刁巧虹，卞國志，王 娟，羅藹劍，張 瑩，高瀟祎，袁建豐，孫凌霜

（1.廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司，廣州 511400；2.廣東海大集團(tuán)股份有限公司，廣州 511400；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642）

·綜述·

奶牛乳房炎病原檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

刁巧虹1,3，卞國志2,3，王 娟1,2，羅藹劍3，張 瑩3，高瀟祎3，袁建豐1,2，孫凌霜3

（1.廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司，廣州 511400；2.廣東海大集團(tuán)股份有限公司，廣州 511400；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642）

奶牛乳房炎是危害奶牛業(yè)最重要的疾病之一，不僅給奶牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且其某些病原體可引起人類感染。引起奶牛乳房炎的病原多達(dá)150種，及時(shí)、準(zhǔn)確的診斷乳房炎并檢測(cè)出致病菌，對(duì)奶牛乳房炎的綜合防治有著重要意義。目前，檢測(cè)乳房炎病原的方法主要有細(xì)菌分離鑒定法、免疫學(xué)檢測(cè)法、基因芯片和PCR檢測(cè)技術(shù)等。本文就奶牛乳房炎病原檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行系統(tǒng)闡述，旨在為奶牛乳房炎的綜合防治提供參考。

乳房炎；病原；檢測(cè)技術(shù)；奶牛

奶牛乳房炎是危害奶牛業(yè)最重要的疾病之一，不僅能引起產(chǎn)奶量及其品質(zhì)下降，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，而且患病奶牛所產(chǎn)牛奶中的某些病原體可引起人類感染。中國大部分地區(qū)奶牛乳房炎的檢出率在50%以上，而引起奶牛乳房炎的病原有細(xì)菌、病毒、真菌、支原體和綠藻等150多種。調(diào)查顯示最常見的致病菌有金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌和酵母菌等[1-3]。根據(jù)臨床表現(xiàn)可將奶牛乳房炎分為隱性型乳房炎和臨床型乳房炎。常用的診斷方法有體細(xì)胞直接計(jì)數(shù)法、CMT檢測(cè)法、黏度測(cè)試法、DNA含量測(cè)定法、ATP生物發(fā)光法技術(shù)、乳汁電導(dǎo)率的測(cè)定、乳汁pH值測(cè)定、乳成分直接檢測(cè)和MTT檢測(cè)法等，但是這些診斷方法都不能直接檢測(cè)出病原體的類型，難以對(duì)乳房炎的治療和預(yù)防提供及時(shí)確切的參考。目前能檢測(cè)乳房炎病原的方法主要有細(xì)菌分離鑒定法、免疫學(xué)檢測(cè)法、基因芯片和PCR檢測(cè)技術(shù)等。

1 乳汁中致病菌分離鑒定法

乳汁中致病菌的分離鑒定是傳統(tǒng)的奶牛乳房炎的診斷方法，主要包括無菌采集待檢乳樣，使用分離培養(yǎng)基和生化培養(yǎng)基進(jìn)行分離鑒定，涂片染色、鏡檢和藥敏試驗(yàn)等。細(xì)菌分離鑒定能夠詳細(xì)分析感染乳房炎的病原菌種類，確診不同類型的乳房炎，但該法耗時(shí)長，成本較高。

2 免疫學(xué)檢測(cè)法

根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的反應(yīng)特性，免疫學(xué)檢測(cè)法可用于特異性檢測(cè)乳汁中的病原，如檢測(cè)鏈球菌的乳膠凝集法[4]、免疫層析法[5]。免疫學(xué)檢測(cè)法具有較好的特異性和靈敏度，操作簡便，反應(yīng)快，但易受環(huán)境及溶質(zhì)的影響。

3 基因芯片技術(shù)

