (2β,3β,23-trihydroxy-urs-12-en-28-oic acid)是從傳統(tǒng)中藥獼猴桃根ActinidiachinensisRadix中提取分離鑒定得到的一個烏蘇烷型五環(huán)三萜類主要活性成份之一。獼猴桃根A.chinensisRadix 又名藤梨根,是我國江西、廣西、四川等應(yīng)用較為廣泛地民間中草藥，在民間一直有其可冶“無名腫毒”之說，很多地區(qū)將其應(yīng)用于防治腫瘤取得了較好的療效，如胃癌、食管癌、肝癌、肺癌等[6]。已有大量研究表明，與TUA結(jié)構(gòu)類似的烏蘇烷型三萜類化合物及其衍生物具有抗氧化作用、抗免疫作用、神經(jīng)保護(hù)作用、抗腫瘤作用等廣泛的藥理活性[7]。

本課題組前期研究表明TUA具有體外抑制肺癌細(xì)胞NCI-H460增殖誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用[8]。本實驗利用肺癌細(xì)胞NCI-H460 細(xì)胞系，制備裸鼠移植瘤模型，以TUA為研究對象，觀察TUA應(yīng)用在體內(nèi)對NCI-H460移植瘤的影響，探討其作用機制，可為進(jìn)一步闡述其潛在的癌癥化學(xué)預(yù)防用途提供理論依據(jù)。

1 材 料

1.1 藥品(試劑) TUA 由本實驗室從ActinidiachinensisRadix (Actinidiaceae) 根提取分離得到。主要采用溶劑提取法和多種柱層析的方法對獼猴桃根進(jìn)行分離，利用理化分析和波譜技術(shù)對所得到的化合物進(jìn)行鑒定,最終得到烏蘇烷型三萜化合物TUA，采用Agilent1100 HPLC,DAD檢測器,面積歸一法測定其純度，結(jié)果含量>97%。在本次實驗中， TUA 用二甲亞砜(DMSO)溶解。溶劑DMSO的最終濃度不超過0.1%；實驗過程中使用的藥品一般貯存在-4 ℃冰箱中不超過4天。藥物所需濃度用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)節(jié)，現(xiàn)配現(xiàn)用; Roswell Park Memorial Institute1640 培養(yǎng)基(RPMI1640, GIBCO Company, USA);SDS(Bio-Rad公司，批號：210008353)；DAB顯色試劑盒(中衫金橋，批號：K133319D)；各種抗體：①內(nèi)參抗體HRP標(biāo)記的GAPDH優(yōu)質(zhì)內(nèi)參(上海康成生物，貨號：KC-5G5)；②一抗名稱：Caspase-3(novusibo，貨號：NB500-210),相應(yīng)二抗：Rabbit Anti-Mouse IgG(H+L)-HRP;一抗名稱：Survivin(Cell signaling，貨號：2802),相應(yīng)二抗：Rabbit Anti-Mouse IgG(H+L)-HRP;一抗名稱：p65 ，IκBα(abcam，貨號：16502),相應(yīng)二抗：Goat Anti-Rabbit IgG(H+L), Mouse/Human ads-HRP;③二抗名稱：Goat Anti-Rabbit IgG(H+L), Mouse/Human ads-HRP(southern biotech，貨號：4050-05)；二抗名稱：Rabbit Anti-Mouse IgG(H+L)-HRP(southern biotech，貨號：6170-05);DMSO 和所有其他生化試劑均購自 Sigma-Aldrich公司(St. Louis, MO,USA)。

1.2 主要儀器 倒置光學(xué)顯微鏡(CKX41, OLYMPUS)；細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱(HERACELL150i， Thermo scientific)；臺式高速冷凍離心機(H1650R，上海盧湘儀)；酶標(biāo)儀(SPECTRA max Plus 384，Molecular Devices公司)；電泳系統(tǒng)(Mini-Proten Tetra System，Bio-RAD公司)； 凝膠成像儀(ChemiDoc XRS+ System，Bio-RAD公司)。

1.3 細(xì)胞系及實驗動物 人類肺癌細(xì)胞株NCI-H460購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫； SPF級BALB/c裸鼠70只，18～22 g，6～8周齡，雌性，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(滬)2012-0002。

