魯大鵬 葉園園 王保龍

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院檢驗科，合肥230000)

嵌合抗原受體修飾T細胞在腫瘤免疫治療中的策略①

魯大鵬 葉園園 王保龍

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院檢驗科，合肥230000)

手術(shù)、化療和放療是治療腫瘤的傳統(tǒng)方法，但大部分情況下患者都不能獲得理想的療效。近年來，嵌合抗原受體修飾 T 細胞通過基因工程，賦予 T 細胞腫瘤靶向性、更強的殺傷活性和持久的生命力，并取得較好的臨床療效。然而，脫靶效應(yīng) 、細胞因子風暴等毒性效應(yīng)卻極大地限制了CAR-T細胞技術(shù)的應(yīng)用。本文就提高CAR-T細胞在治療惡性腫瘤臨床療效方面進行如下綜述。

1 CAR-T細胞的基本結(jié)構(gòu)和發(fā)展歷程

嵌合抗原受體(Chimeric antigen receptor,CAR)修飾T細胞是指基因修飾的人工改造體，被重新輸入患者體內(nèi)后提高效應(yīng)T細胞識別腫瘤相關(guān)抗原(Tumour-associated antigen,TAA)的能力。CARs結(jié)構(gòu)是由胞外抗原結(jié)合域(通常來自單鏈抗體可變區(qū)基因片段,single chain variable fragment,scFv)、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū) (包括CD3-ζ鏈或FcεRIγ、共刺激分子信號域受體)構(gòu)成。

1987 年，Kuwana等[1]首次提出CAR的概念并構(gòu)建了可特異性識別腫瘤相關(guān)抗原的CAR-T細胞原型。第一代CAR信號域是CD3-ζ信號鏈，它能有效地促進T細胞活化和增強T細胞的細胞毒性[2]，但由于腫瘤細胞表面缺乏共刺激分子(第二信號)，CAR-T細胞不能持續(xù)性增殖，臨床療效有限。第二代CAR 信號域增加了1個共刺激分子如CD28，當CAR-T細胞識別腫瘤抗原后，胞內(nèi)信號域和共刺激分子共同活化，促進IL-2合成，使T細胞的增殖、細胞毒性和持續(xù)性抗腫瘤能力等方面都有所提高[3]。為了進一步提高CAR-T細胞的免疫學(xué)效應(yīng)，第三代CAR 信號域增加了2個共刺激分子，但實際臨床試驗中其效果是否更好尚未有確切的資料證明。第四代CAR(T cells redirected for universal cytokine killing,TRUCKs)是在第三代CAR的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，增加了一個或多個能夠編碼CAR及其啟動子的載體。從而使得轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的細胞因子能夠結(jié)合免疫其他組件，促進機體固有免疫細胞殺傷不能被CAR識別的腫瘤細胞[4]。

2 影響CAR-T細胞免疫療效的因素

2.1靶抗原的選擇 “理想靶抗原”是指：①特異性在腫瘤細胞中表達而不存在正常組織中，主要是由于腫瘤細胞突變所致，是最理想的靶抗原。例如表皮生長因子受體Ⅲ突變型(EGFRvⅢ)是膠質(zhì)母細胞瘤細胞突變的結(jié)果，在正常組織中沒有發(fā)現(xiàn)[5]。②過表達于腫瘤組織而低表達于正常組織。腫瘤特異性靶抗原是極少的，因此我們需要根據(jù)靶抗原在正常組織和腫瘤組織中的不同表達水平和密度，平衡靶抗原和CAR-T細胞療法毒性效應(yīng)的利弊，選出最理想的 TAA，作為CAR-T細胞免疫治療中的主要靶抗原。比如CD19是B細胞成熟過程的表面抗原，在大多數(shù)的B細胞惡性腫瘤表面都能表達，常用于淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病等[6,7]。

2.2效應(yīng)T細胞的選擇 效應(yīng)T細胞是CAR表達生物學(xué)活性的主要加工廠，對CAR的抗腫瘤效應(yīng)和持續(xù)時間至關(guān)重要，體外擴增前，對潛在的最理想的 T 細胞亞群進行精確檢測和分離可提高CAR-T細胞免疫療法的效果。在體外，效應(yīng)記憶 T 細胞(Effector memory T cell,TEM)的細胞毒活性和增殖能力要優(yōu)于中樞記憶 T 細胞 (Central memory T cell,TCM)，但在體內(nèi)TCM不僅具有形成免疫記憶的潛能，還有更持久的抗腫瘤活性[8]。干細胞樣記憶 T 細胞(Stem cell memory T cell,TSCM)具有持久的自我更新特性，因此TSCM具有高增殖和持續(xù)性存在的潛能。高表達CD62L、CD95和CCR-7的CD45RA+T細胞亞群中TSCM比TCM具有更有效的抗腫瘤活性和更久的存在時間[9]。