基因芯片由大量的DNA探針構(gòu)成，可對(duì)多種病原微生物進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，縮短了乳房炎診斷的時(shí)間。李秀萍等[6]建立的以16S rRNA為基礎(chǔ)的基因芯片技術(shù)，6～7 h即可檢測(cè)出金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌、綠膿桿菌、停乳鏈球菌和乳房鏈球菌6種牛乳房炎致病菌。邢會(huì)杰等[7]同樣以16S rRNA為靶基因構(gòu)建了檢測(cè)無乳鏈球菌、肺炎克雷伯氏菌、奇異變形桿菌和金黃色葡萄球菌的基因芯片方法，可以快速、特異、準(zhǔn)確地對(duì)這4種菌株進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。Lee等[8]開發(fā)了可以檢測(cè)棒狀桿菌、牛支原體、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、牛鏈球菌、停乳鏈球菌和乳房鏈球菌7種病原體的基因芯片。基因芯片技術(shù)具有方便、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，但是因其成本昂貴，且耗時(shí)相對(duì)較長，現(xiàn)階段難以投入臨床中使用。

4 多聚酶鏈?zhǔn)剑≒olymerase chain reaction，PCR）診斷法

4.1 普通PCR診斷法 自1985年P(guān)CR技術(shù)發(fā)明以來，憑借其快速、特異性強(qiáng)、敏感性高的特點(diǎn)，PCR檢測(cè)法已被廣泛運(yùn)用于奶牛乳房炎病原微生物檢測(cè)。國內(nèi)外現(xiàn)已構(gòu)建了針對(duì)乳房炎主要致病菌的多種PCR檢測(cè)體系。Meiri-Bendek等[9]根據(jù)16S rRNA基因設(shè)計(jì)引物建立了無乳鏈球菌PCR檢測(cè)體系。陳玉霞等[10]根據(jù)16-23S rRNA之間的序列設(shè)計(jì)引物，建立了快速、特異的金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和停乳鏈球菌PCR檢測(cè)體系。李棟梁等[11]據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌、乳酸乳球菌、變形桿菌、綠膿桿菌和腸球菌的16S rRNA分別設(shè)計(jì)了5對(duì)引物，進(jìn)行PCR檢測(cè)，具有靈敏、高效的特點(diǎn)。普通PCR技術(shù)價(jià)格低廉，有著優(yōu)良的特異性和靈敏度，但是檢測(cè)病原單一。

4.2 多重PCR診斷法 引起奶牛乳房炎的病原菌種類多，且多呈混合感染，目前已有針對(duì)乳房炎主要致病菌構(gòu)建的多重PCR診斷體系。高玉梅等[12]根據(jù)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌和停乳鏈球菌16S-23S rRNA區(qū)域以及白色念珠菌18S rRNA序列設(shè)計(jì)了5對(duì)特異性引物，建立了有較好特異性的五重PCR技術(shù)。許信剛等[13]根據(jù)鏈球菌ef-tu基因、金黃色葡萄球菌nuc基因、沙門氏菌hut基因和大腸桿菌23S rRNA基因序列，設(shè)計(jì)4對(duì)引物，構(gòu)建了四重PCR體系。陳亞明等[14]根據(jù)無乳鏈球菌sip基因、金黃色葡萄球菌nuc基因、大腸桿菌rrnB基因和蠟樣芽孢桿菌hblA基因構(gòu)建四重PCR體系。Shome[15]對(duì)10種牛乳房炎的致病菌建立了多重PCR檢測(cè)體系。多重PCR體系可一次檢測(cè)多種病原，相對(duì)于普通PCR，雖其靈敏度有所下降，但其方便、省時(shí)、廉價(jià)的特點(diǎn)使其應(yīng)用前景廣闊。

4.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR診斷法 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR）是利用熒光信號(hào)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR擴(kuò)增過程，通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線來對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。劉繼超等[16]根據(jù)金黃色葡萄球菌腸毒素A基因序列，設(shè)計(jì)引物和Taqman探針，建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系，其靈敏度達(dá)到1.3×102CFU/mL。Koskinen等[17]對(duì)鏈球菌、大腸桿菌和葡萄球菌等11個(gè)常見的病原進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，均具有很好的特異性和靈敏度。Singh等[18]構(gòu)建了檢測(cè)李斯特菌和沙門氏菌的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系。實(shí)時(shí)熒光定量PCR與普通PCR相比，靈敏度得到了一定的提升，且能定量檢測(cè)出乳房炎樣品中病原體數(shù)，可在一定程度上對(duì)乳房炎病程發(fā)展進(jìn)行判斷。