2 實驗方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 NCI-H460細(xì)胞置于RPMI 1640 培養(yǎng)基[其中主要含10%胎牛血清(FBS)、100 U·mL-1青霉素、2 mmol·L-1L-谷氨酰胺和100 mg·L-1鏈霉素等]中，在95%飽和濕度、5%CO2、37 ℃的恒溫密閉培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。每天進(jìn)行細(xì)胞生長情況觀察，一次傳代周期為3天。后續(xù)所有實驗都使用正常培養(yǎng)的處于對數(shù)生長期的NCI-H460細(xì)胞。同時溶解樣品(供試藥品及對照品等)的二甲亞砜(DMSO)的最后濃度≤0.1%。

2.2 移植瘤動物模型制備 收集對數(shù)生長期NCI-H460細(xì)胞，用無血清、無抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌3次，流式計數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，在超凈鏡臺內(nèi)進(jìn)行動物實驗，以酒精棉短暫消毒， 用1 mL 無菌注射器將細(xì)胞懸液吹打混勻后，取0.1 mL 接種于裸鼠右側(cè)皮下，5×105Cells/只，制備瘤原動物。2周后，取皮下腫瘤組織，浸泡于預(yù)冷PBS，去除腫瘤包膜及腫瘤內(nèi)部組織，將活性組織剪成1 cm3左右的小方塊，用解剖針接入裸鼠右肢皮下部位。

2.3 抑瘤實驗 接種瘤塊3天后，每天觀察裸鼠的生長情況，觀察裸鼠的行動、對外界刺激的反應(yīng)、飲食、糞便顏色、體重(W)，并對腫瘤生長情況進(jìn)行監(jiān)測。接瘤第3天后待移植瘤體積約50 mm3，將小鼠隨機分成6組，開始腹腔給藥并量取瘤徑。具體分組情況如下：(1)模型組；接種腫瘤后生理鹽水給藥組；(2)陽性對照組1：接種腫瘤后順鉑給藥組，給藥劑量10 mg·kg-1；(3)陽性對照組2：NF-κB抑制劑二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)組，給藥劑量10 mg·kg-1；(4)TUA高劑量組：給藥劑量30 mg·kg-1；(5)TUA中劑量組：給藥劑量12 mg·kg-1；(6)TUA低劑量組：給藥劑量6 mg·kg-1。用游標(biāo)卡尺測量瘤體的最長徑(a)和最短徑(b)，計算腫瘤的體積(V)，V(cm3)= 1/6πab2=0.5236ab2；繪制腫瘤體積生長曲線。實驗結(jié)束，采用頸椎脫臼法處死裸鼠，取皮下瘤塊，稱重并拍照后浸泡于4%多聚甲醛固定，每組分取一半腫瘤樣本凍存于液氮(-80 ℃)中，待后續(xù)病理切片HE染色、免疫組化及Western blotting等。A.生長指數(shù)：每周測量4～5次腫瘤的最長直徑(a)和最短直徑(b)，計算體積：V=1/6πab2=0.5236ab2，繪制腫瘤體積生長曲線。B.腫瘤指數(shù)：腫瘤指數(shù)(mg/g)=腫瘤體質(zhì)量(mg)/小鼠體質(zhì)量(g)。C.抑瘤率%=[(1-T/C)]×100%,式中:T-受試藥物組平均瘤重； C-實驗對照組 (模型組,荷瘤未用藥動物) 平均瘤重。

2.4 HE染色觀察裸鼠腫瘤組織病理學(xué)改變

2.4.1 制作切片 腫瘤組織于4%甲醛溶液中固定3～5 d；從固定液中取出組織，修整為適當(dāng)?shù)男螤罴昂穸龋唤M織塊經(jīng)過80%、90%、95%、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、100%乙醇Ⅲ進(jìn)行脫水處理；二甲苯Ⅰ45 min、二甲苯Ⅱ15 min透明處理；浸蠟5 h;按照取材面向下的原則，用石蠟包埋起組織，待蠟塊冷卻凝固后置于-20 ℃冷藏；切片(厚度4 μm)；切片放入65 ℃恒溫箱中6～12 h；裝盒，常溫保存。

2.4.2 HE染色 二甲苯Ⅰ 15 min、二甲苯Ⅱ 15 min、無水乙醇Ⅰ 5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、95%乙醇5 min、80%乙醇5 min、自來水浸洗1 min；將切片浸入蘇木精(Hematoxylin)染液中常溫染色5 min，自來水洗1 min；將切片浸入1%鹽酸酒精溶液數(shù)秒，自來水至組織返藍(lán)；將切片浸入伊紅(Eosin)染液中染色3～5 min，自來水洗去玻片上的浮色即可；80%乙醇0.5 min、95%乙醇Ⅰ 0.5 min、95%乙醇Ⅱ 0.5 min、無水乙醇Ⅰ 0.5 min、無水乙醇Ⅱ 0.5 min、二甲苯Ⅰ透明3 min、二甲苯Ⅱ透明3 min、取出后用中性樹膠封固；顯微觀察，拍照，染色結(jié)果分析。