2.3共刺激分子的選擇 CAR胞內(nèi)信號區(qū)的共刺激分子在調(diào)節(jié)T細胞擴增、存在時間以及抗腫瘤效應(yīng)等方面發(fā)揮著重要的作用，但不同的共刺激分子的生物學(xué)活性有所差別。常見的共刺激分子有CD28、腫瘤壞死因子超家族成員9 (4-1BB)、腫瘤壞死因子超家族成員4(OX40)、可誘導(dǎo)共刺激分子(ICOS)和CD27，其中CD28和4-1BB都能有效地促進IL-2和IFN-γ的分泌。研究表明4-1BB共刺激分子比CD28共刺激分子更適合CAR胞內(nèi)信號區(qū)的構(gòu)建[10]，因為4-1BB能有效地促進記憶T細胞的擴增和減少持續(xù)性CAR-T信號的耗盡，并且4-1BB信號似乎是CD8+記憶T細胞持續(xù)性存在的必需信號，而CD28促進初始T細胞擴增。一些研究卻顯示CD28和4-1BB的擴增和抗腫瘤效應(yīng)沒有明顯的區(qū)別[11]。Hombach等[12]證明了CD28-CART細胞比CD28-OX40-CART細胞更有效，因為CD28-OX40共刺激分子可促進活化誘導(dǎo)細胞死亡(Activation-induced cell death,AICD)和減少抗腫瘤功能。某些研究卻顯示含有兩個共刺激分子(如CD28和4-1BB)的CAR-T細胞比僅有單一共刺激分子的CAR-T細胞更有效地改善T細胞的存在時間和細胞毒性[11]。以上研究表明共刺激分子極大地影響CAR-T細胞療法的效果，但最理想共刺激分子的種類和數(shù)量仍未確定，還需在體外和體內(nèi)進一步的研究。

2.4腫瘤微環(huán)境的改變 腫瘤微環(huán)境的改變是實體瘤CAR-T細胞免疫治療中最難克服的障礙，改變的腫瘤微環(huán)境通過多種調(diào)控機制抑制效應(yīng)T細胞的浸潤、激活和抗腫瘤功能，即使相當數(shù)量級的效應(yīng) T 細胞到達病灶，也無法發(fā)揮有效的殺傷作用。腫瘤微環(huán)境中的“免疫調(diào)節(jié)抑制劑”如程序性細胞死亡蛋白1(PD-1)，通過與腫瘤細胞或基質(zhì)細胞表面的PD-L1和PD-L2配體相互作用而降低效應(yīng)T細胞的抗腫瘤活性[13]。調(diào)節(jié)性 T 細胞(Tregs) 和骨髓抑制細胞(MDSCs)在腫瘤微環(huán)境中起抑制作用，并且腫瘤細胞分泌的CCL22和CCL2細胞因子可分別誘導(dǎo)CCR4+Tregs 細胞[14]和CCR2+MDSCs[15]細胞聚集在腫瘤部位，最終使機體處于免疫耐受狀態(tài)而降低效應(yīng)T細胞的抗腫瘤作用。同時，腫瘤細胞分泌的轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)和IL-10也具有免疫抑制作用[16,17]，TGF-β可通過抑制CD8+效應(yīng)T細胞和促進CD4+輔助T細胞轉(zhuǎn)變?yōu)?Tregs細胞發(fā)揮免疫抑制作用。

3 增強CAR-T細胞免疫療效的策略

3.1宿主淋巴細胞預(yù)清除 預(yù)處理中宿主淋巴細胞清除是CAR-T細胞治療中必須進行的過程，直接影響最終的臨床療效，其作用機制為：①通過化療(藥物主要包括環(huán)磷酰胺、噴司他丁和苯達莫司汀)和/或靶向單克隆抗體(如利妥昔單抗)減少免疫抑制性T細胞數(shù)量(如Tregs細胞)，從而為體外輸入的CAR-T細胞提供合適的體內(nèi)微環(huán)境。②通過減少淋巴細胞對活化因子的影響，增加活化因子(如IL-7、IL-15)的累積，從而促進CAR-T細胞的增殖[18]。