4.4 可視化介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loopmediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)是根據(jù)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條引物，使用鏈置換DNA聚合酶，在恒溫的條件下擴(kuò)增出LAMP特征性梯狀條帶[19]。LAMP在乳房炎的檢測(cè)上發(fā)展迅速，賀婷等[20]根據(jù)鏈球菌屬的特異性基因（tuf）設(shè)計(jì)一套LAMP引物，在水浴鍋中1 h內(nèi)完成反應(yīng)，其敏感性最高達(dá)到52 fg/μL。白智迪[21]根據(jù)牛支原體uvrC基因設(shè)計(jì)引物，在58℃下作用1 h，敏感度為3.4×101CFU/μL，特異性強(qiáng)。LAMP檢測(cè)法能快速得到肉眼可見的檢測(cè)結(jié)果，敏感性好，特異性強(qiáng)，操作簡便，為乳房炎檢測(cè)提供一個(gè)新的發(fā)展平臺(tái)。

5 結(jié)語

奶牛乳房炎是危害奶牛業(yè)最常見的疾病之一，影響牛奶的產(chǎn)量和質(zhì)量。目前乳房炎病原菌的檢測(cè)方法中，細(xì)菌的分離鑒定是傳統(tǒng)的確診病原菌類型的方法，存在耗時(shí)長的缺點(diǎn)。基因芯片技術(shù)能同時(shí)檢測(cè)出大量病原，但耗時(shí)仍比較長，且成本昂貴，難以普及。PCR方法能夠準(zhǔn)確鑒定致病菌，并且縮短了鑒定的時(shí)間，成本較低。多重PCR敏感性與普通PCR相比有所下降，但是可一次檢測(cè)多種病原，縮減了檢測(cè)時(shí)間和成本。實(shí)時(shí)熒光定量PCR能進(jìn)行定性定量檢測(cè)，學(xué)者們將其與傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定方法做比較，證明了該法有良好的靈敏度和特異性[22]。LAMP法能夠在1 h內(nèi)得出肉眼可見的結(jié)果，極大的縮短了檢測(cè)的時(shí)間，今后將會(huì)更廣泛的運(yùn)用于乳房炎的檢測(cè)。隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，相信未來可以研制出快速、靈敏性高、特異性強(qiáng)、操作便捷且廉價(jià)的早期奶牛乳房炎檢測(cè)方法。

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RESEARCH PROGRESS ON DETECTION OF DAIRY COW MASTITIS PATHOGENS

DIAO Qiao-hong1,3, BIAN Guo-zhi2,3, WANG Juan1,2, LUO Ai-jian3, ZHANG Ying3, GAO Xiao-yi3,YUAN Jian-feng1,2, SUN Ling-shuang3

(1.Guangdong Haid Institute of Animal Husbandry & Veterinary, Guangzhou 511400, China; 2. Guangdong Haid Group Co., Limited,Guangzhou 511400, China; 3.College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

Mastitis is one of the most important diseases that cause signi fi cant economic loss in dairy industry. Some mastitis pathogens have importance of public health. There are more than 150 species pathogens that can cause mastitis. Attempts to diagnose and detect these pathogens timely and accurately have been of signi fi cance in comprehensive prevention of dairy mastitis. Currently, major methods for detection of mastitis include isolation and identification of pathogens, immunological assays, gene chip and PCR. This summary provides the systemic illustration on detection methods and measures for integrated control of mastitis in dairy cows.

Mastitis; pathogen; detection method; dairy cow

S852.4

A

1674-6422（2017）04-0076-04

2016-07-14

廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（201510010250）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014A020208052）；廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司自主項(xiàng)目

刁巧虹，女，碩士研究生，臨床獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

袁建豐，E-mail：yuanjf@haid.com.cn；孫凌霜，E-mail：lsun42013@scau.edu.cn