2.5 免疫組化(IHC)檢測腫瘤組織p65、IκBα的表達(dá)

2.5.1 制作切片 組織切片放入65 ℃恒溫箱中6～12 h。

2.5.2 免疫組化法檢測腫瘤組織p65、IκBα的表達(dá) 二甲苯脫蠟，梯度酒精復(fù)水：二甲苯Ⅰ20 min—二甲苯Ⅱ20 min—100%乙醇5 min—100%乙醇Ⅱ5 min—95%乙醇5 min—80%乙醇5 min—PBS洗3×3 min；阻斷、滅活內(nèi)源性過氧化物酶：3%H2O237 ℃孵育10 min，PBS沖洗3×3 min；抗原修復(fù):置0.01 M枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)中微波修復(fù)，自然冷卻至室溫， PBS沖洗3×3 min；滴加一抗4 ℃冰箱孵育過夜(用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照)，轉(zhuǎn)至室溫平衡30 min， PBS沖洗3×5 min；滴加二抗，37 ℃孵育15 min，PBS沖洗3×5 min； DAB反應(yīng)染色，顯微鏡下觀察反應(yīng)進(jìn)度，自來水充分沖洗；蘇木素復(fù)染，干燥，封片。

2.5.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 顯微鏡下觀察，每張免疫組化切片隨機選擇3個不同的視野(×200)觀察，并判讀陽性表達(dá)強度和陽性率。染色結(jié)果采用半定量分析方法：以染色強度結(jié)合陽性細(xì)胞數(shù)百分比進(jìn)行評分。

2.6 Western blot 檢測p65、IκBα、Caspase-3等蛋白表達(dá) 取液氮中保存的腫瘤組織適量，加含 1%蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液1 mL，在勻漿器中勻漿后提取細(xì)胞總蛋白并采用BCA定量，取等量總蛋白(40 μg)進(jìn)行10% SDA-PAGE，Bio-Rad轉(zhuǎn)膜儀半干法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉;一抗4 ℃孵育過夜，洗膜，二抗室溫孵育1 h，洗膜，ECL顯色，Gel-pro Analyzer軟件進(jìn)行圖像分析，以一抗/GAPDH的比值表示蛋白的含量。其中一抗p65,IκBα (稀釋倍數(shù)1∶2 000),相應(yīng)二抗：Goat Anti-Rabbit IgG(H+L), Mouse/Human ads-HRP (稀釋倍數(shù)1∶20 000); 一抗Caspase-3(稀釋倍數(shù)：1∶500),一抗Survivin(稀釋倍數(shù)：1∶1 000)相應(yīng)二抗：Rabbit Anti-Mouse IgG(H+L)-HRP(稀釋倍數(shù)：1∶1 000);HRP標(biāo)記的GAPDH作為內(nèi)參(稀釋倍數(shù)：1∶10 000)。

3 結(jié) 果

3.1 抑瘤實驗 動物成瘤及生長情況：本實驗60只裸鼠有59成瘤，成瘤率98.30%，接種瘤塊3天，可見直徑約3～4 mm的瘤樣結(jié)節(jié)，質(zhì)地軟。之后瘤性結(jié)節(jié)漸硬，體積增大明顯。裸鼠給藥后皮下移植瘤變化情況見圖1，給藥后2周(day1～day14)生長曲線見圖2，瘤重抑制率和腫瘤指數(shù)見表1。從圖圖1中可以看出，給藥后，裸鼠體內(nèi)瘤組織變小，隨著TUA劑量的不斷增加，瘤組織也越來越小，尤其是在TUA高劑量(30 mg·kg-1)時，其腫瘤組織大小與NF-κB抑制劑PDTC(10 mg·kg-1)相當(dāng)；從圖2生長曲線可以得到類似的結(jié)果，模型組腫瘤組織體積逐漸增大(從59.16 mm3一直增加到1177.81 mm3),給藥組腫瘤體積增加較緩慢，在TUA高劑量(30 mg·kg-1)時較明顯(從59.16 mm3增加到429.11 mm3),進(jìn)一步說明TUA對腫瘤組織的生長有一定的抑制效果；從表1瘤重抑制率和腫瘤指數(shù)同樣能得到相似的結(jié)論，TUA高、中劑量與模型組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，臨床上常用的治療肺癌的藥物順鉑及NF-κB抑制劑PDTC的處理效果與模型組比較，差異同樣均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(表2)。

