曹志敏，陳 玲

結(jié)核分枝桿菌吡嗪酰胺耐藥相關(guān)基因研究進(jìn)展

曹志敏，陳 玲

吡嗪酰胺是治療結(jié)核病的重要抗結(jié)核藥物之一，特別是用于耐多藥結(jié)核病的治療。近年來(lái)結(jié)核分枝桿菌對(duì)吡嗪酰胺的耐藥逐漸增多，其耐藥機(jī)制尚未明確。本文針對(duì)結(jié)核分枝桿菌吡嗪酰胺耐藥及其與基因變異之間的關(guān)系研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以供研究者參考。

結(jié)核分枝桿菌；吡嗪酰胺；基因變異；耐藥機(jī)制

吡嗪酰胺 (pyrazinamide，PZA)，又名異煙酰胺，為煙酰胺結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，具有獨(dú)特的滅菌活性，酸性條件下可殺滅處于半休眠期結(jié)核菌和持留菌，而其他抗結(jié)核藥物卻難以做到[1-2]。吡嗪酰胺抗結(jié)核療效顯著且與其他抗結(jié)核藥物聯(lián)用可縮短抗結(jié)核化療周期，故被世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)推薦用于藥物敏感的結(jié)核病及耐多藥結(jié)核病的治療[3-4]。近年來(lái)結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)對(duì)PZA耐藥逐漸增多，研究報(bào)道在所有結(jié)核病中其1耐藥率約為16.2% (95%CI11.2-21.2)[5]，且認(rèn)為其耐藥性的產(chǎn)生可能與細(xì)菌對(duì)利福平獲得性耐藥有關(guān)[6]。2016年全球結(jié)核病報(bào)告顯示在對(duì)利福平敏感的菌株中0.5%～4.2%的菌株對(duì)PZA耐藥，對(duì)利福平耐藥的菌株中36.7%～81.3%的菌株對(duì)PZA耐藥[4]，在具有耐多藥結(jié)核病(Multidrug resistance tuberculosis，MDR-TB，指結(jié)核分枝桿菌至少同時(shí)對(duì)異煙肼和利福平耐藥) 高風(fēng)險(xiǎn)的結(jié)核病患者中，結(jié)核分枝桿菌對(duì)PZA的耐藥率為41.3% (95%CI29.0-53.7)，在MDR結(jié)核分枝桿菌中PZA耐藥率達(dá)60.5% (95%CI52.3-68.6)，而在非MDR結(jié)核分枝桿菌臨床分離株中PZA耐藥率則為5%左右[5,7]。目前MTB對(duì)PZA耐藥的機(jī)制尚不完全清楚，隨著結(jié)核病疫情的加重及耐藥結(jié)核病出現(xiàn)及傳播，MTB對(duì)PZA的耐藥機(jī)制已備受關(guān)注。

目前多數(shù)研究認(rèn)為PZA耐藥主要與MTB的某些基因變異后引起細(xì)菌對(duì)吡嗪酰胺的處理能力降低及細(xì)菌物質(zhì)代謝改變等有關(guān)，如pncA、rpsA及PanD等基因。此外，也有文獻(xiàn)報(bào)道其他基因如脂肪酸合成酶I(FAS-I)基因、長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A連接酶D2編碼基因及嘧啶合成相關(guān)基因等變異也可能與MTB對(duì)PZA耐藥有關(guān)?，F(xiàn)將目前文獻(xiàn)已報(bào)道的可能與PZA耐藥產(chǎn)生有關(guān)的相關(guān)基因情況簡(jiǎn)述如下。