3.2自殺基因 自殺基因是一種人工調(diào)控的“安全開關(guān)”，可特異性識別刪除體內(nèi)多余的CAR-T細胞。自殺基因是通過藥物誘導(dǎo)激活而清除CAR-T細胞，如單純皰疹病毒胸苷激酶 (Herpes simplex virus thymidine kinase,HSV-TK)基因、誘導(dǎo)凋亡相關(guān)基因caspase-9(iCaspase-9)和EGFRΔ基因。HSV-TK 的免疫原性較高，iCaspase-9和EGFRΔ基因是人源性蛋白，免疫原性低。自殺基因系統(tǒng)在臨床試驗中已成功去除CAR-T細胞，其中治療效果最好的是他克莫司結(jié)合蛋白-12(FK506 binding protein-12,FKBP-12)與iCaspase-9結(jié)合形成的融合蛋白，這種融合蛋白被小分子二聚AP1903激活后，可導(dǎo)致T細胞的快速凋亡和清除[19]，同時FKBP-12 是一種誘導(dǎo)效率高 、特異性強的安全開關(guān)，故與iCaspase-9的結(jié)合治療受到廣泛使用。然而，自殺基因系統(tǒng)需要一段時間才能被激活，所以這些安全開關(guān)一般用于慢性毒性反應(yīng)的治療。

3.3階梯式劑量方案 目前CAR-T細胞有效起始劑量的確定尚沒有明確的指導(dǎo)方針，研究者多采用階梯式劑量方案，它是指CAR-T細胞起始劑量由少至多，且不斷監(jiān)測患者的毒性效應(yīng)，當可能出現(xiàn)嚴重毒性效應(yīng)時立即停止。第二代和三代CAR-T細胞起始劑量應(yīng)比第一代少，且給予淋巴細胞預(yù)清除的患者的CAR-T細胞起始劑量也比未經(jīng)任何預(yù)處理的患者少。Morgan[20]小組和Ahmed[21]小組都用了HER2-CART進行過繼性免疫治療，最終Ahmed研究小組獲得了更好的臨床療效和輕微的毒性效應(yīng)，其中一個重要的原因是他們采取了階梯式劑量方案，起始劑量 (1×104)CAR-T細胞/m2，逐級升高至(1 × 108)CAR-T細胞/m2，但Morgan小組直接單一高劑量(7.9 × 109) CAR-T細胞/m2。

3.4雙特異性CAR-T細胞的治療 雙特異性CAR可分為三類：①簡單雙特異性CAR，指兩種特異性的CAR共同修飾T細胞。例如，只有當效應(yīng)T細胞同時表達針對前列腺癌的兩種特異性靶抗原，前列腺特異性膜抗原(Prostate specific membrane antigen,PSMA)和蛋白錯誤折疊循環(huán)擴增(Protein misfolding cyclic amplification,PMCA)時，簡單雙特異性CAR-T細胞才能進行殺傷作用，正常細胞因不會同時存在PSMA和PMCA兩種靶抗原而不被效應(yīng)T細胞攻擊[22]。②異質(zhì)性CAR(inhibitory CAR，iCAR)，是基于調(diào)節(jié)正常T細胞信號的抑制性分子如 CTLA-4、PD-1、BTLA-4、LAG-3或各種各樣的磷酸酶的CAR。iCAR 通常存在于正常細胞，低表達或者不存于腫瘤細胞，所以iCAR能選擇性抑制正常細胞的細胞因子分泌、增殖和毒性擴散，iCAR和另一種特異性CAR共同修飾的效應(yīng)T細胞只會引起腫瘤細胞的殺傷作用，而沉默保護正常細胞[23,24]。③串聯(lián)性CAR(Tandem CAR,TanCAR)，是一種能同時識別細胞表面兩種靶抗原的特異性CAR，因腫瘤細胞表面含有兩種相關(guān)靶抗原，正常細胞不含有或者只含有一種相關(guān)靶抗原，進而TanCAR-T細胞只殺傷腫瘤細胞[25]。