圖1 TUA對裸鼠腫瘤生長情況的影響

Fig.1 Effect of TUA on the tumor growth in nude mice

圖2 TUA對裸鼠腫瘤生長抑制作用(腫瘤生長曲線)

Fig.2 The inhibition effect of TUA on the tumor growth in >nude mice(Growth curve)

表1 瘤重抑制率和腫瘤指數(shù)±s,n=5

與模型組比，*P<0.05,**P<0.01。

表2 方差分析結(jié)果(ANOVA)

3.2 HE染色 移植瘤組織HE染色結(jié)果為細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞漿呈粉紅色，紅細(xì)胞呈較鮮艷的紅色,結(jié)果見圖3。從圖中可以看出，模型組組織切片可見大量腫瘤壞死區(qū)及核分裂現(xiàn)象，TUA組與PDTC組、順鉑組類似，腫瘤壞死程度和核分裂象明顯降低，同時可見較多膠原纖維。進(jìn)一步從病理學(xué)的角度證明了TUA對移植瘤的增殖有一定的抑制作用。

圖3 TUA處理后腫瘤組織病理學(xué)變化(HE染色)

Fig.3 histopathological changes of tumor after TUA treatment (HE staining)

3.3 免疫組化 應(yīng)用免疫組化法檢測移植瘤組織中NF-κB(p65),IκBα表達(dá)，免疫染色結(jié)果見圖4, 從圖中可以看出, p65免疫陽性主要定位在細(xì)胞核和胞漿中,IκBα免疫陽性主要定位在細(xì)胞胞漿中，均呈棕黃色；TUA處理組與模型組比較，p65在腫瘤組織中表達(dá)降低(圖4 A),而IκBα表達(dá)增加(圖4B)，陽性對照藥物PDTC、順鉑也表現(xiàn)出類似的作用效果。

A.p65免疫組化結(jié)果

B. IκBα免疫組化結(jié)果

圖4 TUA對腫瘤組織中p65,IκBα表達(dá)的影響

Fig.4 Effect of TUA on expressions of p65, IκBα in tumor

3.4 Western blot 結(jié)果 采用Western blot法分析移植瘤組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化情況，各處理組檢測結(jié)果見圖5。從圖中可以得知，與NF-κB相關(guān)的p65蛋白表達(dá)水平下降，與此同時IκBα蛋白表達(dá)水平增加；與凋亡相關(guān)蛋白的Survivin蛋白表達(dá)受到抑制， Caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)； TUA高劑量組(30 mg·kg-1)作用效果與陽性對照藥物PDTC、順鉑相當(dāng)。

圖5 TUA對移植瘤組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Fig.5 Influence of TUA on expressions of apoptosis-related proteins in tumor

4 討 論

眾所周知,目前肺癌治療過程中所遇到的緊迫問題是當(dāng)前化學(xué)治療所用的抗腫瘤藥物存在廣泛的不良反應(yīng)及耐藥性。肺癌診治迫切需要采取新的治療策略，如從動植物中提取分離得到具有較強抗肺癌作用、毒副作用小的天然產(chǎn)物一直是一條有效的途徑。近年來，許多研究已經(jīng)證實，從中草藥中分離得到的烏蘇烷三萜類化合物具有廣泛抗腫瘤活性。為了開發(fā)更多有效的抗癌藥物，富含烏蘇烷三萜類的植物提取物或單體化合物越來越引起研究者的興趣，例如源自中草藥的熊果酸、積雪草酸、冬青素等以及其一系列衍生物的抗腫瘤作用已得到確證，并且有些化合物已經(jīng)應(yīng)用于臨床試驗。然而，有關(guān)藤梨根(A.chinensisRadix)中烏蘇烷三萜類化合物抗腫瘤作用一直未見報道，特別是其中的烏蘇烷三萜TUA的抗肺癌作用，因此很有必要對TUA抗肺癌藥理活性進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究。在本次研究中,結(jié)果證實了TUA在體內(nèi)(移植瘤)有潛在的肺癌生長抑制作用,并且對正常的組織細(xì)胞毒副作用較小;實驗還證實了其抑制腫瘤生長的機制可能是通過抑制NF-κB信號通路從而引起腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。