1 pncA基因

pncA基因全長(zhǎng)為561 bp，僅編碼186個(gè)氨基酸，但其突變位點(diǎn)繁多、復(fù)雜。目前大多數(shù)研究認(rèn)為MTB對(duì)PZA耐藥主要與細(xì)菌pncA基因變異有關(guān)[8]，早前有文獻(xiàn)報(bào)道PZA表型耐藥與pncA基因變異的相關(guān)性約達(dá)85%左右[3]。PZA與其他抗結(jié)核藥物不同，必須在酸性環(huán)境中才能發(fā)揮強(qiáng)的抗菌活性，且其活性隨細(xì)胞內(nèi)pH值的降低而增強(qiáng)。PZA通過(guò)被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的方式進(jìn)入MTB細(xì)胞內(nèi)，被細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)吡嗪酰胺酶(pyrazinamidase，PZase，由MTB的pncA基因編碼)水解活化成其活性形式吡嗪酸(pyrazinoic acid，POA)并在細(xì)胞內(nèi)蓄積，從而發(fā)揮強(qiáng)的抗結(jié)核作用[1,9]。pncA基因二級(jí)結(jié)構(gòu)上有明確的PZase活性中心和金屬離子結(jié)合位點(diǎn)，以其為基礎(chǔ)將該基因分為3個(gè)部分，包括4個(gè)α區(qū)(α1-α4)、6個(gè)β區(qū)(β1-β6)及10個(gè)L區(qū)(L1-L10),其中PZase活性中心主要分布在L2、L7區(qū)域，L4為金屬離子結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域，兩者均為對(duì)酶活性影響較大的區(qū)域且基因突變發(fā)生率較高，靠近這些位點(diǎn)的基因突變對(duì)酶活性的影響較具遠(yuǎn)離這些區(qū)域位點(diǎn)的突變大[10]。目前為止，研究報(bào)道pncA基因突變類(lèi)型已達(dá)270多種，在72%～97%的吡嗪酰胺耐藥菌株中，其突變位置散在分布于基因上游調(diào)控序列及下游序列的多個(gè)位置，但在整個(gè)pncA全基因中尚未發(fā)現(xiàn)與耐藥密切相關(guān)的特定的“熱點(diǎn)區(qū)域”[1,9,11]。

吡嗪酰胺酶由MTB的pncA基因編碼，當(dāng)結(jié)核分枝桿菌pncA基因變異后，可引起吡嗪酰胺酶蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定和活性改變，從而喪失了將PZA有效轉(zhuǎn)化為POA的能力，引起MTB對(duì)PZA耐藥，研究發(fā)現(xiàn)對(duì)PZA耐藥的MTB菌株其吡嗪酰胺酶活性常常降低或喪失，這可能是MTB對(duì)PZA耐藥最主要的分子機(jī)制[9,12]。pncA基因突變形式以單核苷酸多態(tài)性(堿基置換)為主，也包括少數(shù)堿基缺失或堿基插入引起的移碼或整碼突變[9]。結(jié)核分枝桿菌PZA耐藥相關(guān)因素的多中心研究中，對(duì)pncA基因突變位點(diǎn)與PZA耐藥的關(guān)系進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，將其分為高度與PZA耐藥相關(guān)、與PZA耐藥相關(guān)性不清楚及與PZA耐藥無(wú)明顯相關(guān)性等3類(lèi)，發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)域的突變A-11G(C)、T-7G及pncA基因編碼區(qū)中T2C、T17C、G19T、A29C、C102A、T104C、A146C、A152G、C174G、T192G、C211T、A226C、A286G(C)、T307G、C309G、C312A、G373T、390+G(G)、A403C、T416G、G463A、T490C、A523G等位點(diǎn)與結(jié)核分枝桿菌對(duì)PZA耐藥相關(guān)具有高度相關(guān)，其中以啟動(dòng)子區(qū)域A-11G最常見(jiàn)，并認(rèn)為該位點(diǎn)的突變可能與影響細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成和細(xì)胞核糖體對(duì)mRNA的結(jié)合等過(guò)程有關(guān)，而A188C、A460G等位點(diǎn)的變異是否與結(jié)核分枝桿菌PZA耐藥有關(guān)尚不清楚[13-15]；A146C位點(diǎn)的突變則與PZA耐藥無(wú)明顯相關(guān)性[16]。近年來(lái)有研究在高水平PZA耐藥(MIC>500 mg/L)的MTB臨床分離株中檢測(cè)到pncA基因變異主要集中在51-76、130-142及163-180三個(gè)編碼區(qū)，而在94-97、11-16兩個(gè)區(qū)域內(nèi)也有相關(guān)MTB菌株呈低水平PZA耐藥(MIC≤500 mg/L)[11]。盡管多數(shù)研究認(rèn)為pncA基因變異是MTB對(duì)PZA耐藥的主要原因，但并不是所有PZA耐藥菌株都會(huì)發(fā)生pncA基因突變。研究發(fā)現(xiàn)3%～28%的PZA耐藥菌株卻無(wú)該基因變異，且有些發(fā)生突變的菌株仍可檢測(cè)到PZase活性，提示可能該突變不能或不足以使PZase活性改變，也有研究在對(duì)PZA敏感MTB菌株中檢測(cè)到pncA基因變異[1-2]。此外，因吡嗪酰胺發(fā)揮抗結(jié)核活性對(duì)酸性條件實(shí)驗(yàn)要求使得藥物敏感試驗(yàn)困難，可能出現(xiàn)假陽(yáng)性耐藥或者假陰性敏感等，亦可能還存在其他的耐藥機(jī)制。