3.5提高CAR-T細胞免疫療效的持續(xù)性 自身免疫系統(tǒng)對CAR-T細胞外源肽的識別和破壞直接縮短了CAR-T細胞的存在時間，效應(yīng)T細胞沒有充足的時間殺傷腫瘤細胞而降低了抗腫瘤療效。提高CAR-T細胞免疫療效的持續(xù)性方案主要有兩種：①通過耗盡機體內(nèi)B細胞防止宿主對外源肽的免疫作用，進而保護CAR-T細胞。②多重受體與細胞因子受體，它們是Wilkie等[26]設(shè)計修飾T細胞的兩種人造受體，一種受體可識別TAA，另一種受體為T細胞提供促進生長的細胞因子信號。如由T1E28z受體和細胞因子受體4αβ 共同修飾的CAR-T細胞作用時，T1E28z 可識別TAA，而細胞因子受體4αβ中的β 鏈亞單位與內(nèi)源性IL-4 、IL-2 和 IL-15 共同結(jié)合，IL-4可誘導(dǎo)IL-2 和 IL-15炎性刺激信號，進而促進CAR-T細胞持續(xù)性作用[27]。

4 提高 CAR-T細胞免疫療效的未來方向

4.1改善腫瘤免疫微環(huán)境 改善腫瘤免疫微環(huán)境可以極大地提高CAR-T細胞免疫療效和降低預(yù)后的不良反應(yīng)，但由于腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性和調(diào)控機制的多樣性，單一療法并不能取得有價值的臨床療效，基于腫瘤免疫微環(huán)境的主要調(diào)控機制，可以結(jié)合以下幾點綜合治療：①阻斷免疫抑制劑途徑，大量數(shù)據(jù)證明加入PD-1免疫抑制途徑的阻斷劑(抗PD-1)后，CAR-T細胞療效因PD-1與 PD-L1/PD-L2的相互作用被抑制而得到極大的提高[28]。②對于免疫抑制細胞，以Tregs細胞為例，CAR-T細胞結(jié)合特異性的共刺激分子(如CD28)可以降低Tregs細胞對腫瘤微環(huán)境的抑制作用[29]。另外，化療和放療可以通過誘導(dǎo)Tregs 細胞凋亡或特異性的去除Tregs而改善免疫抑制，一項研究中發(fā)現(xiàn)以低劑量的環(huán)磷酰胺為基礎(chǔ)的化療可有效清除 Tregs 細胞，達到免疫調(diào)節(jié)作用，聯(lián)合使用其他免疫療法可改善預(yù)后[30]。③細胞因子，TGF-β和IL-10是主要的免疫抑制因子，通過RNAi 技術(shù)等基因工程方法，下調(diào) T 細胞表面 TGF-β 和IL-10受體表達,進而提高CAR-T細胞療效。此外，IL-2、IL-12和IL-15 等活化因子可以促進效應(yīng)T細胞的免疫作用，創(chuàng)造利于 T 細胞存活并發(fā)揮效能的微環(huán)境，通過誘導(dǎo)CAR-T 細胞分泌活化因子進而產(chǎn)生更有效的抗腫瘤作用[31-33]。

4.2CAR-T細胞外泌體的治療 CAR-T細胞分泌的外泌體是一種直徑為30～150 nm的膜性囊泡，外泌體中含有核酸、蛋白和脂類，是細胞間信息交流的重要載體[34]。CAR-T細胞外泌體治療是CAR-T細胞免疫治療的進一步發(fā)展，不僅具有CAR-T細胞高效的抗腫瘤效應(yīng)，還能避免脫靶效應(yīng)和細胞因子風暴等毒性效應(yīng)。實體瘤由于腫瘤微環(huán)境的改變，降低了CAR-T細胞的活性而不能準確定位到腫瘤部位。外泌體是納米級大小、且分布廣泛，可通過各種生物性屏障如血腦屏障[35]。一旦分泌,它可擴散至鄰近細胞或通過血液和其他體液準確定位到腫瘤部位。并且，外泌體包含的不同信息如microRNAs、mRNAs 和蛋白質(zhì)，在細胞間傳遞時可以同時向多個細胞和多個部位傳遞信息[36]，使得外泌體作為“直接攻擊物質(zhì)”時可以迅速通過囊泡內(nèi)容物識別靶細胞表面特異性受體廣泛殺傷腫瘤細胞。此外，除了CAR-T細胞自身分泌的物質(zhì),還可以加入其他物質(zhì)至CAR-T細胞外泌體中,避免腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性。結(jié)合或交替使用 CAR-T細胞療法和CAR-T細胞外泌體療法也許會增強抗腫瘤效應(yīng)。