NF-κB是一種涉及腫瘤發(fā)生與炎癥疾病的重要轉(zhuǎn)錄因子[9]。NF-κB一般在人類肺部腫瘤組織或腫瘤細(xì)胞中持續(xù)性高表達(dá),腫瘤組織細(xì)胞中NF-κB高表達(dá)與腫瘤生成的諸多方面有關(guān)聯(lián)，例如腫瘤細(xì)胞生長，抗凋亡作用，轉(zhuǎn)移，腫瘤血管生成以及對化療藥物的耐藥性等[10]。NF-κB的活化與腫瘤細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生與發(fā)展有關(guān)，因此可以通過抑制IKKβ/NF-κB信號通路來達(dá)到治療相關(guān)腫瘤的目的[11]。大量研究已證實，腫瘤組織中NF-κB受到抑制后，腫瘤細(xì)胞增殖受到抑制，同時細(xì)胞周期也受到阻滯，細(xì)胞凋亡也相應(yīng)增加[12]。NF-κB與DNA目標(biāo)靶點結(jié)合后形成同源或異源二聚體，調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖與擴散[13]。總之, 在開發(fā)創(chuàng)新抗腫瘤藥物過程中，NF-κB極有可能做為一個新的治療靶點。

在肺癌(NSCLCCs)防治研究過程中,無論是體內(nèi)實驗還是體外實驗，有很多天然產(chǎn)物如curcumin[14],vinorelbine[15],Feroniellin A[16],Minnelide[17]已經(jīng)證實可以通過抑制NF-κB通路來達(dá)到抑制腫瘤組織生長、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的目。Tsao’s 課題組研究表明Protocatechuic acid (PCA)能夠劑量依賴性的下調(diào)肺癌細(xì)胞株A549, H3255, and Calu-6中NF-κB p50和NF-κB p65蛋白的表達(dá)[18]。另一研究也證明Bee venom(BV) 能夠通過調(diào)節(jié)NF-κB活性抑制肺癌A549和NCI-H460細(xì)胞株的進(jìn)一步增殖[19]。本研究的Western blot實驗結(jié)果表明，經(jīng)TUA處理后，移植瘤中p65蛋白表達(dá)受到抑制，而與此同時IκBα蛋白表達(dá)水平增加，說明TUA介導(dǎo)的NSCLCCs細(xì)胞凋亡與其抑制NF-κB活性相關(guān)，這與上述研究結(jié)果一致。

在腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中，細(xì)胞凋亡一般承擔(dān)反向調(diào)節(jié)的角色(能夠阻止腫瘤細(xì)胞的快速增殖分化)。該進(jìn)程受許多凋亡促進(jìn)因子和凋亡抑制因子的共同調(diào)控。激發(fā)與恢復(fù)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的能力，是有效的腫瘤防治途徑?；罨腘F-κB可以通過多種途徑抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，主要通過誘導(dǎo)腫瘤凋亡蛋白抑制家族(IAPs)，Bcl-2家族，TRAF家族等抗凋亡蛋白的表達(dá)或者抑制Caspase家族等凋亡促進(jìn)蛋白的表達(dá)等方式。因此，抑制NF-κB信號通路將有助于腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而加速腫瘤細(xì)胞的凋亡。Survivin是腫瘤凋亡抑制蛋白家族IAPs的重要成員，它在非病理狀態(tài)下僅表達(dá)于胚胎組織而不會在成人終末分化組織表達(dá)，但在病理情況下Survivin卻表達(dá)于絕大多數(shù)的腫瘤組織。目前認(rèn)為Survivin促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制大概與其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移與侵襲有關(guān)[20]。近年來，很多研究證明Survivin在肺癌、胃癌組織中表達(dá)上調(diào)[21]。本研究結(jié)果表明NCI-H460細(xì)胞經(jīng)TUA處理后，Survivin在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)下降，且Survivin在其中的表達(dá)隨著TUA濃度的增加而減弱，推測是由于基因表達(dá)的調(diào)節(jié)功能受到抑制，不能幫助腫瘤細(xì)胞躲避凋亡關(guān)卡，同時阻斷了腫瘤細(xì)胞的異常增殖，加速腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步凋亡。Caspase-3是凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要效應(yīng)分子，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[22]。本研究結(jié)果也證實NCI-H460細(xì)胞經(jīng)TUA處理后Caspase-3表達(dá)水平增加。