2 rpsA基因

rpsA基因全長(zhǎng)1 446 bp，編碼長(zhǎng)為481個(gè)氨基酸的30S核糖體蛋白質(zhì)S1(RpsA)，研究認(rèn)為該蛋白是POA的新型作用靶點(diǎn)，可能與MTB對(duì)其耐藥性產(chǎn)生有關(guān)。有研究在PZA低水平耐藥的MTB臨床分離株DHM444中檢測(cè)到在rpsA基因靠近C端的438位點(diǎn)存在3個(gè)堿基GCC的缺失(編碼丙氨酸)，而該菌株卻未發(fā)現(xiàn)pncA基因變異[17]。RpsA在細(xì)菌的“蛋白質(zhì)翻譯”過(guò)程中起重要作用，POA通過(guò)與有活性的RpsA結(jié)合來(lái)干擾MTB的“反式翻譯”過(guò)程，從而影響細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，發(fā)揮滅菌作用，且rpsA基因的表達(dá)水平與MTB生長(zhǎng)速率、停止細(xì)菌生長(zhǎng)的重要條件及下調(diào)細(xì)菌RpsA蛋白表達(dá)量等有關(guān)，當(dāng)rpsA基因過(guò)表達(dá)時(shí)，細(xì)菌轉(zhuǎn)化的POA不能與RpsA有效結(jié)合，影響MTB蛋白質(zhì)的合成而對(duì)其產(chǎn)生耐藥，這也有助于解釋了為什么MTB處于饑餓狀態(tài)、酸性pH、缺氧及能量抑制等情況時(shí)可以增強(qiáng)PZA的活性[17]。有學(xué)者通過(guò)對(duì)比PZA耐藥菌株和敏感菌株的rpsA基因突變率時(shí)發(fā)現(xiàn)在3株耐藥菌株中發(fā)現(xiàn)3′羧基末端出現(xiàn)單位點(diǎn)突變，分別為R474L、R474W和E433D，在1株敏感菌株也出現(xiàn)Q162R單位點(diǎn)突變，比較耐藥菌株和敏感菌株的rpsA基因突變率時(shí)發(fā)現(xiàn)兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，認(rèn)為可能與實(shí)驗(yàn)菌株樣本量較小有關(guān)，rpsA的低突變率提示其可能不是PZA耐藥的常見(jiàn)機(jī)制。雖有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道rpsA基因靠近C端438位點(diǎn)丙氨酸的缺失可影響POA與RpsA的結(jié)合[17]，但該基因中是否存在與PZA耐藥相關(guān)的特定突變位點(diǎn)及突變類(lèi)型目前相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道很少。近年來(lái)也有研究認(rèn)為rpsA基因突變可能與PZA耐藥無(wú)關(guān)[12,16]，關(guān)于rpsA基因與PZA耐藥的關(guān)系，還期待更多的研究。

3 panD基因

結(jié)核分枝桿菌panD基因全長(zhǎng)420 bp，編碼天冬氨酸脫羧酶(139個(gè)氨基酸)，該酶與泛酸鹽和輔酶A合成所必需的β-丙氨酸合成有關(guān)，而泛酸鹽和輔酶A對(duì)維持MTB生存具有重要作用，研究認(rèn)為POA可能通過(guò)抑制泛酸鹽和輔酶A合成來(lái)干擾細(xì)菌多方面的新陳代謝功能，如能量代謝及脂肪酸的生物合成等，從而發(fā)揮抗菌作用，但具體機(jī)制仍待進(jìn)一步研究[18-19]。有研究通過(guò)對(duì)無(wú)pncA基因和rpsA基因變異的PZA耐藥菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)存在panD基因突變，此外，也有研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)誘導(dǎo)MTB的panD基因過(guò)表達(dá)可提高細(xì)菌對(duì)POA抵抗性，并發(fā)現(xiàn)β-丙氨酸和泛酸鹽也具有拮抗POA的抗結(jié)核活性，這些發(fā)現(xiàn)都提示了panD基因突變可能與MTB對(duì)PZA耐藥有關(guān)[12,19-20]。近來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)在panD基因非活性位點(diǎn)H21R、I49V的突變導(dǎo)致了MTB對(duì)PZA耐藥[21]，但目前panD基因突變與MTB對(duì)PZA耐藥的具體關(guān)系及其作用機(jī)制仍尚未確切闡明，還需進(jìn)一步研究。