4.3局部CAR-T細胞治療 CAR-T細胞不能精確歸巢到腫瘤部位(尤其是實體瘤)是影響其抗腫瘤療效的一個主要原因，而在一些惡性腫瘤中，局部性疾病是影響癌癥患者發(fā)生率和死亡率的主要原因，為此直接進行局部治療比系統(tǒng)性治療能取得更有效的結(jié)果。早期Adusumilli等[37]模仿人類胸膜惡性腫瘤構(gòu)建一個原位模型，利用M28zCAR 修飾以間皮素為靶抗原的T細胞，并評估效應(yīng)T細胞在兩種途徑中的療效。他們發(fā)現(xiàn)，CAR-T細胞經(jīng)胸膜腔內(nèi)注射的療效要遠遠超過經(jīng)體液循環(huán)途徑注射的療效，并且只需后者 1/30的M28z T細胞劑量就能誘導(dǎo)長期的完全緩解。此外，胸腹腔內(nèi)注射的CAR-T細胞可擴散至循環(huán)系統(tǒng)和胸腔外區(qū)域的特性使其也能用于轉(zhuǎn)移性腫瘤的治療，例如上皮卵巢癌和惡性胸膜間皮瘤，由于傾向于局部腹膜和胸膜腔內(nèi)擴散應(yīng)給予局部CAR-T細胞治療[37]。

4.4CAR-NK細胞治療 自然殺傷細胞(Natural killer cell,NK) 是具有抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)功能的細胞，CAR-NK細胞免疫治療也越來越多的用于臨床試驗。與CAR-T細胞治療相比，它有三個優(yōu)勢：①CAR-NK細胞的半衰期較短，并且體外擴增的人源性NK細胞分泌的細胞因子譜包括γ干擾素、IL-3和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)等，不同于CAR-T細胞分泌的TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12和IFN-α等炎癥細胞因子，因此CAR-NK細胞輸入不會引起細胞因子風暴。②CAR-NK細胞不會引起移植物抗宿主反應(yīng)(GVHD)[38]。③CAR-NK細胞具有較強的殺傷腫瘤細胞功能，不僅可以通過抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒性作用 (ADCC)途徑，也可以經(jīng)各種非特異性途徑殺傷腫瘤細胞。以CD19、CD20、CD244和 HER2為靶抗原的 CAR-NK92細胞在臨床前試驗中已表現(xiàn)出極強的抗腫瘤效果[39]。但CAR-NK細胞仍存在脫靶效應(yīng)、轉(zhuǎn)染率低等問題，我們尚需優(yōu)化CAR-NK結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)染方法等以制備最佳的免疫細胞。

5 結(jié)語

CAR-T細胞免疫治療是一種發(fā)展前景廣泛的抗腫瘤方法，在臨床應(yīng)用中已獲得一定的療效，但由于腫瘤細胞的異質(zhì)性和腫瘤免疫微環(huán)境的改變，CAR-T細胞療法在大多數(shù)腫瘤的治療中并不能取得理想的結(jié)果，尤其是實體瘤。因此在新一代的CAR-T細胞設(shè)計中，我們必須優(yōu)化設(shè)計方案、構(gòu)建最佳的CAR-T 細胞 、降低毒性效應(yīng)，提高CAR-T細胞治療的安全性和有效性。同時CAR-T細胞外泌體治療、局部CAR-T細胞治療等方法將會是未來CAR-T細胞治療體系中極其重要的部分。相信通過大家的不懈努力，CAR-T細胞療法將會克服各種障礙，成為繼三大常規(guī)腫瘤治療方法的新主流，為腫瘤患者帶來新的希望。

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[收稿2016-11-17 修回2017-01-17]

(編輯 倪 鵬)

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.034

①本文受安徽省科技攻關(guān)項目(1604a0802072)資助。

魯大鵬(1990年-)，男，在讀碩士，主要從事CAR-T細胞與肺癌的相關(guān)性研究，E-mail：742654086@qq.com。

及指導(dǎo)教師：王保龍(1965年-)，男，博士，主任檢驗師，主要從事肺癌方面的研究，E-mail：wbl196555@163.com。

R730.51

A

1000-484X(2017)09-1430-05