本實驗制備了肺癌NCI-H460細(xì)胞裸鼠異種移植瘤模型，觀察TUA對裸鼠移植瘤的影響，為進(jìn)一步研究TUA抗肺癌作用及機制提供實驗依據(jù)。抑瘤實驗及HE染色研究結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度藥物處理后，TUA對NCI-H460裸鼠移植瘤具有一定抑制作用，與模型組比較，差異具有顯著性(P<0.01)，且抑瘤效果與臨床上常用的治療肺癌的藥物順鉑及NF-κB抑制劑PDTC的處理效果相當(dāng)。為了探討TUA對NCI-H460 裸鼠的抗腫瘤作用的機制，本實驗應(yīng)用免疫組化、Western blot技術(shù)，檢測了各實驗組中移植瘤與細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白p65、IκBα、Survivin、 Caspase-3的表達(dá)，結(jié)果也證實，p65蛋白表達(dá)水平下降，與此同時IκBα蛋白表達(dá)水平增加；與凋亡相關(guān)蛋白的Survivin蛋白表達(dá)受到抑制， Caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)。

綜上所述，本實驗采用體內(nèi)移植瘤實驗相證實了TUA對人類肺癌細(xì)胞株NCI-H460具有潛在的生長抑制作用，其可能的抗腫瘤作用的機制主要是抑制NF-κB信號通路及其調(diào)控的相關(guān)基因的表達(dá)從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。本實驗的研究結(jié)果可為進(jìn)一步開發(fā)TUA成為臨床抗肺癌藥物提供理論依據(jù)。

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Studies on the Proliferation Inhibition Effects of TUA from Actinidia chinensis Radix on Lung Cancer Xenografts in Nude Mice and its Preliminary Mechanism

GUOXiao-hua,HUHai-bo,JINQi,LIHong-liang,CHENGQi-lai

(SchoolofPharmacy,GannanMedicalUniversity,Ganzhou,Jiangxi341000)

Objective: To investigate inhibitory effect of TUA(2β, 3β, 23-trihydroxy-urs-12-en-28-oic acid) isolated from Actinidia chinensis Radix on the lung cancer xenografts in nude mice and explore its preliminary mechanism. Methods: NCI-H460 cells were implanted into nude mice and the transplantation tumor block from nude mice of more than 2 generations was inoculated to the right armpits of BALB/c mice with dissecting needle to establish lung cancer xenograft model. When the transplanted volume was about 50 mm3, the mice were randomly divided into 6 groups: (1)model group; (2) 10 mg·kg-1cisplatin group; (3) 10 mg·kg-1PDTC group; (4) TUA high dose group (30 mg·kg-1); (5) TUA middle dose group (12 mg·kg-1); (6) TUA low dose group (6 mg·kg-1). Administration approach was intratumoral injection. The effects of each group on the weight of transplanted tumor animal, the volume and weight of tumor were continuously observed for 14 days. Tumor volume growth curve was drawn and tumor inhibitory rate and index were calculated; HE staining was used to observe nude mice tumor tissue pathological changes; The effects of TUA on NF-κB signaling pathway related proteins were detected by immunohistochemistry and Western blot. Results: In vivo experiments showed that the transplanted tumors in nude mice became small compared with the models. With the increase of TUA dose, the tumor tissue became more and more small, especially in TUA high dose (30 mg·kg-1). It had the similar size with the NF-κB inhibitor PDTC (10 mg·kg-1) group. HE dyeing observation results confirmed the degree of tumor necrosis and fission in TUA treated tumor tissues obviously decreased. Immunohistochemical results showed that the TUA treatment group compared with model group, p65 expression in tumor tissues was reduced, and expression of IκB increased; Western blot results also showed that the NF-κB related p65 protein expression levels decreased, at the same time IκB protein expression level increased; the apoptosis related proteins Survivin protein expression was depressed, Caspase-3 protein expression was promoted. Conclusion: TUA Significantly inhibites the growth of lung transplantation tumor and its mechanism. It may be related to the decreasing the expression of p65, Survivin and increasing the expression of I B , Caspase-3 in tumor tissues.

2 , 3β, 23-trihydroxy-urs-12-en-28-oic acid;lung cancer; xenograft; Apoptosis-related proteins

國家自然科學(xué)基金資助項目(81360627)；江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目(GJJ14694)

程齊來，男，博士，副教授，從事中藥資源開發(fā)與利用研究。E-mail: cql_57@126.com

R285.5

A

1001-5779(2016)06-0839-08

10.3969/j.issn.1001-5779.2016.06.002

2016-06-29)(責(zé)任編輯：敖慧斌)