4 FASI基因與fadD2基因

脂肪酸代謝在MTB的生存中占有重要地位，有研究報(bào)道靶向抑制MTB脂肪酸代謝相關(guān)功能，有明顯改善PZA抗結(jié)核活性的潛力[22]。脂肪酸合成酶I(fattyacidsynthase, FAS)由脂肪酸合成酶I基因編碼，在細(xì)菌脂肪酸合成代謝中其重要作用，POA可能通過(guò)抑制FASI活性而擾亂細(xì)胞膜電位及干擾細(xì)胞能量代謝，從而發(fā)揮對(duì)MTB較弱的殺滅能力[23]。但有研究表明FASI的活性可被POA一系列的類(lèi)似物，如5-氯-吡嗪酰胺等抑制，而不能直接被POA抑制，提示該酶可能不是POA直接的藥物靶標(biāo)或者并不是其真正的靶標(biāo)[24-25]。目前關(guān)于FASI基因突變與PZA耐藥性關(guān)系相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少，還待更深入的研究。

fadD2基因全長(zhǎng)1 683 bp，為長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A連接酶D2(Long-Chain Fatty Acyl-CoA Ligase D2，F(xiàn)adD2 )的編碼基因，有研究報(bào)道FadD2與MTB對(duì)PZA或POA的固有耐藥有關(guān)，并發(fā)現(xiàn)在pH為中性的培養(yǎng)條件下，相對(duì)于對(duì)PZA高度耐藥的野生型MTB，F(xiàn)adD2喪失功能的MTB突變體卻對(duì)PZA敏感，提示可能與FadD2喪失功能后促進(jìn)了MTB對(duì)PZA或POA敏感性升高有關(guān)。目前文獻(xiàn)報(bào)道FadD2在細(xì)菌輔酶A和脂質(zhì)代謝起核心作用，但在PZA固有耐藥產(chǎn)生中的確切機(jī)制仍尚不清楚[22]。

盡管PZA耐藥與MTB基因突變密切相關(guān)，但在PZA耐藥的MTB臨床分離株中，尚有部分菌株并未發(fā)現(xiàn)上述基因的變異，對(duì)于這部分菌株可能存在其他基因變異或其他耐藥機(jī)制[18], 如藥物外排泵機(jī)制、PZA攝取障礙機(jī)制及其他原因引起的耐藥等。

5 展 望

目前對(duì)PZA作用機(jī)制及其耐藥機(jī)制研究已取得一定的進(jìn)展，但仍缺乏全面深入的了解，還需不斷的探索和研究。大多數(shù)研究認(rèn)為基因突變是MTB對(duì)PZA耐藥的主要分子機(jī)制，其中pncA基因突變引起PZA耐藥觀念已達(dá)成共識(shí)，但具體的作用及耐藥機(jī)制仍需更深入的研究；rpsA基因突變與PZA耐藥性的產(chǎn)生有關(guān)的觀點(diǎn)受到了質(zhì)疑，待進(jìn)一步研究證實(shí)；panD基因突變與耐PZA結(jié)核病有關(guān)，但其具體的關(guān)系及與PZA相互作用機(jī)制仍缺乏充分的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐，需更廣泛深入的研究；其他基因如FASI基因、fadD2基因及嘧啶合成相關(guān)的基因等相關(guān)研究較少，對(duì)其認(rèn)識(shí)尚處于初步探索階段。此外，研究提示MTB對(duì)PZA耐藥還存在其他機(jī)制，如藥物外排泵機(jī)制、PZA攝取障礙機(jī)制、其他未知基因變異及尚未發(fā)現(xiàn)的耐藥機(jī)制等。目前耐藥結(jié)核病的出現(xiàn)及傳播已引起廣泛關(guān)注，相關(guān)研究也陸續(xù)開(kāi)展，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步及創(chuàng)新，相信吡嗪酰胺的作用及耐藥機(jī)制將會(huì)被闡明，同時(shí)也將會(huì)出現(xiàn)更安全、準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的耐藥性檢測(cè)技術(shù)，為結(jié)核病及耐藥結(jié)核病的診斷提供更科學(xué)有力的支撐。

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ResearchprogressofassociationbetweengenemutationandpyrazinamideresistanceinMycobacteriumtuberculosis

CAO Zhi-min, CHEN Ling

(DepartmentofRespiratoryMedicine,TheAffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi563003,China)

Pyrazinamide (PZA) is an important anti-tuberculosis drug especially for treating multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB). In recent years, the incidence ofMycobacteriumtuberculosis’ resistance to pyrazinamide has increased. At present, the mechanism of drug resistance has not been clearly elucidated. In this review, the association between gene mutation and pyrazinamide resistance inMycobacteriumtuberculosiswill be summarized.

Mycobacteriumtuberculosis; pyrazinamide; gene mutation; drug resistance mechanism

Chen Ling, Email: lingjuncd@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.10.015

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81360002)資助

陳 玲,Email：lingjuncd@163.com

遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸二科，遵義 563000

R378

A

1002-2694(2017)10-0923-04

Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81360002)

2017-02-15編輯李友松